Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt durch JDRF-Stipendien 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B und SRA-2-S-2018-648-S-B, einen Diabetes Education and Action Award, und den Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine am Baylor College of Medicine. Die Zellsortierung wurde vom Cytometrie- und Zellsortierungskern am Baylor College of Medicine mit Mitteln des NIH (S10RR024574 und P30CA125123) unterstützt. Alle Peptid-MHC-Tetramere wurden aus der NIH Tetramer Core Facility gewonnen.

Mäuse wurden in einer Transgenen-Maus-Anlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen durchgeführt.
HINWEIS: Das Experiment erfordert die parallele Vorbereitung des Virus und der T-Zellen. Tabelle 1 fasst das Protokoll zusammen. Die wichtigsten Reagenzien und Puffer sind in der Tabelle der Materialienauf...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Herstellung antigenspezifischer CD8 CAR-T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Die Transduktionseffizienz unseres Protokolls ist in der Regel hoch, und eine robuste Expression der CAR wird im Allgemeinen beobachtet. Die erweiterten CAR-T-Zellen behalten die wesentlichen Merkmale der elternaktivierten T-Zellen und die Antikörperspezifität bei und sind sowohl für den In-vitro- als auch für den In-vivo-Einsatz geeignet. Wir haben Ab-CAR CD8 T-Zellen bei der Neupr...

Angesichts des wahrscheinlich reduzierten Risikos unerwünschter Off-Target-Effekte sind antigenspezifische Immuntherapien (ASI) vielversprechende Behandlungen für Autoimmunerkrankungen wie T1D. Anhäufende Hinweise deuten darauf hin, dass Immunantworten auf (Prepro)Insulin bei T1D1besonders wichtig sein können. In den letzten zehn Jahren deuten Studien aus mehreren Gruppen, einschließlich unserer eigenen, stark darauf hin, dass die Darstellung eines Epitops, das Insulin-B-Kettenaminosäuren 9 bis 23 durch spezifische MHC-Klasse-II-Moleküle (B:9-23/MHCII) enthält, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von T1D bei Mäuse und Menschen2,3,4,5. Um den B:9-23/MHCII-Komplex gezielt ins Visier zu nehmen, haben wir einen monoklonalen Antikörper namens mAb287 entwickelt, der keine Kreuzreaktivität gegenüber dem Hormon Insulin oder Komplexen hat, die andere Peptide enthalten6. MAb287 blockiert die Antigen-Präsentation in vitro und die wöchentliche Verabreichung von mAb287 an prädiabetische NOD-Mäuse verzögerte die Entwicklung von T1D bei 35% der behandelten Mäuse6. Um die Antigen-Präsentation in vivo zu blockieren, sind in der Regel häufige Injektionen erforderlich, um eine hohe zirkulierende Konzentration aufrechtzuerhalten. Wir vermuteten, dass wir diese Schwierigkeit überwinden könnten, indem wir die hohe Spezifität von Ab287 nutzen, um T-Zellen neu zu programmieren, wodurch eine verbesserte antigenspezifische T-Zell-Therapie für T1D7zur Verfügung gestellt wird.
Zytotoxische T-Zellen sollen ihr Ziel töten können, wenn sogar eine einzigeKopie ihres Cognate-Ligands 8,9,10ausgedrückt wird. Daher wird erwartet, dass B:9-23/MHCII-spezifische CD8-T-Zellen eine höhere Effizienz bei der Beseitigung der unerwünschten Antigen-Präsentation aufweisen als der mutterliche Antikörper, der wahrscheinlich an mehrere Komplexe auf demselben APC binden muss, um seine Wirkung auszuüben. CAR T-Zellen wurden zur Behandlung mehrerer menschlicher Krebsarten11,12,13, und kann auch wirksam in Autoimmunität14sein. Car-T-Zellen mit Spezifität für pathogene Peptid-MHC-Komplexe wurden jedoch bisher nicht verwendet, um das Fortschreiten von T1D zu verändern. Mit der unten beschriebenen optimierten CD8 T-Zelltransduktionstechnik haben wir vor kurzem den Grundsatz beweisnachweis erbracht, dass dies tatsächlich einen praktikablen Ansatz darstellt7.
In diesem Protokoll skizzieren wir eine effiziente und schlanke Transduktions- und Expansionsmethode. Unser Protokoll gilt für andere Studien, die die Erzeugung von Maus-CD8 CAR T-Zellen mit hoher Effizienz erfordern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Typ-1-Diabetes (T1D) zeichnet sich durch eine isletspezifische Autoimmunität aus, die zur Betazellzerstörung und zum absoluten Verlust der Insulinproduktion führt. Im spontanen nicht-fettleibigen Diabetes -Mausmodell ist Insulin das primäre Ziel, und die genetische Manipulation dieser Tiere zur Entfernung eines einzigen Schlüsselinsulinepitops verhindert Krankheiten. Daher ist die selektive Eliminierung professioneller Antigen-präsentierender Zellen (APCs), die dieses pathogene Epitop tragen, ein Ansatz, um die unerwünschten insulinspezifischen Autoimmunreaktionen zu hemmen, und hat wahrscheinlich ein größeres translationales Potenzial.
Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) können T-Zellen selektiv auf krankheitserregende Antigene umleiten. Diese Technik ist von grundlegender Bedeutung für die jüngsten Versuche, Zelltechnik für die Adoptivzelltherapie zur Behandlung mehrerer Krebsarten zu verwenden. In diesem Protokoll beschreiben wir ein optimiertes T-Zell-Retrovirus (RV)-Transduktions- und In-vitro-Erweiterungsprotokoll, das eine hohe Anzahl funktioneller antigenspezifischer CD8-CAR-T-Zellen aus einer geringen Anzahl naiver Zellen erzeugt. Zuvor wurden mehrere CAR-T-Zellprotokolle beschrieben, in der Regel jedoch mit relativ geringer Transduktionseffizienz und Zelllebensfähigkeit nach Derduktion. Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine Transduktionseffizienz von bis zu 90 %, und die erzeugten Zellen können mehr als zwei Wochen in vivo überleben und den Krankheitsbeginn nach einer einzigen Infusion erheblich verzögern. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung des Zellwartungs- und Transduktionsprotokolls, so dass die kritischen Schritte leicht befolgt werden können. Die gesamte Prozedur von der primären Zellisolation bis zum CAR-Ausdruck kann innerhalb von 14 Tagen durchgeführt werden. Die allgemeine Methode kann auf jedes Mauskrankheitsmodell angewendet werden, in dem das Ziel bekannt ist. In ähnlicher Weise ist die spezifische Anwendung (die auf einen pathogenen Peptid/MHC-Klasse-II-Komplex abzielt) auf jedes andere Modell von Autoimmunerkrankungen anwendbar, für das ein Schlüsselkomplex identifiziert wurde.

In der Regel beträgt die Transduktionseffizienz, die dieses Protokoll verwendet, 60-90 %. In dem in Abbildung 3gezeigten Experiment exprimierten vor der Sortierung etwa 70 % der CD8-T-Zellen gfP. Sie drückten auch CD28 und CD3 (Abbildung3C) aus. Wichtig ist, dass alle "Test" GFP+ Zellen auch mit IAg7-B:R3 Tetrameren ko-gefärbt werden, aber nicht mit dem Kontrolltetramer (Abbildung 4</...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, eine große Anzahl von funktionellen antigenspezifischen T-Zellen zu generieren, die ein gewünschter sicherer Ansatz bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie Ihnen einen hocheffizienten Transduktionsprozess und eine große Anzahl funktioneller T-Zellen bietet. Diese Technik kann erweitert werden, um Typ-1-Diabetes und andere Autoimmunerkrankungen zu behandeln, bei denen Antigene bekannt sind.Darüber hinaus können CAR-T-Zellen eine vielversprechende Behandlung für bestimmte Krebsarten sein. Diese Methode kann verwendet werden, um Immunzellen zu erzeugen, die andere CARs exemitzen. Es ist wichtig, eine gute akzeptierte Technik zu haben, das gesamte Protokoll zu lesen und das gesamte Experiment im Voraus zu planen.Dieses zweiwöchige Protokoll enthält Minischritte und der Erfolg hängt von der ordnungsgemäßen Leistung jedes Schritts ab. Visuelle Demonstrationen dieser Methode sind für die korrekte Befolgung der Lernenden von entscheidender Bedeutung. Bereiten Sie Phoenix-Zellen für die Transfektion vor, wie im Manuskript beschrieben.Es ist eine gute Praxis, die Seitenwand zu markieren, wo Medium hinzugefügt und entfernt wird, um das Abblasen von Zellen zu minimieren. Am Tag Null den Überstand aus den Zellen aspirieren und mit fünf Millilitern PBS waschen. Sieben Milliliter reduziertes Serum mittels Tropfen an die Seitenwand der Platte geben und die Zellen zurück in den Inkubator übertragen.Fügen Sie 1,5 Milliliter reduziertes Serummedium zu zwei 14 Millimeter runden unteren Polypropylen-Rohren hinzu. Fügen Sie 40 Mikrometer Transfektionsreagenz in eines der Röhrchen und 15 Mikrogramm Antikörper umgeleitet CAR Plasmid zusammen mit fünf Mikrogramm Verpackung Plasmid auf die andere. Inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für fünf Minuten und fügen Sie dann Transfektionsreagenz in das Plasmidrohr.Mischen Sie die Lösung, indem Sie sie dreimal nach oben und unten pfeifen, und bebrüten Sie sie bei Raumtemperatur für mindestens 20 Minuten. Fügen Sie drei Milliliter der Mischung zu den Phoenix-Zellen hinzu und legen Sie sie in einen Gewebekultur-Inkubator. Nach vier bis fünf Stunden einen Milliliter FCS in die Zellen geben und sie über Nacht bei 37 Grad Celsius kulturieren.Am nächsten Tag den Überstand aus den Zellen entfernen und vier Milliliter frisches vorgewärmtes Kulturmedium hinzufügen. Ernten Sie das Virus am zweiten Tag, indem Sie das Virus, das Medium enthält, aus den Phoenix-Zellen sammeln und filtern, um Restzellablagerungen zu entfernen. Fügen Sie dem Virus rekombinanten menschlichen IL-2-Bestand für eine Endkonzentration von 200 internationalen Einheiten pro Milliliter hinzu und verwenden Sie es sofort für die Transduktion.Fügen Sie vier Milliliter frisches Medium zu den Phoenix-Zellen hinzu und legen Sie sie über Nacht in den Inkubator. Wiederholen Sie die Virussammlung am nächsten Tag für eine zweite Transduktion und entsorgen Sie die Zellen. Einen Tag vor dem Aussaat murine CD8 T-Zellen, fügen Sie einen Milliliter einer Mischung aus Anti-Maus-CD3 und CD28-Antikörper n.Äns-Körper einer 24-Well-Platte hinzu und brüten die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius.Am Tag Null, Ernten Maus Milz und legen Sie sie auf einem Zellsieb einweichen in 10 Milliliter PBS in einer Zellkulturschale auf Eis. Schneiden Sie in einer Zellkulturhaube jede Milz in drei bis fünf Teile und drücken Sie das Gewebe mit einem sterilen Kolben einer Spritze durch das Drahtgeflecht. Entfernen Sie vorsichtig rote Blutkörperchen, indem Sie Splenozyten in einem bis vier verdünnten Red-Zell-Lysepuffer wieder aufhängen und sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren und dann 10 Mikroliter der Zellsuspension mit Trypan Blue für die Zellzählung verdünnen.Und pellet den Rest der Zellen durch Zentrifugieren bei 350 mal g für sieben Minuten. Verwenden Sie ein Maus-CD8-T-Zell-Isolationskit, um CD8-T-Zellen anzureichern und die Zellpellets in 400 Mikroliter Puffer mit 100 Mikroliter Biotin-Antikörper-Cocktail pro mal 10 bis zur achten Zelle aufzuhängen. Mischen Sie die Zellsuspension gut und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um eine Antikörperbindung zu ermöglichen.Dann fügen Sie 300 Mikroliter Etikettierpuffer und 200 Mikroliter Anti-Biotin MicroBeads pro mal 10 zu den achten Zellen hinzu. Gut mischen und weitere 10 Minuten bei vier Grad Celsius bebrüten. In der Zwischenzeit eine Trennsäule auf dem Separator einrichten und mit drei Millilitern Etikettierpuffer waschen.Legen Sie ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf die Oberseite einer Säule und geben Sie einen Milliliter der Perlen- und Zellmischung durch das Sieb in die Trennsäule. Sammeln Sie den Durchfluss in ein vorgechilltes 15-Milliliter-Rohr und waschen Sie die Säule entsprechend den Anweisungen des Herstellers, indem Sie Abwässer in das gleiche Rohr sammeln. Zählen Sie die Zellen und sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 350 mal g für fünf Minuten.Waschen Sie sie mit zwei Millilitertduden t-Zellmedium und Zentrifuge erneut. Dann setzen Sie sie in vorgewärmten T-Zellmedium in einer Konzentration von 250, 000 bis 500, 000 Zellen pro Milliliter. Waschen Sie die zuvor vorbereiteten CD3- und CD28-Antikörper-beschichteten Platten dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS und fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter der Zellsuspension hinzu.Verwenden Sie eine wirbelnde Bewegung, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Zur Steuerung die gleiche Anzahl von CD8-T-Zellen in einen einzigen nicht beschichteten Brunnen der Platte zu geben und die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 10%igen Kohlendioxid-Gastank-Inkubator zu brüten. Bereiten Sie am ersten Tag menschliche Fibronectin-Fragment-beschichtete Platten vor, indem Sie 0,5 Milliliter Fibronectin in die Brunnen einer 24-Well-Platte geben und sie über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten.Am nächsten Tag entfernen Sie die Fibronectin-Lösung und fügen Sie einen Milliliter 2%BSA und PBS pro Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten und waschen Sie die behandelten Brunnen mit einem Milliliter sterilen PBS. Die Platte ist nach dem Entfernen der Waschlösung einsatzbereit.Zählen Sie die aktivierten CD8 T-Zellen mit Trypan Blue. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation. Und setzen sie bei fünf Millionen lebensfähigen Zellen pro Milliliter für die Transduktion aus.Fügen Sie 100 Mikroliter der aktivierten CD8-Zellsuspension zu jedem Brunnen der Fibronectin-beschichteten Platte hinzu. Dann 1,5 bis zwei Milliliter des zuvor vorbereiteten Virus mit Medium hinzufügen und mit einer wirbelnden Bewegung mischen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Versiegeln Sie die Platte in einem Ziploc-Beutel und zentrieren Sie sie bei 2.000 mal g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius.Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge und bringen Sie sie in einen biologischen Sicherheitsschrank. Entfernen Sie vorsichtig die Plastiktüte und stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Platte nicht mit Medium kontaminiert ist. Übertragen Sie die Platte auf einen 37 Grad Celsius Kohlendioxid-Inkubator.Nach vier Stunden einen Milliliter Medium aus jedem Brunnen entfernen, durch einen Milliliter vorgewärmten kompletten T-Zellmedium ersetzen und die Platte wieder in den Inkubator legen. Die kritischen Aspekte dieses Protokolls sind ein High Titer Virus, gesunde aktivierte T-Zellen und die entsprechende Transduktionsmethode. Die Zellen wurden mit PE-Größe sieben konjugiert Anti-CD8, AF647 konjugierte Anti-CD3 und BV 421 konjugierte Anti-CD28 für Strömung zytometrische Analyse.Ungefähr 70% der CD8-T-Zellen ko-exprimiert GFP, die CAR-Expression anzeigt. Sie drückten auch CD28 und CD3 aus. Wichtig ist, dass alle GFP-positiven Testzellen auch mit I-Ag7 Insulin BR3 Tetrameren ko-gefärbt werden, was auf die Expression von CAR auf der Zelloberfläche, aber nicht mit dem Kontrolltetramer hinweist.Darüber hinaus sezernierten die sortierten TEST- und Kontroll-CAR-T-Zellen jeweils hohe Interferon-Gamma-Werte erst nach Kokultur mit Zielzellen, die ihre Cognate-Ninenden exdrückten, was bestätigt, dass die transducierten Zellen einen CD8-Effektor T-Zell-Phänotyp haben, der auf das Ziel der übergeordneten Antikörper gerichtet ist. Die Transduktion von Virus-Produzentenzellen, die Isolierung von primären CD8-T-Zellen und die Aktivierung dieser T-Zellen sind die wichtigsten Schritte dieses Experiments. Eine gesunde Aktivierung der T-Zellen und die Transduktion dieser T-Zellen mit geeigneten Reagenzien sorgen für günstige Ergebnisse.Diese Methode kann verwendet werden, um andere T-Zellen zu transduzieren, muss jedoch für den spezifischen T-Zelltyp angepasst werden. Dieses Protokoll ebnet den Weg für die Prävention von Typ-1-Diabetes mit antigenspezifischer chimer Antigenrezeptor-T-Zelltherapie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (KaAPC) für effiziente<em&gt; In-vitro-</em&gt; Depletion von humanen Antigen-spezifischen T-Zellen

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...