Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

इस अध्ययन JDRF अनुदान 1-INO-2015-S-B, 2-SRA-238-S-B, और SRA-2-S-2018-648-एस-बी, एक मधुमेह शिक्षा और कार्रवाई पुरस्कार, और चिकित्सा के Baylor कॉलेज में आणविक चिकित्सा में अनुसंधान के लिए कैरोलीन Wiess कानून कोष द्वारा समर्थित किया गया था. सेल-सॉर्टिंग NIH (S10RR024574 और P30CA125123) से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में Cytometry और सेल छंटनी कोर द्वारा समर्थित किया गया था. सभी पेप्टाइड-MHC tetramers NIH Tetramer कोर सुविधा से प्राप्त किए गए थे.

चूहे एक ट्रांसजेनिक माउस सुविधा में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत बनाए रखा गया था, और सभी पशु प्रयोगों चिकित्सा पशु देखभाल और उपयोग समिति के Baylor कॉलेज द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर?...

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	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल retroviral transduction द्वारा प्रतिजन-विशिष्ट CD8 कार-टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। हमारे प्रोटोकॉल के transduction दक्षता आम तौर पर उच्च है, और कार की मजबूत अभिव्यक्ति आम तौर पर मना?...

अवांछित ऑफ-लक्ष्य प्रभाव ों की संभावना कम जोखिम को देखते हुए, एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा उपचार (एएसआई) T1D जैसे ऑटोम्यून्यून रोगों के लिए उपचार का वादा कर रहे हैं। संचित साक्ष्य से पता चलता है कि (प्रीप्रो) इंसुलिन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं T1D1में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकती हैं। पिछले दशक में, कई समूहों से अध्ययन, हमारे अपने सहित, दृढ़ता से सुझाव है कि विशिष्ट MHC वर्ग द्वितीय अणुओं द्वारा इंसुलिन बी श्रृंखला अमीनो एसिड युक्त एक epitope की प्रस्तुति 9 से 23 (B:9-23/MHCII), में T1D के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है चूहे और मनुष्य2,3,4,5. चुनिंदा लक्ष्य B:9-23/MHCII परिसर, हम एक monoclonal एंटीबॉडी उत्पन्न, mAb287 नाम, कि हार्मोन इंसुलिन या अन्य पेप्टाइड्स युक्त परिसरों के लिए कोई पार प्रतिक्रियाहै 6. MAb287 ब्लॉक एंटीजन प्रस्तुति इन विट्रो में, और mAb287 के साप्ताहिक प्रशासन पूर्व मधुमेह NOD चूहों इलाज चूहों के 35% में T1D के विकास में देरी6. विवो में प्रतिजन प्रस्तुति ब्लॉक करने के लिए, अक्सर इंजेक्शन आम तौर पर एक उच्च घूम एकाग्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। हम hypothesized है कि हम Ab287 की उच्च विशिष्टता का लाभ लेने के लिए टी कोशिकाओं reprogram द्वारा इस कठिनाई को दूर कर सकता है, जिससे T1D7के लिए एक बेहतर प्रतिजन विशेष टी सेल थेरेपी प्रदान .
बताया जाता है कि यदि उनके कोग्नेट लिगन्ड की एक प्रति भी8,9,10व्यक्त की जाती है तो कोशिका विषाक् त टी कोशिकाएं अपने लक्ष् य को मार सकती हैं . इस प्रकार, B:9-23/MHCII विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं को माता पिता एंटीबॉडी की तुलना में अवांछित प्रतिजन प्रस्तुति को नष्ट करने में उच्च दक्षता है, जो संभावना एक ही एपीसी पर कई परिसरों के लिए बाध्य करने की आवश्यकता होगी अपने प्रभाव लागू करने की उम्मीद कर रहे हैं. कई मानव कैंसरों के उपचार के लिए कार टी कोशिकाओं का उपयोग किया गया है11,12,13, और यह भी autoimmunity14में प्रभावशाली हो सकता है . तथापि, रोगजनक पेप्टाइड-एमएचसी परिसरों के लिए विशिष्टता वाली सीएआर-टी कोशिकाओं का अभी तक टी 1 डी की प्रगति को संशोधित करने के लिए उपयोग नहीं किया गया है। अनुकूलित CD8 टी सेल transduction तकनीक नीचे वर्णित का उपयोग करके, हम हाल ही में सिद्धांत का सबूत है कि यह वास्तव में एक व्यवहार्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है7का प्रदर्शन किया.
इस प्रोटोकॉल में, हम एक कुशल और सुव्यवस्थित transduction और विस्तार विधि रूपरेखा. हमारे प्रोटोकॉल उच्च दक्षता के साथ माउस CD8 कार टी कोशिकाओं की पीढ़ी की आवश्यकता होती है अन्य अध्ययनों के लिए लागू है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

प्रकार 1 मधुमेह (T1D) आइलेट-विशिष्ट autoimmunity बीटा सेल विनाश और इंसुलिन उत्पादन की पूर्ण हानि के लिए अग्रणी द्वारा विशेषता है. सहज गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (NOD) माउस मॉडल में, इंसुलिन प्राथमिक लक्ष्य है, और इन जानवरों के आनुवंशिक हेरफेर एक एकल कुंजी इंसुलिन epitope को दूर करने के लिए रोग से बचाता है. इस प्रकार, पेशेवर एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs) इस रोगजनक एपिटोप असर के चयनात्मक उन्मूलन अवांछित इंसुलिन विशेष autoimmune प्रतिक्रियाओं को बाधित करने के लिए एक दृष्टिकोण है, और संभावना अधिक से अधिक अनुवाद क्षमता है.
चिमेरिक प्रतिजन रिसेप्टर्स (CARs) टी कोशिकाओं चुनिंदा रोग पैदा करने वाले प्रतिजनों को लक्षित करने के लिए अनुप्रेषित कर सकते हैं. इस तकनीक को कई कैंसर के इलाज के लिए दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए सेलुलर इंजीनियरिंग का उपयोग करने के लिए हाल ही में प्रयास करने के लिए मौलिक है. इस प्रोटोकॉल में, हम एक अनुकूलित टी-सेल रेट्रोवायरस (आरवी) transduction और इन विट्रो विस्तार प्रोटोकॉल है कि कार्यात्मक प्रतिजन-विशिष्ट CD8 CAR-T कोशिकाओं की एक कम संख्या से शुरू की उच्च संख्या उत्पन्न करता है का वर्णन पहले एकाधिक कार-टी सेल प्रोटोकॉल वर्णित किया गया है, लेकिन आम तौर पर अपेक्षाकृत कम transduction दक्षता और सेल व्यवहार्यता के साथ transduction के बाद. इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल 90% transduction दक्षता प्रदान करता है, और उत्पन्न कोशिकाओं vivo में दो सप्ताह से अधिक जीवित रह सकते हैं और काफी एक जलसेक के बाद रोग शुरुआत में देरी. हम सेल रखरखाव और transduction प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, ताकि महत्वपूर्ण कदम आसानी से पालन किया जा सकता है. प्राथमिक सेल अलगाव से कार अभिव्यक्ति के लिए पूरी प्रक्रिया 14 दिनों के भीतर किया जा सकता है. सामान्य विधि किसी भी माउस रोग मॉडल है जिसमें लक्ष्य जाना जाता है के लिए लागू किया जा सकता है. इसी प्रकार, विशिष्ट अनुप्रयोग (रोगजनक पेप्टाइड/एमएचसी श्रेणी द्वितीय परिसर को लक्षित करना) किसी भी अन्य ऑटोम्यून्यून रोग मॉडल पर लागू होता है जिसके लिए एक प्रमुख परिसर की पहचान की गई है।

आमतौर पर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग transduction दक्षता है $60-90%. चित्र 3में दिखाए गए प्रयोग में, लगभग छँटाई करने से पहले, CD8 T कोशिकाओं के 70% सह-एक्सप्रेस्ड GFP. उन्होंने यह भी सह-एक्सप्रेस्ड CD28 और CD3 (<stro...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

यह आलेख एंटीजन-विशिष्ट CD8 टी कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, और इन विट्रो में उनके विस्तार, इन विट्रो में और विवो में उपयोग के लिए कार्यात्मक टी कोशिकाओं की उच्च संख्या उपज के उद्देश्य से.

एक Autoimmune मधुमेह मॉडल में कार्यात्मक परीक्षण के लिए Antigen-विशिष्ट प्राथमिक माउस Cytotoxic टी कोशिकाओं के उच्च दक्षता पीढ़ी

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

माउस टी कोशिकाओं में टी सेल रिसेप्टर्स की रेट्रोवायरल transduction

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

तैयारी और प्रयोग करें एचआईवी 1 संक्रमित प्राथमिक + प्राकृतिक खूनी सेल साइटोटोक्सिक Assays में लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में सीडी 4 टी कोशिकाओं

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

प्राथमिक मानव भोले और स्मृति टी कोशिकाओं से प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं की पीढ़ी

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की piggyBac Transposon सिस्टम संशोधन

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

कुशल के लिए खूनी कृत्रिम एंटीजन पेश कोशिकाओं (KaAPC)<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की कमी

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

एंजाइमी डाइजेस्ट और ढाल जुदाई का उपयोग माउस त्वचा से घुसपैठ कर Leukocytes का अलगाव

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

का पता लगाने और दुर्लभ के संवर्धन विशिष्ट प्रतिजन phenotype और समारोह के विश्लेषण के लिए बी कोशिकाओं

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...