Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Deze studie werd gesteund door JDRF subsidies 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-b, en SRA-2-S-2018-648-S-B, een diabetes onderwijs en actie Award, en het Caroline Wiess Law Fund voor onderzoek in moleculaire geneeskunde aan Baylor College of Medicine. Celsortering werd ondersteund door de Cytometrie-en Celsorteerkern op Baylor College of Medicine met financiering van de NIH (S10RR024574 en P30CA125123). Alle peptide-MHC tetramers werden verkregen van de NIH Tetramer core faciliteit.

Muizen werden gehandhaafd onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden bij een transgene muis faciliteit, en alle dier experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen die zijn goedgekeurd door het Baylor College van het geneeskunde Dierenzorg-en gebruiks Comité.
Opmerking: het experiment is vereist voor de voorbereiding van het virus en de T-cellen parallel. Tabel 1 bevat een overzicht van het protocol. De belangrijkste reagentia en buffers staan verme...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de productie van antigeen-specifieke CD8 CAR-T-cellen door retrovirale transductie. De transductie-efficiëntie van ons protocol is meestal hoog en de robuuste uitdrukking van de auto wordt in het algemeen waargenomen. De uitgebreide auto T-cellen behouden de essentiële kenmerken van de ouder geactiveerde T-cellen en de specificiteit van het antilichaam, en zijn geschikt voor zowel in vitro als in vivo gebruik. We hebben AB-CAR CD8 T-cellen toegepast bij het opnieuw p...

Gezien het waarschijnlijke verminderde risico op ongewenste niet-doel effecten, zijn antigeen-specifieke immuuntherapieën (ASI) veelbelovende behandelingen voor auto-immuunziekten zoals T1D. Accumulerend bewijs suggereert dat immuunresponsen op (PrePro) insuline bijzonder belangrijk kan zijn in T1D1. In het afgelopen decennium, studies van meerdere groepen, met inbegrip van onze eigen, sterk suggereren dat de presentatie van een epitoop met insuline B keten aminozuren 9 aan 23 door specifieke MHC klasse II moleculen (B: 9-23/mhcii), speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van T1D in muizen en mensen2,3,4,5. Selectief richten op de B: 9-23/MHCII complex, we genereerden een monoklonaal antilichaam, genaamd mAb287, dat heeft geen kruisreactiviteit aan het hormoon insuline of complexen met andere peptiden6. MAb287 blocks antigeen presentatie in vitro, en wekelijkse toediening van mAb287 aan pre-diabetische NOD muizen vertraagde de ontwikkeling van T1D in 35% van de behandelde muizen6. Om de antigeen-presentatie in vivo te blokkeren, zijn frequente injecties meestal nodig om een hoge circulerende concentratie te behouden. We veronderstelde dat we deze moeilijkheid kunnen overwinnen door gebruik te maken van de hoge specificiteit van Ab287 om T-cellen te herprogrammeren, waardoor een verbeterde antigeen-specifieke T-celtherapie voor T1D7wordt geboden.
Cytotoxische T-cellen worden gerapporteerd om hun doelwit te kunnen doden als zelfs een enkel exemplaar van hun verwant ligand wordt uitgedrukt8,9,10. Dus, B: 9-23/MHCII specifieke CD8 T cellen zullen naar verwachting een hogere efficiëntie hebben bij het elimineren van de ongewenste antigeen presentatie dan het bovenliggende antilichaam, die waarschijnlijk moet binden aan meerdere complexen op dezelfde APC om het effect uit te oefenen. Auto-T-cellen zijn gebruikt voor de behandeling van meerdere menselijke kankers11,12,13, en kan ook werkzaam zijn in auto-immuniteit14. Echter, auto-T cellen met specificiteit voor pathogene peptide-MHC complexen zijn tot nu toe niet gebruikt voor het wijzigen van de progressie van T1D. Door gebruik te maken van de geoptimaliseerde CD8 T celtransductie techniek die hieronder wordt beschreven, hebben we onlangs aangetoond dat dit inderdaad een levensvatbare aanpak is7.
In dit protocol schetsen we een efficiënte en gestroomlijnde transductie en uitbreidingsmethode. Ons protocol is van toepassing op andere studies die de generatie van muis CD8 auto T-cellen met een hoog rendement vereisen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Type 1 diabetes (T1D) wordt gekenmerkt door de eilandje-specifieke auto-immuniteit leidt tot bèta celvernietiging en absoluut verlies van insulineproductie. In het spontane niet-zwaarlijvige diabetes (NOD) muismodel, insuline is het primaire doelwit, en genetische manipulatie van deze dieren te verwijderen van een enkele sleutel insuline epitoop voorkomt ziekte. Dus selectieve eliminatie van professionele antigeen presentatie cellen (apc's) die deze pathogene epitoop dragen, is een benadering om de ongewenste insuline-specifieke auto-immuunresponsen te remmen en heeft waarschijnlijk een groter translationeel potentieel.
Chimeric antigeen receptoren (Auto's) kunnen T cellen omleiden naar selectief richten op ziekteveroorzakende antigenen. Deze techniek is van fundamenteel belang voor recente pogingen om cellulaire techniek te gebruiken voor adoptie van celtherapie om meerdere kankers te behandelen. In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde T-Cell retrovirus (RV) transductie en in-vitro uitbreidings protocol dat hoge aantallen functionele antigeen-specifieke CD8 CAR-T cellen genereert, beginnend bij een laag aantal naïeve cellen. Eerder werden meerdere auto-T-celprotocollen beschreven, maar meestal met relatief lage transductie-efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen na transductie. Ons protocol biedt daarentegen tot 90% transductie-efficiëntie en de gegenereerde cellen kunnen meer dan twee weken in vivo overleven en het begin van de ziekte significant vertragen na een enkelvoudige infusie. We geven een gedetailleerde beschrijving van het celonderhoud en het transductie protocol, zodat de kritische stappen gemakkelijk kunnen worden opgevolgd. De hele procedure van het isoleren van de primaire cel tot de auto-expressie kan binnen 14 dagen worden uitgevoerd. De algemene methode kan worden toegepast op elke muis ziekte model waarin het doel bekend is. Evenzo is de specifieke toepassing (gericht op een pathogene peptide/MHC klasse II complex) van toepassing op elk ander auto-immuunziekte model waarvoor een sleutel complex is geïdentificeerd.

Meestal is de transductie-efficiëntie met behulp van dit protocol ~ 60-90%. In het experiment getoond in Figuur 3, voorafgaand aan het sorteren van ongeveer, 70% van de CD8 T cellen co-uitgedrukt GFP. Ze hebben ook CD28 en CD3 (figuur 3c) uitgedrukt. Belangrijk is dat alle "test" GFP+ -cellen ook samen met IAG7-b:R3-tetramers worden gekleurd, maar niet met de Control tetrameer (Figuur 4...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Dit protocol stelt u in staat om een groot aantal functionele antigeen-specifieke T-cellen te genereren die een gewenste veilige benadering zijn bij de behandeling van auto-immuunziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het u voorziet van een zeer efficiënt transductieproces en een groot aantal functionele T-cellen. Deze techniek kan worden uitgebreid voor de behandeling van diabetes type 1 en andere auto-immuunziekten waarbij antigenen bekend zijn.Bovendien kunnen CAR T-cellen een veelbelovende behandeling zijn voor bepaalde vormen van kanker. Deze methode kan worden gebruikt om immuuncellen te genereren die andere CARs uitdrukken. Het is belangrijk om een goede geaccepteerde techniek te hebben, het hele protocol te lezen en het hele experiment van tevoren te plannen.Dit twee weken lange protocol bevat mini-stappen en succes is afhankelijk van de juiste prestaties van elke stap. Visuele demonstraties van deze methode is van cruciaal belang voor leerlingen om correct te volgen. Bereid Phoenix cellen voor op transfectie zoals beschreven in het manuscript.Het is een goede gewoonte om de zijwand te markeren waar medium zal worden toegevoegd en verwijderd om het afblazen van cellen te minimaliseren. Op dag nul aspirate de supernatant uit de cellen en was ze met vijf milliliter PBS. Voeg voorzichtig zeven milliliter verlaagd serum medium dropwise toe aan de zijwand van de plaat en breng de cellen terug naar de couveuse.Voeg 1,5 milliliter verlaagd serummedium toe aan twee 14 millimeter ronde polypropyleenbuizen. Voeg 40 micrometer transfectiereagens toe aan een van de buizen en 15 microgram antilichaam omgeleid CAR plasmid samen met vijf microgram verpakkingsplasmid aan de andere. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten en voeg vervolgens transfectie reagens aan de plasmid buis.Meng door de oplossing drie keer voorzichtig op en neer te spuiten en deze minstens 20 minuten op kamertemperatuur uit te broeden. Voeg drie milliliter van het mengsel toe aan de Phoenix cellen en plaats ze in een weefselkweek incubator. Na vier tot vijf uur voeg een milliliter fcs aan de cellen en cultuur ze 's nachts op 37 graden Celsius.Op de volgende dag, verwijder de supernatant uit de cellen en voeg vier milliliter van verse voorverwarmde cultuur medium. Oogst het virus op dag twee door het virus met medium uit de Phoenix-cellen te verzamelen en te filteren om restcelpuin te verwijderen. Voeg recombinant menselijke IL-2 voorraad aan het virus voor een definitieve concentratie van 200 internationale eenheden per milliliter en gebruik het onmiddellijk voor transductie.Voeg vier milliliter vers medium toe aan de Phoenix cellen en plaats ze 's nachts in de couveuse. Herhaal het virus verzamelen op de volgende dag voor een tweede transductie en gooi de cellen. Een dag voorafgaand aan het zaaien murine CD8 T cellen, voeg een milliliter van een mengsel van anti-muis CD3 en CD28 antilichamen aan elke put van een 24 put plaat en broeden de plaat 's nachts op vier graden Celsius.Op dag nul, oogst muis milt en zet ze op een cel zeef weken in 10 milliliter PBS in een cel cultuur schotel op ijs. In een cel cultuur kap, snijd elke milt in drie tot vijf stukken en gebruik een steriele zuiger van een spuit om het weefsel te persen door het gaas. Verwijder voorzichtig rode bloedcellen door splenocyten in één tot vier verdunde rode cellysebuffers voorzichtig te verwijderen en ze vijf minuten lang bij kamertemperatuur uit te broeden en vervolgens 10 microliter van de celsuspensie met Trypan Blue te verdunnen voor het tellen van cellen.En pellet de rest van de cellen door centrifugeren op 350 keer g gedurende zeven minuten. Gebruik een muis CD8 T cel isolatie kit om CD8 T cellen te verrijken en de cel pellets op te schorten in 400 microliter buffer met 100 microliters van biotine antilichaam cocktail per een keer 10 tot de achtste cellen. Meng de cel suspensie goed en uitbroed het gedurende vijf minuten op vier graden Celsius om antilichaam binding mogelijk te maken.Voeg vervolgens 300 microliter labelbuffer en 200 microliter anti-biotine microbeads per één keer 10 toe aan de achtste cellen. Meng goed en incubeer voor nog eens 10 minuten op vier graden Celsius. Zet ondertussen een scheidingskolom op de scheidingskosator en was deze met drie milliliter labelbuffer.Leg een 40 micrometer celzeef op de bovenkant van een kolom en passeer een milliliter van de kraal en de cel mengsel door de zeef in de scheidingkolom. Verzamel de stroom door in een gepekwichte 15 milliliter buis en was de kolom volgens de aanwijzingen van de fabrikant, het verzamelen van afvalwater in dezelfde buis. Tel de cellen en verzamel ze door centrifugatie op 350 keer g gedurende vijf minuten.Was ze met twee milliliter T-cel medium en centrifuge weer. Dan resuspend ze in voorverwarmde T-cel medium met een concentratie van 250, 000 tot 500.000 cellen per milliliter. Was de eerder bereide CD3- en CD28-gecoate platen met één milliliter steriele PBS drie keer en voeg twee milliliter van de celsuspensie toe aan elke put.Gebruik een wervelende beweging om cellen gelijkmatig af te zien. Als een controle, plaat hetzelfde aantal CD8 T cellen in een enkele niet-gecoate put van de plaat en de cellen incubeerpen op 37 graden Celsius in een 10% kooldioxide gastank incubator voor 48 uur. Op dag één, bereid menselijke fibronectin fragment gecoate platen door het toevoegen van 0,5 milliliter fibronectin aan de putten van een 24-put plaat en uitbroeden het 's nachts op vier graden Celsius.Op de volgende dag, verwijder de fibronectin oplossing en voeg een milliliter van 2%BSA en PBS per goed. Incubeer de plaat 30 minuten op kamertemperatuur en was de behandelde putten met één milliliter steriele PBS. De plaat is klaar voor gebruik na het verwijderen van wasoplossing.Tel de geactiveerde CD8 T-cellen met Trypan Blue. Verzamel ze door centrifugatie. En resuspend ze op vijf miljoen levensvatbare cellen per milliliter voor transductie.Voeg 100 microliter van de geactiveerde CD8 celsuspensie toe aan elke put van de fibronectin gecoate plaat. Voeg vervolgens 1,5 tot twee milliliter van het eerder voorbereide virus met medium toe en meng met behulp van een wervelende beweging om de cellen gelijkmatig af te geven. Sluit de plaat af in een Ziploc zak en verklein hem op 2.000 keer g gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius.Haal de plaat uit de centrifuge en breng deze naar een biologische veiligheidskast. Verwijder de plastic zak voorzichtig en zorg ervoor dat de buitenkant van de plaat niet verontreinigd is met medium. Breng de plaat naar een 37 graden Celsius koolstofdioxide incubator.Na vier uur, verwijder een milliliter medium uit elke put, vervang het door een milliliter van voorverwarmd compleet T-celmedium en zet de plaat terug in de couveuse. De kritieke aspecten van dit protocol zijn een hoog titervirus, gezonde geactiveerde T-cellen en de juiste transductiemethode. Cellen werden mede-gekleurd met PE maat zeven geconjugeerde anti-CD8, AF647 geconjugeerde anti-CD3, en BV 421 geconjugeerde anti-CD28 voor flow cytometrische analyse.Ongeveer 70% van de CD8 T-cellen co-uitgedrukte GFP die CAR-expressie aangeeft. Ze hebben ook co-uitgedrukt CD28 en CD3. Belangrijk is dat alle van de test GFP positieve cellen ook mede-gekleurd met I-Ag7 insuline BR3 tetramers die expressie van CAR op het celoppervlak aangeeft, maar niet met de controle tetramer.Bovendien, de gesorteerde test en controle CAR T cellen elk uitgescheiden hoge niveaus van interferon gamma pas na cocultuur met doelcellen uitdrukken van hun cognate liganden die bevestigt dat de getransduceerde cellen hebben een CD8 effector T cel fenotype gericht op het doel van de ouder antilichamen. Transductie van virusproducercellen, isolatie van primaire CD8 T-cellen en activering van deze T-cellen zijn de belangrijkste stappen van dit experiment. Het hebben van gezonde geactiveerde T-cellen en transductie van deze T-cellen met de juiste reagentia zorgt voor gunstige resultaten.Deze methode kan worden gebruikt om andere T-cellen te transduceren, maar moet worden aangepast voor het specifieke T-celtype. Dit protocol maakt de weg vrij voor de preventie van diabetes type 1 met antigeenspecifieke chimerische antigeenreceptor T-celtherapie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial antigeen presenterende cellen (KaAPC) voor Efficient<em&gt; In Vitro</em&gt; Uitputting van Human Antigeen-specifieke T-cellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay voor detectie van antigeen-specifieke T-cel cytolytische functie met behulp van een vaccinatie-Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...