Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
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이 연구는 JDRF 교부금 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, SRA-2-S-2018-648-S-B, 당뇨병 교육 및 행동 상, 그리고 베일러 의학 대학에서 분자 의학 연구를 위한 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 지원되었습니다. 세포 분류는 NIH (S10RR024574 및 P30CA125123)의 자금으로 베일러 의과 대학의 세포 분석 및 세포 선별 코어에 의해 지원되었습니다. 모든 펩티드-MHC 테트라머는 NIH 테트라머 코어 시설에서 수득하였다.

마우스는 트랜스제닉 마우스 시설에서 특정 병원균이 없는 조건하에서 유지되었고, 모든 동물 실험은 베일러 의과 대학 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
참고: 실험에서는 바이러스와 T 세포를 병렬로 준비해야 합니다. 표 1은 프로토콜을 요약합니다. 키 시약 및 버퍼는 재료표에 나열됩니다. 우리는 이 프로토콜에 있...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

이 프로토콜은 레트로바이러스 성전환에 의해 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포를 제조하기 위한 효율적인 방법을 설명한다. 당사의 프로토콜의 전형적 감전 효율은 전형적으로 높으며, CAR의 강력한 발현이 일반적으로 관찰된다. 확장된 CAR T 세포는 부모 활성화 된 T 세포 및 항체 특이성의 필수 특징을 유지하고, 생체 외 및 생체 내 사용 모두에 적합하다. 우리는 NOD 마우스7에 있는 타입-1 당뇨병을 재프?...

원치 않는 오프 타겟 효과의 가능성이 감소 된 위험을 감안할 때, 항원 특정 면역 치료 (ASI)는 T1D와 같은 자가 면역 질환에 대한 유망한 치료법입니다. 축적 된 증거는 (prepro) 인슐린에 대한 면역 반응이 T1D1에서특히 중요 할 수 있음을 시사합니다. 지난 10 년 동안, 우리 자신을 포함한 여러 그룹의 연구는 특정 MHC 클래스 II 분자 (B : 9-23 / MHCII)에 의해 인슐린 B 사슬 아미노산9 ~23을 함유하는 에피토프의 프리젠 테이션이 T1D의 개발에 중요한 역할을한다는 것을 강력하게 제안합니다. 마우스와인간 2,3,4,5. B:9-23/MHCII 복합체를 선택적으로 표적화하기 위해, 우리는 다른 펩티드를 함유하는 호르몬 인슐린 또는 복합체에 교차 반응성을 가지지 않는 mAb287이라는 단일클론 항체를 생성하였다6. MAb287 블록 항원 프리젠테이션 시험관에서, 및 전 당뇨병 NOD 마우스에 대한 mAb287의 주간 투여는 처리된마우스6의35%에서 T1D의 발달을 지연시켰다. 생체 내에서 항원 프리젠 테이션을 차단하기 위해, 빈번한 주사는 일반적으로 높은 순환 농도를 유지하기 위해 요구된다. 우리는 T 세포를 재프로그래밍하기 위해 Ab287의 높은 특이성을 활용하여 이러한 어려움을 극복할 수 있다고 가설을 세우고 T1D7에 대한 개선된 항원 특이적 T 세포 요법을 제공하였다.
세포독성 T 세포는 그들의 동종 리간드의 단일 사본조차도 8,9,10으로발현되는 경우에도 그들의 표적을 죽일 수 있는 것으로 보고된다. 따라서, B:9-23/MHCII 특이적 CD8 T 세포는 모항체보다 원치 않는 항원 프리젠테이션을 제거하는 데 있어 더 높은 효율을 가질 것으로 예상되며, 이는 그 효과를 발휘하기 위해 동일한 APC상에 여러 복합체에 결합할 필요가 있을 것이다. CAR T 세포는 다중 인간암(11,12,13)치료에 사용되어 왔으며, 또한 자가면역(14)에서 효과적일 수 있다. 그러나, 병원성 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이성을 가진 CAR-T 세포는 지금까지 T1D의 진행을 수정하는 데 사용되지 않았다. 아래에 설명된 최적화된 CD8 T 세포 전착 기술을 사용하여, 우리는 최근에 이것이실제로 실행 가능한 접근법 7을 나타낸다는 원리의 증거를 입증했다.
이 프로토콜에서는 효율적이고 능률적인 변환 및 확장 방법을 간략하게 설명합니다. 당사의 프로토콜은 고효율의 마우스 CD8 CAR T 세포의 생성을 요구하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

타입-1 당뇨병 (T1D)는 베타 세포 파괴 및 인슐린 생산의 절대 손실로 이끌어 내는 아일레 특정 자기 면역에 의해 특징입니다. 자발적인 비비만 당뇨병(NOD) 마우스 모델에서, 인슐린은 1차 표적이며, 이들 동물의 유전자 조작은 단일 키 인슐린 에피토프를 제거하여 질병을 예방한다. 따라서, 이러한 병원성 에피토프를 베어링하는 전문 항원 제시 세포(APC)의 선택적 제거는 원치 않는 인슐린 특이적 자가면역 반응을 억제하는 접근법이며, 가능성이 더 큰 번역 잠재력을 갖는다.
키메라 항원 수용체 (CA)는 선택적으로 질병을 일으키는 항원을 표적으로 하는 T 세포를 리디렉션할 수 있습니다. 이 기술은 다중 암을 취급하기 위하여 입양 세포 치료를 위한 세포 공학을 사용하는 최근 시도에 근본적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 낮은 수의 순진한 세포로부터 시작하여 기능성 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포의 높은 숫자를 생성하는 최적화된 T 세포 레트로바이러스(RV) 형질 전환 및 시험관 내 확장 프로토콜을 설명합니다. 이전에 는 다중 CAR-T 세포 프로토콜이 기술되었지만, 전형적으로 는 상대적으로 낮은 전송 효율 및 세포 생존능후의 트랜스덕션을 가지고 있다. 대조적으로, 우리의 프로토콜은 최대 90%의 환전 효율을 제공하며, 생성된 세포는 생체 내에서 2주 이상 생존하고 단일 주입 후 질병 발병을 현저히 지연시킬 수 있습니다. 당사는 중요한 단계를 쉽게 따를 수 있도록 셀 유지 관리 및 트랜스덕션 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 1차 세포 격리로부터 CAR 발현에 이르는 전체 절차는 14일 이내에 수행될 수 있다. 일반적인 방법은 표적이 공지된 임의의 마우스 질환 모델에 적용될 수 있다. 유사하게, 특정 적용 (병원성 펩티드/MHC 클래스 II 복합체를 표적으로 하는)은 주요 복합체가 확인된 임의의 다른 자가면역 질환 모델에 적용 가능하다.

전형적으로, 이 프로토콜을 이용한 환전 효율은 ~60-90%이다. 도3에 도시된 실험에서, 약 선별하기 전에, CD8 T 세포의 70%가 GFP를 공동 발현하였다. 또한 CD28 및 CD3(그림3C)를 공동 표현하였다. 중요한 것은, 모든 "시험" GFP+ 세포는 또한 IA g7-B:R3 테트라머와 함께 염색되었지만, 대조군 테트라머와는 그렇지 않다(그림<s...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.

자가 면역 당뇨병 모델에서 기능 테스트를 위한 항원 특이적 원발성 원발성 T 세포의 고효율 생성

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

이 프로토콜을 사용하면 자가 면역 질환 치료에 원하는 안전한 접근 방식인 많은 기능성 항원 특이적 T 세포를 생성할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고효율 트랜스듀션 프로세스와 많은 수의 기능성 T 세포를 제공한다는 것입니다. 이 기술은 항원이 알려져 있는 타입-1 당뇨병 및 그밖 자기 면역 질병을 취급하기 위하여 확장될 수 있습니다.더욱이, CAR T 세포는 특정 유형의 암에 대한 유망한 치료법일 수 있다. 이 방법은 다른 CARs를 표현하는 면역 세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 좋은 수락 기술을 가지고, 전체 프로토콜을 읽고 사전에 전체 실험을 계획하는 것이 중요합니다.이 2주 간의 긴 프로토콜에는 미니 단계가 포함되어 있으며 성공은 각 단계의 적절한 성능에 따라 달라집니다. 이 방법의 시각적 데모는 학습자가 올바르게 따르는 데 매우 중요합니다. 원고에 설명된 대로 트랜스페션을 위해 피닉스 세포를 준비한다.세포에서 불어오는 것을 최소화하기 위해 배지를 첨가하고 제거할 측면 벽을 표시하는 것이 좋습니다. 제로 날에는 세포에서 슈퍼 네티미터를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터로 씻어. 조심스럽게 플레이트의 측면 벽에 드롭 방향으로 감소 된 혈청 배지의 일곱 밀리리터를 추가하고 인큐베이터로 다시 세포를 전송합니다.1.5 밀리리터의 감소된 혈청 배지를 14mm 라운드 하단 폴리프로필렌 튜브 2개에 추가합니다. 40 마이크로미터의 트랜스페션 시약을 튜브 중 하나에 추가하고 다른 하나는 5 마이크로 그램의 포장 플라스미드와 함께 CAR 플라스미드를 리디렉션 한 항체 15 마이크로그램을 추가합니다. 실온에서 튜브를 5분간 배양한 다음 플라스미드 튜브에 경질 시약을 추가합니다.용액을 세 번 위아래로 부드럽게 파이프로 섞고 실온에서 적어도 20 분 동안 배양하십시오. 피닉스 세포에 혼합물의 3 밀리리터를 추가하고 조직 배양 인큐베이터에 배치합니다. 4~5시간 후에 는 세포에 FCS 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 배양합니다.다음 날, 세포에서 상체를 제거하고 신선한 예온 배양 배지의 4 밀리리터를 추가합니다. 피닉스 세포로부터 배지를 함유하는 바이러스를 수집하고 여과하여 2일째에 바이러스를 수확하여 잔류 세포 이물질을 제거합니다. 밀리리터당 200개의 국제 유닛의 최종 농도를 위해 바이러스에 재조합 인간 IL-2 스톡을 추가하고 즉시 트랜스듀션에 사용하십시오.피닉스 세포에 신선한 배지 4 밀리리터를 넣고 하룻밤 동안 인큐베이터에 넣습니다. 두 번째 트랜스퍼션을 위해 다음 날에 바이러스 수집을 반복하고 세포를 폐기합니다. 하루 전에 murine CD8 T 세포를 파종하기 전에, 24 웰 플레이트의 각 웰에 항 마우스 CD3 및 CD28 항체의 혼합물의 1 밀리리터를 추가하고 4섭씨에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다.제로 날에는 마우스 비장을 수확하고 얼음에 세포 배양 접시에 PBS의 10 밀리리터에 담근 세포 여조기에 넣습니다. 세포 배양 후드에서 각 비장을 3~5개로 자르고 주사기의 멸균 플런저를 사용하여 와이어 메쉬를 통해 조직을 누릅니다. 희석된 적혈구 용해 버퍼 1~4개를 재연하고 실온에서 5분 동안 배양한 다음 세포 계수를 계산하기 위해 Trypan Blue로 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 희석하여 적혈구를 부드럽게 제거합니다.그리고 7 분 동안 350 배 g에서 원심분리하여 세포의 나머지 부분을 펠릿. 마우스 CD8 T 세포 격리 키트를 사용하여 CD8 T 세포를 농축하고 400 마이크로리터의 완충제에 세포 펠릿을 일시 중단하여 1회 10회당 비오틴 항체 칵테일100마이크로리터를 8세포에 한다. 세포 현탁액을 잘 섞고 섭씨 4도에서 5분간 배양하여 항체 결합을 허용합니다.그런 다음 라벨링 버퍼 300마이크로리터와 제8세포에 1회 10회당 안티 비오틴 마이크로비드 200마이크로리터를 추가합니다. 잘 섞어서 섭씨 4도에서 10분 간 추가로 배양하세요. 한편, 분리기 위에 분리 열을 설정하고 라벨링 버퍼의 세 밀리리터로 세척합니다.40 마이크로미터 셀 스트레이너를 기둥 위에 놓고 스트레이너를 통해 비드 및 셀 혼합물의 1밀리리터를 분리 열로 전달합니다. 미리 냉각된 15 밀리리터 튜브로 흐름을 수집하고 제조업체의 지시에 따라 컬럼을 세척하여 동일한 튜브로 유출물을 수집합니다. 세포를 계산하고 5 분 동안 350 배 g에서 원심 분리로 수집합니다.T 셀 배지와 원심분리기 의 2 밀리리터로 다시 씻어. 그런 다음 밀리리터 당 250, 000 ~ 500, 000 세포의 농도로 예열된 T 세포 배지에서 이를 다시 중단합니다. 이전에 준비된 CD3 및 CD28 항체 코팅 플레이트를 멸균 PBS 1밀리리터로 세 번 세척하고 각 웰에 셀 서스펜션의 2밀리리터를 추가합니다.소용돌이 치는 움직임을 사용하여 세포를 균등하게 분배합니다. 대조군으로서, 동일한 수의 CD8 T 세포를 플레이트의 단일 비코팅 우물로 플레이트에 플레이트와 배양하고 48시간 동안 10%의 이산화탄소 가스 탱크 인큐베이터에서 37도의 세포배양증을 한다. 첫날에는 24웰 플레이트의 우물에 0.5 밀리리터의 섬유네틴을 추가하고 섭씨 4도에서 밤에 배양하여 인간 섬유네틴 조각 코팅 플레이트를 준비하십시오.다음 날, fibronectin 용액을 제거하고 잘 당 2 %BSA및 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 처리된 우물을 멸균 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 플레이트는 세척 용액을 제거 한 후 사용할 준비가되어 있습니다.Trypan Blue를 사용하여 활성화된 CD8 T 셀을 계산합니다. 원심분리로 수집합니다. 그리고 트랜스듀션을 위해 밀리리터당 5백만 개의 실행 가능한 세포로 재보좌합니다.활성 CD8 셀 서스펜션의 마이크로리터 100개를 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 배지를 함유한 이전에 준비된 바이러스의 1.5~2밀리리터를 추가하고 소용돌이 운동을 사용하여 세포를 균등하게 분배한다. 접시를 지글록 백에 밀봉하고 원심분리기는 섭씨 37도에서 90분 동안 2, 000배 g로 밀봉합니다.원심분리기에서 플레이트를 제거하고 생물학적 안전 캐비닛에 가져 가라. 조심스럽게 비닐 봉지를 제거하고 접시의 외부가 매체로 오염되지 않았는지 확인합니다. 플레이트를 섭씨 37도이산화탄소 인큐베이터로 옮기습니다.4 시간 후, 각 우물에서 매체의 1 밀리 리터를 제거하고, 미리 온전한 완전한 T 세포 매체의 1 밀리리터로 대체하고 인큐베이터에 다시 접시를 넣습니다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 하이 티터 바이러스, 건강한 활성화 된 T 세포 및 적절한 변환 방법입니다. 세포는 유동 세포 분석을 위해 PE 크기 7개의 공주 항CD8, AF647 공주 항 CD3 및 BV 421 공주 방지 CD28과 함께 공동 염색하였다.CD8 T 세포의 약 70%가 CAR 발현을 나타내는 GFP를 공동 발현하였다. 또한 CD28 및 CD3를 공동 표현했습니다. 중요한 것은, 모든 GFP 양성 세포는 또한 I-Ag7 인슐린 BR3 테트라머와 공동 염색되어 세포 표면에 CAR의 발현을 나타내지만 대조테티머와는 달리 염색하였다.더욱이, 선별된 시험 및 제어 CAR T 세포는 각각 코그네이트 리간드를 발현하는 표적 세포와 공동 배양 후에만 높은 수준의 인터페론 감마를 분비하여, 이는 트랜스포메이트 세포가 모체 항체의 표적을 향한 CD8 이펙터 T 세포 표현형을 갖는것을 확인한다. 바이러스 생산자 세포의 변환, 1 차 CD8 T 세포의 격리 및 이러한 T 세포의 활성화는이 실험의 가장 중요한 단계이다. 건강한 활성화 된 T 세포와 적절한 시약이있는 이러한 T 세포의 전이가 있으면 유리한 결과를 보장합니다.이 방법은 다른 T 세포를 변환하는 데 사용할 수 있지만 특정 T 세포 유형에 맞게 사용자 지정해야 합니다. 이 프로토콜은 항원 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포 요법을 통해 제1형 당뇨병예방의 길을 열어준다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

생물 발광 박테리아를 사용하여 실시간으로 급성 폐렴 마우스 모델에서 폐렴 구균 독성 요인의 영향에 따라

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...