Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da JDRF sovvenzioni 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, un diabete istruzione e azione Award, e il Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine presso Baylor College of Medicine. Lo smistamento delle cellule è stato supportato dal Cytometry and Cell Sorting Core del Baylor College of Medicine con il finanziamento del NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Tutti i tetrameri peptide-MHC sono stati ottenuti dal NIH Tetramer Core Facility.

I topi sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni presso uno strumento di topo transgenico, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Baylor College of Medicine per la cura e l'uso degli animali.
NOTA: L'esperimento richiede la preparazione parallela del virus e delle cellule T. Nella tabella 1 il protocollo è riepilogato. I reagenti chiave e i buffer sono elencati nella tabella ...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per produrre cellule CD8 CAR-T specifiche dell'antigene mediante trasduzione retrovirale. L'efficienza di trasduzione del nostro protocollo è tipicamente elevata, e si osserva generalmente un'espressione robusta della RCA. Le cellule CAR T espanse mantengono le caratteristiche essenziali delle cellule T attivate dai genitori e la specificità degli anticorpi e sono adatte sia per l'uso in vitro che in vivo. Abbiamo applicato cellule T Ab-CAR CD8 nella riprogrammazione del ...

Dato il probabile rischio ridotto di effetti off-target indesiderati, le terapie immunitarie specifiche dell'antigene (ASI) sono trattamenti promettenti per malattie autoimmuni come il T1D. Sempre più prove suggeriscono che le risposte immunitarie all'insulina (prepro)possono essere particolarmente importanti nel T1D1. Nell'ultimo decennio, studi condotti da più gruppi, incluso il nostro, suggeriscono fortemente che la presentazione di un epitopo contenente aminoacidi della catena di insulina B da 9 a 23 da specifiche molecole MHC di classe II (B:9-23/MHCII), svolge un ruolo importante nello sviluppo del T1D in topi e esseri umani2,3,4,5. Per indirizzare selettivamente il complesso B:9-23/MHCII, abbiamo generato un anticorpo monoclonale, chiamato mAb287, che non ha alcuna reattività incrociata all'ormone insulina o complessi contenenti altri peptidi6. MAb287 blocca la presentazione dell'antigene in vitro, e la somministrazione settimanale di mAb287 ai topi NOD pre-diabetici ha ritardato lo sviluppo di T1D nel 35% dei topi trattati6. Per bloccare la presentazione dell'antigene in vivo, sono in genere necessarie iniezioni frequenti per mantenere un'alta concentrazione circolante. Abbiamo ipotizzato che avremmo potuto superare questa difficoltà sfruttando l'alta specificità di Ab287 per riprogrammare le cellule T, fornendo così una migliore terapia con cellule T specifico dell'antigene per T1D7.
Le cellule T citotossiche sono segnalate per essere in grado di uccidere il loro bersaglio se anche una singola copia del loro ligando cognato è espresso8,9,10. Pertanto, si prevede che le cellule T CD8 specifiche di B:9-23/MHCII avranno una maggiore efficienza nell'eliminare la presentazione indesiderata dell'antigene rispetto all'anticorpo genitore, che probabilmente dovrà essere associato a più complessi sullo stesso APC per esercitarne l'effetto. Cellule CAR T sono state utilizzate per il trattamento di più tumori umani11,12,13, e può anche essere efficace in autoimmunità14. Tuttavia, le cellule CAR-T con specificità per i complessi patogeni di peptidi-MHC non sono state finora utilizzate per modificare la progressione del T1D. Utilizzando la tecnica ottimizzata di trasduzione delle cellule T CD8 descritta di seguito, abbiamo recentemente dimostrato la prova di principio che questo rappresenta effettivamente un approccio praticabile7.
In questo protocollo, illustreremo un metodo di trasduzione ed espansione efficiente e semplificato. Il nostro protocollo è applicabile ad altri studi che richiedono la generazione di cellule T CD8 CD8 per topi con alta efficienza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Il diabete di tipo 1 (T1D) è caratterizzato da un'autoimmunità specifica dell'iletto che porta alla distruzione delle cellule beta e alla perdita assoluta della produzione di insulina. Nel modello di topo spontaneo del diabete non obesi (NOD), l'insulina è l'obiettivo primario e la manipolazione genetica di questi animali per rimuovere un singolo epitopo insulinico chiave previene la malattia. Pertanto, l'eliminazione selettiva delle cellule professionali che presentano antigeni (APC) recanti questo epitopo patogeno è un approccio per inibire le risposte autoimmuni indesiderate specifiche dell'insulina e probabilmente ha un maggiore potenziale traslazionale.
I recettori degli antigeni chimerici (CR) possono reindirizzare le cellule T a colpire selettivamente gli antigeni che causano la malattia. Questa tecnica è fondamentale per i recenti tentativi di utilizzare l'ingegneria cellulare per la terapia cellulare adottiva per il trattamento di tumori multipli. In questo protocollo, descriviamo un retrovirus a cellule T ottimizzato (RV) e un protocollo di espansione in vitro che genera un numero elevato di cellule CD8 CAR-T specifiche dell'antigene funzionale a partire da un basso numero di cellule ingenue. In precedenza sono stati descritti più protocolli cellulari CAR-T, ma in genere con efficienza di trasduzione relativamente bassa e vitalità cellulare dopo la trasduzione. Al contrario, il nostro protocollo fornisce fino al 90% di efficienza di trasduzione e le cellule generate possono sopravvivere più di due settimane in vivo e ritardare significativamente l'insorgenza della malattia a seguito di una singola infusione. Forniamo una descrizione dettagliata del protocollo di manutenzione e trasduzione delle cellule, in modo che i passaggi critici possano essere facilmente seguiti. L'intera procedura dall'isolamento cellulare primario all'espressione CAR può essere eseguita entro 14 giorni. Il metodo generale può essere applicato a qualsiasi modello di malattia del topo in cui l'obiettivo è noto. Allo stesso modo, l'applicazione specifica (mirata a un complesso patogeno di peptidi/Classe MHC II) è applicabile a qualsiasi altro modello di malattia autoimmune per il quale è stato identificato un complesso chiave.

In genere, l'efficienza della trasduzione che utilizza questo protocollo è del 60-90%. Nell'esperimento illustrato nella Figura 3, prima di eseguire lo smistamento approssimativo, il 70% delle cellule T CD8 coesprimeva GFP. Hanno inoltre co-espresso CD28 e CD3 (Figura3C). È importante sottolineare che tutte le celle GFP "test"sono state co-macchiate con tetrameri IAg7-B:R3, ma non con il tetramero di contr...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di cellule T CD8 specifiche dell'antigene e la loro espansione in vitro, con l'obiettivo di produrre un numero elevato di cellule T funzionali da utilizzare in vitro e in vivo.

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Questo protocollo consente di generare un gran numero di cellule T funzionali specifiche dell'antigene che sono un approccio sicuro desiderato nel trattamento delle malattie autoimmuni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ti fornisce un processo di trasduzione altamente efficiente e un gran numero di cellule T funzionali. Questa tecnica può essere estesa per trattare il diabete di tipo 1 e altre malattie autoimmuni in cui sono noti gli antigeni.Inoltre, le cellule CAR T possono essere un trattamento promettente per alcuni tipi di cancro. Questo metodo può essere utilizzato per generare cellule immunitarie che esprimono altri CAR. È importante avere una buona tecnica accettata, leggere l'intero protocollo e pianificare l'intero esperimento in anticipo.Questo protocollo di due settimane include mini-passaggi e il successo dipende dalle prestazioni corrette di ogni passaggio. Le dimostrazioni visive di questo metodo sono fondamentali per gli studenti da seguire correttamente. Preparare le celle di Phoenix per la trasfezione come descritto nel manoscritto.È buona pratica contrassegnare la parete laterale dove verrà aggiunto e rimosso il mezzo per ridurre al minimo il soffiaggio delle celle. Il giorno zero aspirare il supernatante dalle cellule e lavarle con cinque millilitri di PBS. Aggiungere con cura sette millilitri di siero ridotto medio dropwise alla parete laterale della piastra e trasferire le cellule all'incubatrice.Aggiungere 1,5 millilitri di siero ridotto medio a due tubi in polipropilene rotondo da 14 millimetri. Aggiungere 40 micrometri di reagente di trasfezione a uno dei tubi e 15 microgrammi di plasmide CAR reindirizzato dall'anticorpo insieme a cinque microgrammi di plasmide da imballaggio all'altro. Incubare i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti e quindi aggiungere il reagente di trasfezione al tubo plasmide.Mescolare tubazione delicatamente la soluzione su e giù tre volte e incubarla a temperatura ambiente per almeno 20 minuti. Aggiungere tre millilitri della miscela alle cellule di Phoenix e metterli in un'incubatrice di coltura tissutale. Dopo quattro o cinque ore aggiungere un millilitro di FCS alle cellule e culturerle durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, rimuovere il supernatante dalle cellule e aggiungere quattro millilitri di nuovo mezzo di coltura prebellica. Raccogliere il virus il secondo giorno raccogliendo il virus contenente il mezzo dalle cellule di Phoenix e filtrandolo per rimuovere i detriti cellulari residui. Aggiungere il materiale UMANO IL-2 ricombinante al virus per una concentrazione finale di 200 unità internazionali per millilitro e utilizzarlo immediatamente per la trasduzione.Aggiungere quattro millilitri di mezzo fresco alle cellule phoenix e posizionarli nell'incubatrice durante la notte. Ripetere la raccolta dei virus il giorno successivo per una seconda trasduzione e scartare le cellule. Un giorno prima di seminare cellule MURINE CD8 T, aggiungere un millilitro di una miscela di anticorpi ANTI-mouse CD3 e CD28 ad ogni pozzo di una piastra di 24 pozzetti e incubare la piastra durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno zero, raccogli le milza di topo e mettile su un colino cellulare che assorbe 10 millilitri di PBS in un piatto di coltura cellulare sul ghiaccio. In un cappuccio di coltura cellulare, tagliare ogni milza in tre o cinque pezzi e utilizzare uno stantuffo sterile di una siringa per premere il tessuto attraverso la rete metallica. Rimuovere delicatamente i globuli rossi rimescolando gli splenociti in uno o quattro tamponi diluiti di lisi dei globuli rossi e incubandoli a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi diluire 10 microlitri della sospensione cellulare con Trypan Blue per il conteggio delle cellule.E pellettò il resto delle cellule centrifugando a 350 volte g per sette minuti. Utilizzare un kit di isolamento cellulare CD8 T del mouse per arricchire le cellule T CD8 e sospendere i pellet cellulari in 400 microlitri di tampone con 100 microlitri di cocktail di anticorpi alla biotina per uno per 10 alle otto cellule. Mescolare bene la sospensione cellulare e incubarla per cinque minuti a quattro gradi Celsius per consentire il legame anticorpale.Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone di etichettatura e 200 microlitri di MicroBead anti-biotina per uno per 10 alle otto cellule. Mescolare bene e incubare per altri 10 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, impostare una colonna di separazione sul separatore e lavarla con tre millilitri di tampone di etichettatura.Mettere un colino a celle di 40 micrometri sulla parte superiore di una colonna e passare un millilitro della perla e della miscela cellulare attraverso il colino nella colonna di separazione. Raccogliere il flusso attraverso un tubo prechilled da 15 millilitri e lavare la colonna secondo le indicazioni del produttore, raccogliendo gli effluenti nello stesso tubo. Contare le cellule e raccoglierle per centrifugazione a 350 volte g per cinque minuti.Lavarli con due millilitri di mezzo cellulare T e centrifugare di nuovo. Quindi li ha rimorsi in mezzo cellulare T prebellico ad una concentrazione di 250.000-500.000 cellule per millilitro. Lavare tre volte le piastre rivestite con anticorpi CD3 e CD28 precedentemente preparate con un millilitro di PBS sterile e aggiungere due millilitri della sospensione cellulare ad ogni pozzo.Utilizzare un movimento vorticoso per erogare le celle in modo uniforme. Come controllo, placcare lo stesso numero di cellule CD8 T in un singolo pozzo non rivestito della piastra e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di serbatoi di gas di anidride carbonica al 10% per 48 ore. Il primo giorno, preparare piastre rivestite con frammenti di fibronectina umana aggiungendo 0,5 millilitri di fibronectina ai pozzi di una piastra di 24 po 'e incubandola durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo rimuovere la soluzione di fibronectina e aggiungere un millilitro di 2%BSA e PBS per pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare i pozzi trattati con un millilitro di PBS sterile. La piastra è pronta per l'uso dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio.Contare le celle CD8 T attivate utilizzando Trypan Blue. Raccoglili per centrifugazione. E li rimussò a cinque milioni di cellule vitali per millilitro per la trasduzione.Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare CD8 attivata ad ogni pozzo della piastra rivestita con fibronecina. Quindi aggiungere da 1,5 a due millilitri del virus precedentemente preparato contenente mezzo e mescolare utilizzando un movimento vorticoso per erogare uniformemente le cellule. Sigillare la piastra in una borsa Ziploc e centrifugarla a 2.000 volte g per 90 minuti a 37 gradi Celsius.Rimuovere la piastra dalla centrifuga e portarla in un armadietto di sicurezza biologico. Rimuovere con cura il sacchetto di plastica e assicurarsi che l'esterno della piastra non sia contaminato da mezzo. Trasferire la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius.Dopo quattro ore, rimuovere un millilitro di mezzo da ogni pozzo, sostituirlo con un millilitro di mezzo cellulare T completo prebellito e rimettere la piastra nell'incubatrice. Gli aspetti critici di questo protocollo sono un virus ad alto formicolio, cellule T attivate sane e il metodo di trasduzione appropriato. Le celle sono state co-macchiate con pe dimensione sette coniugato anti-CD8, AF647 coniugato anti-CD3, e BV 421 coniugato anti-CD28 per l'analisi citometrica del flusso.Circa, il 70% delle cellule CD8 T ha co-espresso GFP che indica l'espressione CAR. Hanno anche co-espresso CD28 e CD3. È importante sottolineare che tutte le cellule positive GFP di prova sono anche co-macchiate con tetrameri BR3 di insulina I-Ag7 che indicano l'espressione di CAR sulla superficie cellulare ma non con il tetramero di controllo.Inoltre, il test ordinato e il controllo delle cellule CAR T hanno secreto alti livelli di gamma di interferone solo dopo la cocoltura con cellule bersaglio che esprimono i loro ligandi affini che conferma che le cellule trasdotte hanno un fenotipo di cellule T dell'effettore CD8 diretto verso il bersaglio degli anticorpi genitori. La trasduzione di cellule produttrici di virus, l'isolamento delle cellule T CD8 primarie e l'attivazione di queste cellule T sono i passaggi più importanti di questo esperimento. Avere cellule T attivate sane e trasduzione di queste cellule T con reagenti appropriati garantisce risultati favorevoli.Questo metodo può essere utilizzato per trasdurre altre celle T, ma deve essere personalizzato per il tipo di cella T specifico. Questo protocollo apre la strada alla prevenzione del diabete di tipo 1 con terapia cellulare T del recettore dell'antigene chimerico specifico dell'antigene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...