Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par les subventions de la FRDJ 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, et SRA-2-S-2018-648-S-B, un Prix d'éducation et d'action sur le diabète, et le Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en médecine moléculaire au Baylor College of Medicine. Le tri cellulaire a été appuyé par le Cytometry and Cell Sorting Core du Baylor College of Medicine grâce à un financement des NIH (S10RR024574 et P30CA125123). Tous les tétratiers peptidiques-MHC ont été obtenus à partir de l'installation de base de Tetramer des NIH.

Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes dans un établissement de souris transgéniques, et toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Baylor College of Medicine.
REMARQUE : L'expérience nécessite la préparation du virus et des lymphocytes T en parallèle. Le tableau 1 résume le protocole. Les réactif...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode efficace pour produire des cellules CD8 CAR-T spécifiques à l'antigène par transduction rétrovirale. L'efficacité de la transduction de notre protocole est généralement élevée, et l'expression robuste de la RCA est généralement observée. Les lymphocytes T CAR élargis conservent les caractéristiques essentielles des lymphocytes T activés par les parents, et la spécificité des anticorps, et conviennent à l'utilisation in vitro et in vivo. Nous avons appliqué des lymphocy...

Étant donné le risque probablement réduit d'effets non désirés hors cible, les thérapies immunitaires spécifiques aux antigènes (ASI) sont des traitements prometteurs pour les maladies auto-immunes telles que le DT1. L'accumulation de preuves suggère que les réponses immunitaires à l'insuline (prépro) peuvent être particulièrement importantes dans le DT11. Au cours de la dernière décennie, des études de plusieurs groupes, y compris le nôtre, suggèrent fortement que la présentation d'un épitope contenant des acides aminés de la chaîne de l'insuline B 9 à 23 par des molécules spécifiques de classe II du MHC (B:9-23/MHCII), joue un rôle important dans le développement du DT1 souris et les humains2,3,4,5. Pour cibler sélectivement le complexe B:9-23/MHCII, nous avons généré un anticorps monoclonal, nommé mAb287, qui n'a aucune réactivité croisée à l'insuline hormonale ou aux complexes contenant d'autres peptides6. MAb287 bloque la présentation d'antigène in vitro, et l'administration hebdomadaire de mAb287 aux souris prédiabétiques de NOD a retardé le développement du T1D dans 35% des souris traitées6. Pour bloquer la présentation d'antigène in vivo, des injections fréquentes sont généralement nécessaires afin de maintenir une concentration circulante élevée. Nous avons émis l'hypothèse que nous pourrions surmonter cette difficulté en profitant de la grande spécificité d'Ab287 pourreprogrammer les lymphocytes T, fournissant ainsi une thérapie à cellule T spécifique à l'antigène améliorée pour le DT7 .
Les lymphocytes T cytotoxiques seraient capables de tuer leur cible si même une seule copie de leur ligand cognate est exprimée8,9,10. Ainsi, on s'attend à ce que les lymphocytes T CD8 spécifiques B:9-23/MHCII aient une plus grande efficacité en éliminant la présentation indésirable d'antigène que l'anticorps parent, qui devra probablement se lier à plusieurs complexes sur le même APC pour exercer son effet. Les cellules T de CAR ont été employées pour traiter les cancers humains multiples11,12,13,et peuvent également être efficaces dans l'autoimmunité14. Cependant, les cellules CAR-T avec la spécificité pour les complexes pathogènes peptide-MHC n'ont pas été jusqu'ici employées pour modifier la progression du DT1. En utilisant la technique optimisée de transduction de cellules T CD8 décrite ci-dessous, nous avons récemment démontré la preuve de principe que cela représente en effet une approche viable7.
Dans ce protocole, nous dénoncions une méthode de transduction et d'expansion efficace et rationalisée. Notre protocole s'applique à d'autres études nécessitant la génération de cellules T CD8 CAR de souris à haut rendement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Le diabète de type 1 (T1D) est caractérisé par une auto-immunité spécifique aux islets entraînant la destruction des cellules bêta et la perte absolue de production d'insuline. Dans le modèle spontané de souris de diabète non-obèse (NOD), l'insuline est la cible primaire, et la manipulation génétique de ces animaux pour enlever un épitope d'insuline clé simple empêche la maladie. Ainsi, l'élimination sélective des cellules professionnelles de présentation d'antigène (APC) portant cet épitope pathogène est une approche pour inhiber les réponses autoimmunes insulino-spécifiques non désirées, et a probablement un plus grand potentiel translationnel.
Les récepteurs d'antigènes chimériques (RAC) peuvent rediriger les lymphocytes T vers des antigènes pathogènes de manière sélective. Cette technique est fondamentale pour les tentatives récentes d'utiliser l'ingénierie cellulaire pour la thérapie cellulaire adoptive pour traiter les cancers multiples. Dans ce protocole, nous décrivons un protocole optimisé de rétrovirus à cellule T (RV) et de transduction in vitro qui génère un grand nombre de cellules CD8 CAR-T fonctionnelles spécifiques à l'antigène à partir d'un faible nombre de cellules naïves. Auparavant, plusieurs protocoles de cellules CAR-T ont été décrits, mais généralement avec une efficacité de transduction relativement faible et la viabilité cellulaire après la transduction. En revanche, notre protocole fournit jusqu'à 90% d'efficacité de transduction, et les cellules générées peuvent survivre plus de deux semaines in vivo et retarder considérablement l'début de la maladie à la suite d'une seule perfusion. Nous fournissons une description détaillée du protocole d'entretien et de transduction des cellules, de sorte que les étapes critiques peuvent être facilement suivies. L'ensemble de la procédure de l'isolement cellulaire primaire à l'expression de la RCA peut être effectuée dans les 14 jours. La méthode générale peut être appliquée à n'importe quel modèle de maladie de souris dans lequel la cible est connue. De même, l'application spécifique (ciblant un complexe pathogène de classe II peptide/MHC) s'applique à tout autre modèle de maladie auto-immune pour lequel un complexe clé a été identifié.

En règle générale, l'efficacité de la transduction à l'aide de ce protocole est de 60-90%. Dans l'expérience montrée dans la figure 3, avant le tri d'environ, 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le PFG. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3 (figure 3C). Fait important, toutes les cellules « test » De GFPsont également tachées de tétragraphes IAg7-B:R3, mais pas avec le tétramère de ...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Cet article décrit un protocole pour la génération des cellules T CD8 antigène-spécifiques, et leur expansion in vitro, dans le but de produire un nombre élevé de lymphocytes T fonctionnels pour une utilisation in vitro et in vivo.

Génération à haut rendement de cellules T cytotoxiques cytotoxiques de souris primaires spécifiques à l'antigène pour les tests fonctionnels dans un modèle de diabète auto-immun

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Ce protocole vous permet de générer un grand nombre de cellules T fonctionnelles spécifiques aux antigènes qui sont une approche sûre souhaitée dans le traitement des maladies auto-immunes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous fournit un processus de transduction très efficace et un grand nombre de cellules T fonctionnelles. Cette technique peut être étendue pour traiter le diabète de type 1 et d’autres maladies auto-immunes dans lesquelles les antigènes sont connus.En outre, les cellules T car peuvent être un traitement prometteur pour certains types de cancer. Cette méthode peut être utilisée pour générer des cellules immunitaires exprimant d’autres CRC. Il est important d’avoir une bonne technique acceptée, de lire l’ensemble du protocole et de planifier toute l’expérience à l’avance.Ce protocole de deux semaines comprend des mini-étapes et le succès dépend de la bonne performance de chaque étape. Les démonstrations visuelles de cette méthode sont essentielles pour que les apprenants suivent correctement. Préparer les cellules phoenix à la transfection telles que décrites dans le manuscrit.Il est de bonne pratique de marquer la paroi latérale où le milieu sera ajouté et enlevé pour minimiser le soufflage des cellules. Le jour zéro aspirer le surnatant des cellules et les laver avec cinq millilitres de PBS. Ajouter délicatement sept millilitres de sérum réduit moyen dropwise à la paroi latérale de la plaque et transférer les cellules de retour à l’incubateur.Ajouter 1,5 millilitres de sérum réduit moyen à deux tubes de polypropylène rond de 14 millimètres. Ajouter 40 micromètres de réaccente de transfection à l’un des tubes et 15 microgrammes de plasmide CAR redirigé par anticorps ainsi que cinq microgrammes de plasmide d’emballage à l’autre. Incuber les tubes à température ambiante pendant cinq minutes, puis ajouter le réaccente de transfection au tube plasmide.Mélanger en pipetant doucement la solution de haut en bas trois fois et l’incuber à température ambiante pendant au moins 20 minutes. Ajouter trois millilitres du mélange aux cellules Phoenix et les placer dans un incubateur de culture tissulaire. Après quatre à cinq heures ajouter un millilitre de FCS aux cellules et les culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, retirer le surnatant des cellules et ajouter quatre millilitres de milieu de culture frais préchauré. Récoltez le virus le deuxième jour en recueillant le virus contenant du milieu des cellules Phoenix et en le filtrant pour éliminer les débris cellulaires résiduels. Ajoutez du stock humain recombinant IL-2 au virus pour une concentration finale de 200 unités internationales par millilitre et utilisez-le immédiatement pour la transduction.Ajouter quatre millilitres de milieu frais aux cellules Phoenix et les placer dans l’incubateur pendant la nuit. Répétez la collecte du virus le lendemain pour une deuxième transduction et jetez les cellules. Un jour avant l’ensemencement des lymphocytes T CD8 murins, ajouter un millilitre d’un mélange d’anticorps anti-souris CD3 et CD28 à chaque puits d’une plaque de puits de 24 et incuber la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le jour zéro, récoltez la rate de souris et mettez-les sur une passoire cellulaire trempant dans 10 millilitres de PBS dans un plat de culture cellulaire sur la glace. Dans un capot de culture cellulaire, couper chaque rate en trois à cinq morceaux et utiliser un piston stérile d’une seringue pour presser le tissu à travers le maillage métallique. Retirez doucement les globules rouges en réutilisant les splenocytes dans un à quatre tampons dilués de lyse de globule rouge et en les incubant à température ambiante pendant cinq minutes, puis diluez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec Trypan Blue pour le comptage cellulaire.Et pelleter le reste des cellules en centrifugant à 350 fois g pendant sept minutes. Utilisez un kit d’isolation des lymphocytes T CD8 de souris pour enrichir les lymphocytes T CD8 et suspendre les granulés cellulaires dans 400 microlitres de tampon avec 100 microlitres de cocktail d’anticorps biotine par une fois 10 à la huitième cellule. Bien mélanger la suspension cellulaire et l’incuber pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison anticorps.Ajoutez ensuite 300 microlitres de tampon d’étiquetage et 200 microlitres de microbilles anti-biotine par une fois 10 aux huitièmes cellules. Bien mélanger et incuber encore 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant ce temps, installez une colonne de séparation sur le séparateur et lavez-la avec trois millilitres de tampon d’étiquetage.Placez une passoire à cellules de 40 micromètres sur le dessus d’une colonne et passez un millilitre du mélange de perles et de cellules à travers la passoire dans la colonne de séparation. Recueillir le flux à travers dans un tube préchilled de 15 millilitres et laver la colonne selon les instructions du fabricant, la collecte des effluents dans le même tube. Comptez les cellules et recueillez-les par centrifugation à 350 fois g pendant cinq minutes.Lavez-les avec deux millilitres de milieu de cellule T et centrifugeuse à nouveau. Puis les résuspendez dans le milieu préchauré des cellules T à une concentration de 250 000 à 500 000 cellules par millilitre. Lavez trois fois les plaques enduites d’anticorps CD3 et CD28 précédemment préparées avec un millilitre de PBS stérile et ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire à chaque puits.Utilisez un mouvement tourbillonnant pour distribuer les cellules uniformément. En tant que contrôle, plaquez le même nombre de lymphocytes T CD8 dans un seul puits non enduit de la plaque et incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de réservoir de gaz à dioxyde de carbone de 10 % pendant 48 heures. Le premier jour, préparez des plaques enduites de fragments de fibronectine humaine en ajoutant 0,5 millilitres de fibronectine aux puits d’une plaque de 24 puits et en l’incubant pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, retirez la solution de fibronectine et ajoutez un millilitre de 2%BSA et PBS par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes et laver les puits traités avec un millilitre de PBS stérile. La plaque est prête à l’emploi après avoir enlevé la solution de lavage.Comptez les lymphocytes T CD8 activés à l’aide de Trypan Blue. Collectez-les par centrifugation. Et les résuspendez à cinq millions de cellules viables par millilitre pour la transduction.Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire CD8 activée à chaque puits de la plaque enduite de fibronectine. Ajoutez ensuite 1,5 à deux millilitres du virus précédemment préparé contenant du milieu et mélangez à l’aide d’un mouvement tourbillonnant pour distribuer uniformément les cellules. Sceller la plaque dans un sac Ziploc et la centrifuger à 2000 fois g pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius.Retirez la plaque de la centrifugeuse et emmenez-la dans une armoire de sécurité biologique. Retirez soigneusement le sac en plastique et assurez-vous que l’extérieur de la plaque n’est pas contaminé par un milieu. Transférer la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius.Après quatre heures, retirer un millilitre de milieu de chaque puits, le remplacer par un millilitre de milieu de cellule T complet préchauffé et remettre la plaque dans l’incubateur. Les aspects critiques de ce protocole sont un virus de titer élevé, des cellules T activées saines, et la méthode appropriée de transduction. Les cellules ont été co-tachées avec pe taille sept anti-CD8 conjugués, AF647 conjugué anti-CD3, et BV 421 conjugué anti-CD28 pour l’analyse cytométrique de flux.Environ 70 % des lymphocytes T CD8 ont co-exprimé le GFP, ce qui indique l’expression de la RCA. Ils ont également co-exprimé CD28 et CD3. Fait important, toutes les cellules positives GFP d’essai ont également co-taché avec des tétramers BR3 d’insuline I-Ag7 qui indique l’expression de la RCA sur la surface de cellules mais pas avec le tétramer de contrôle.En outre, les cellules T d’essai et de contrôle triées de CAR ont chacune sécrété des niveaux élevés d’interféron gamma seulement après coculture avec les cellules cibles exprimant leurs ligands cognate qui confirme que les cellules transduced ont un phénotype de cellule T effecteur CD8 dirigé vers la cible des anticorps parentaux. La transduction des cellules productrices de virus, l’isolement des lymphocytes T CD8 primaires et l’activation de ces lymphocytes T sont les étapes les plus importantes de cette expérience. Avoir des cellules T activées saines et la transduction de ces cellules T avec des reagents appropriés assure des résultats favorables.Cette méthode peut être utilisée pour transduire d’autres cellules T, mais elle doit être personnalisée pour le type spécifique de cellule T. Ce protocole ouvre la voie à la prévention du diabète de type 1 avec la thérapie chimène spécifique aux cellules T des récepteurs antigènes chimériques.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

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