Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Denne studien ble støttet av JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, og SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes utdanning og action Award, og Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine ved Baylor College of Medicine. Cell-sortering ble støttet av flowcytometri og Cell sortering Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (S10RR024574 og P30CA125123). Alle peptid-MHC-tetramers ble innhentet fra NIH Tetramer Core Facility.

Mus ble opprettholdt under spesifikke patogen-frie forhold ved en transgene Mouse anlegget, og alle dyr eksperimenter ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Baylor College of Medicine dyr omsorg og bruk komiteen.
Merk: eksperimentet krever forberede viruset og T-cellene parallelt. Tabell 1 oppsummerer protokollen. Nøkkel reagensene og-buffere er oppført i materialfortegnelsen. Vi fokuserer på generering og utvidelse av CAR-T-celler rettet mot bes...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for produksjon av antigen-spesifikke CD8 CAR-T-celler ved retroviral Transduction. Den Transduction effektiviteten av vår protokoll er vanligvis høy, og robust uttrykk for bilen er generelt observert. Den utvidede CAR T-cellene beholder de essensielle funksjonene til de overordnede aktiverte T-cellene og de spesielle antistoff-og bruks egenskapene, og egner seg både for in vitro og in vivo. Vi har søkt AB-CAR CD8 T-celler i REPROGRAMING type 1 diabetes i NOD mus<sup clas...

Gitt den sannsynlige redusert risiko for uønskede off-målet effekter, antigen-spesifikke immun behandling (ASI) er lovende behandlinger for autoimmune sykdommer som T1D. Akkumulere bevis tyder på at immunresponser til (prepro) insulin kan være spesielt viktig i T1D1. I det siste tiåret, studier fra flere grupper, inkludert vår egen, sterkt tyder på at presentasjonen av en epitope inneholder insulin B kjede aminosyrer 9 til 23 av spesifikke MHC klasse II molekyler (B: 9-23/MHCII), spiller en viktig rolle i utviklingen av T1D i mus og mennesker2,3,4,5. Å selektivt målrette B: 9-23/MHCII kompleks, genererte vi et monoklonale antistoff, kalt mAb287, som har ingen kryss reaktivitet til hormonet insulin eller komplekser som inneholder andre peptider6. MAb287 blokkerer antigenpresentasjon in vitro, og ukentlig administrering av mAb287 til pre-diabetiker NOD mus forsinket utviklingen av T1D i 35% av den behandlede mus6. Å blokkere antigenpresentasjon in vivo, hyppige injeksjoner er vanligvis nødvendig for å opprettholde en høy sirkulerende konsentrasjon. Vi hypotetisk gjennomsnitt at vi kunne overvinne denne vanskeligheten ved å utnytte den høye spesifisitet av Ab287 å programmere T-celler, og dermed gi en forbedret antigen-spesifikke T celle terapi for T1D7.
Cytotoksisk T celler rapporteres å være i stand til å drepe sine mål hvis selv en enkelt kopi av deres beslektet ligand uttrykkes8,9,10. Således, B: 9-23/MHCII spesifikk CD8 T celler forventes å ha høyere effektivitet i å eliminere uønsket antigen presentasjonen enn forelder antistoff, som sannsynligvis må binde til flere komplekser på samme APC til å utøve sin effekt. Bil T celler har blitt brukt for behandling av flere menneskelige kreft11,12,13, og kan også være effektiv i autoimmunitet14. Men, CAR-T-celler med spesifisitet for patogene peptid-MHC komplekser har ikke så langt blitt brukt til å endre progresjon av T1D. Ved å bruke optimalisert CD8 T celle Transduction teknikk beskrevet nedenfor, har vi nylig demonstrert bevis på prinsippet om at dette faktisk representerer en levedyktig tilnærming7.
I denne protokollen skisserer vi en effektiv og strømlinjeformet Transduction og Utvidelses metode. Vår protokoll gjelder for andre studier som krever generering av mus CD8 CAR T-celler med høy effektivitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Type 1 diabetes (T1D) er preget av Holme-spesifikke autoimmunitet fører til beta celle ødeleggelse og absolutt tap av insulin produksjon. I den spontane ikke-overvektige diabetes (NOD) mus modell, er insulin det primære målet, og genetisk manipulering av disse dyrene for å fjerne en enkelt nøkkel insulin epitope forebygger sykdom. Dermed selektiv eliminering av profesjonelle antigen presentere celler (APCs) som bærer denne patogene epitope er en tilnærming for å hemme uønskede insulin-spesifikke autoimmune responser, og sannsynligvis har større translational potensial.
Chimeric antigen reseptorer (CARs) kan omdirigere T celler å selektivt målrette sykdomsfremkallende antigener. Denne teknikken er grunnleggende for nylige forsøk på å bruke mobilnettet engineering for adoptiv cellen terapi for å behandle flere kreft. I denne protokollen, beskriver vi en optimalisert T-Cell retrovirus (RV) Transduction og in vitro ekspansjon protokollen som genererer et høyt antall funksjonelle antigen-spesifikke CD8 CAR-T-celler som starter fra et lavt antall naive celler. Tidligere flere CAR-T celle protokoller har blitt beskrevet, men vanligvis med relativt lav Transduction effektivitet og celle levedyktighet etter Transduction. I kontrast gir vår protokoll opptil 90% Transduction effektivitet, og cellene som genereres kan overleve mer enn to uker in vivo og signifikant forsinke sykdomsutbruddet etter en enkelt infusjon. Vi gir en detaljert beskrivelse av cellen vedlikehold og Transduction protokoll, slik at de kritiske trinnene kan lett følges. Hele prosedyren fra primær celle isolasjon til CAR-uttrykk kan utføres innen 14 dager. Den generelle metoden kan brukes på en hvilken som helst mus sykdom modell der målet er kjent. Tilsvarende er det spesifikke programmet (målretting en patogene peptid/MHC klasse II-kompleks) gjelder for alle andre autoimmune sykdommer modell som et viktig kompleks har blitt identifisert.

Vanligvis er Transduction effektivitet ved hjelp av denne protokollen ~ 60-90%. I eksperimentet vist i Figur 3, før sortering ca, 70% av CD8 T-celler co-uttrykt GFP. De har også co-uttrykt CD28 og CD3 (figur 3c). Viktigere, alle de "test" GFP+ celler også co-BEISET med IAG7-B:R3 tetramers, men ikke med kontroll tetramer (Figur 4). Tilsvarende den sorterte test og kontroll CAR...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Denne artikkelen beskriver en protokoll for generering av antigen-spesifikke CD8 T-celler, og deres ekspansjon in vitro, med sikte på å gir et høyt antall funksjonelle T-celler for bruk in vitro og in vivo.

Høy-effektivitet generasjon av antigen-spesifikke primær mus cytotoksisk T celler for funksjonell testing i en autoimmun diabetes modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Denne protokollen lar deg generere et stort antall funksjonelle antigenspesifikke T-celler som er en ønsket sikker tilnærming i behandling av autoimmune sykdommer. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir deg en svært effektiv transduksjonsprosess og et stort antall funksjonelle T-celler. Denne teknikken kan utvides til å behandle type 1 diabetes og andre autoimmune sykdommer der antigener er kjent.Videre kan CAR T-celler være en lovende behandling for visse typer kreft. Denne metoden kan brukes til å generere immunceller som uttrykker andre CARs. Det er viktig å ha god akseptert teknikk, lese hele protokollen og planlegge hele eksperimentet på forhånd.Denne to uker lange protokollen inkluderer mini-trinn og suksess er avhengig av riktig ytelse for hvert trinn. Visuelle demonstrasjoner av denne metoden er avgjørende for elevene å følge riktig. Forbered Phoenix-celler for transinfeksjon som beskrevet i manuskriptet.Det er god praksis å markere sideveggen der medium vil bli lagt til og fjernet for å minimere blåser av celler. På dag null aspirerer supernatanten fra cellene og vask dem med fem milliliter PBS. Tilsett forsiktig syv milliliter med redusert serum medium dropwise til sideveggen av platen og overføre cellene tilbake til inkubatoren.Tilsett 1,5 milliliter med redusert serummedium til to 14 millimeter runde bunnpolypropylenrør. Tilsett 40 mikrometer transfeksjonsreagens til et av rørene og 15 mikrogram antistoff omdirigert CAR plasmid sammen med fem mikrogram emballasjeplasmid til den andre. Inkuber rørene ved romtemperatur i fem minutter, og tilsett deretter transfection reagens til plasmidrøret.Bland ved å forsiktig pipe løsningen opp og ned tre ganger og inkubere den ved romtemperatur i minst 20 minutter. Tilsett tre milliliter av blandingen til Phoenix-cellene og legg dem i en vevskulturinkubator. Etter fire til fem timer legge til en milliliter FCS til cellene og kultur dem over natten på 37 grader Celsius.På neste dag, fjern supernatant fra cellene og legg til fire milliliter med frisk prewarmed kultur medium. Høst viruset på dag to ved å samle viruset som inneholder medium fra Phoenix-cellene og filtrere det for å fjerne gjenværende celleavfall. Tilsett rekombinant human IL-2 lager til viruset for en endelig konsentrasjon på 200 internasjonale enheter per milliliter og bruk den umiddelbart for transduksjon.Tilsett fire milliliter friskt medium til Phoenix-cellene og legg dem i inkubatoren over natten. Gjenta virussamlingen neste dag for en ny transduksjon og kast cellene. En dag før seeding murine CD8 T celler, tilsett en milliliter av en blanding av anti-mus CD3 og CD28 antistoffer til hver brønn av en 24 brønnplate og inkubere platen over natten på fire grader Celsius.På dag null, høst musepleens og legg dem på en cellesil soaking i 10 milliliter PBS i en celle kultur rett på is. I en cellekulturhette, skjær hver milt i tre til fem stykker og bruk et sterilt stempel av en sprøyte for å presse vevet gjennom nettingen. Fjern forsiktig røde blodlegemer ved å bruke miltytter i en til fire fortynnede røde blodlegemer lysis buffer og inkubere dem ved romtemperatur i fem minutter og deretter fortynne 10 mikroliter av cellesuspensjonen med Trypan Blue for celletelling.Og pellet resten av cellene ved sentrifugering på 350 ganger g i syv minutter. Bruk en mus CD8 T celle isolasjon kit for å berike CD8 T celler og suspendere celle pellets i 400 mikroliter buffer med 100 mikroliter biotin antistoff cocktail per en ganger 10 til åttende celler. Bland cellefjæringen godt og inkuber den i fem minutter ved fire grader Celsius for å tillate antistoffbinding.Deretter legger du til 300 mikroliter merkingsbuffer og 200 mikroliter anti-biotin microbeads per gang 10 til de åttende cellene. Bland godt og inkuber i ytterligere 10 minutter ved fire grader Celsius. I mellomtiden setter du opp en separasjonskolonne på separatoren og vasker den med tre milliliter merkingsbuffer.Sett en 40 mikrometercellesil på toppen av en kolonne og send en milliliter av perlen og celleblandingen gjennom silen inn i separasjonskolonnen. Samle strømmen gjennom i en prechilled 15 milliliter rør og vaske kolonnen i henhold til produsentens retninger, samle avløpsvann i samme rør. Tell cellene og samle dem ved sentrifugering på 350 ganger g i fem minutter.Vask dem med to milliliter T-cellemedium og sentrifuge igjen. Deretter gjenbruke dem i prewarmed T celle medium i en konsentrasjon på 250, 000 til 500, 000 celler per milliliter. Vask de tidligere tilberedte CD3- og CD28-antistoffbelagte platene med én milliliter steril PBS tre ganger og tilsett to milliliter cellefjæring til hver brønn.Bruk en virvlende bevegelse for å dispensere celler jevnt. Som en kontroll, plate samme antall CD8 T-celler i en enkelt ikke-belagt brønn av platen og inkubere cellene ved 37 grader Celsius i en 10% karbondioksid gasstank inkubator i 48 timer. På dag én, forberede menneskelig fibronectin fragmentbelagte plater ved å legge til 0,5 milliliter fibronectin til brønnene av en 24-brønns plate og inkubere den over natten på fire grader Celsius.På neste dag, fjerne fibronectin løsning og legge til en milliliter på 2% BSA og PBS per brønn. Inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter og vask de behandlede brønnene med en milliliter steril PBS. Platen er klar til bruk etter at vaskoppløsningen er fjernet.Telle aktiverte CD8 T-celler ved hjelp av Trypan Blue. Samle dem ved sentrifugering. Og gjenbruk dem på fem millioner levedyktige celler per milliliter for transduksjon.Tilsett 100 mikroliter av den aktiverte CD8-cellefjæringen til hver brønn av fibronectinbelagt plate. Tilsett deretter 1,5 til to milliliter av det tidligere forberedte viruset som inneholder medium og bland ved hjelp av en virvlende bevegelse for å jevnt dispensere cellene. Forsegle platen i en Ziploc bag og sentrifuge den på 2, 000 ganger g i 90 minutter ved 37 grader Celsius.Fjern platen fra sentrifugen og ta den med til et biologisk sikkerhetsskap. Fjern plastposen forsiktig og sørg for at utsiden av platen ikke er forurenset med middels. Overfør platen til en 37 grader Celsius karbondioksid inkubator.Etter fire timer, fjern en milliliter medium fra hver brønn, bytt den ut med en milliliter forhåndswarmed komplett T-cellemedium og legg platen tilbake i inkubatoren. De kritiske aspektene ved denne protokollen er et høyt titervirus, sunne aktiverte T-celler og riktig transduksjonsmetode. Cellene ble co-farget med PE størrelse syv konjugert anti-CD8, AF647 konjugert anti-CD3, og BV 421 konjugert anti-CD28 for flyt cytometrisk analyse.Omtrent, 70% av CD8 T-cellene co-uttrykt GFP som indikerer CAR uttrykk. De uttrykte også CD28 og CD3. Viktigere, alle test GFP positive celler også co-farget med I-Ag7 insulin BR3 tetramers som indikerer uttrykk for CAR på celleoverflaten, men ikke med kontroll tetramer.Videre, den sorterte testen og kontroll CAR T celler hver utskilles høye nivåer av interferon gamma bare etter kokultur med målceller uttrykker sine cognate ligands som bekrefter at de transduserte cellene har en CD8 effektor T celle fenotype rettet mot målet for de overordnede antistoffene. Transduksjon av virusprodusentceller, isolering av primære CD8 T-celler og aktivering av disse T-cellene er de viktigste trinnene i dette eksperimentet. Å ha sunne aktiverte T-celler og transduksjon av disse T-cellene med passende reagenser sikrer gunstige resultater.Denne metoden kan brukes til å transdusere andre T-celler, men den må tilpasses for den spesifikke T-celletypen. Denne protokollen baner vei for forebygging av type 1 diabetes med antigenspesifikk kimerisk antigenreseptor T celleterapi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Endring av primære humane T celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Kunstig antigenpresenterende celler (KaAPC) for effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Nedbryting av humant antigen-spesifikke T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerende Leukocytter fra Mouse Skin Bruke Enzymatisk Digest og Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utvikling av stamcelle-avledet Antigen-spesifikke Regulatoriske T-cellene mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

I Vivo Analysen for påvisning av Antigen-spesifikke T-celle Cytolytic funksjon med en vaksinasjon modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...