Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, um prêmio de educação e ação de diabetes, e o fundo de lei Caroline Wiess para pesquisa em medicina molecular na Baylor College of Medicine. O Cell-Sorting foi apoiado pelo núcleo da citometria e da classificação da pilha na faculdade de medicina de Baylor com o financiamento do NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Todos os tetrâmeros do peptide-MHC foram obtidos da facilidade do núcleo de tetramer de NIH.

Os camundongos foram mantidos condições específicas livres de patógenos em uma instalação do rato transgênico, e todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina Baylor.
Observação: o experimento requer a preparação do vírus e as células T em paralelo. A tabela 1 resume o protocolo. Os reagentes e os bufferes chaves são alistados na tabela dos materiais...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Este protocolo descreve um método eficiente para produzir pilhas CD8 antígeno-específicas do CAR-T pela transdução retroviral. A eficiência de transdução do nosso protocolo é tipicamente alta, e a expressão robusta do CAR é geralmente observada. As pilhas de T do carro expandido mantêm as características essenciais das pilhas de T pai-ativadas, e da especificidade do anticorpo, e são apropriadas para in vitro e in vivo uso. Nós aplicamos pilhas do AB-carro CD8 T em reprogramação tipo-1 diabetes em ratos ...

Dado o provável risco reduzido de efeitos indesejados fora do alvo, as terapias imunes antígeno-específicas (ASI) são tratamentos prometedores para doenças auto-imunes tais como T1D. Evidências acumulantes sugerem que as respostas imunes à insulina (prepro) podem ser particularmente importantes na T1D1. Na última década, estudos de vários grupos, incluindo os nossos, sugerem fortemente que a apresentação de um epítopo contendo aminoácidos de cadeia de insulina B 9 a 23 por moléculas específicas de classe II de MHC (B: 9-23/MHCII), desempenha um papel importante no desenvolvimento de T1D em camundongos e humanos2,3,4,5. Para segmentar seletivamente o complexo B: 9-23/MHCII, geramos um anticorpo monoclonal, denominado mAb287, que não tem reatividade cruzada para a insulina hormonal ou complexos contendo outros peptídeos6. MAb287 bloqueia a apresentação do antígeno in vitro, e a administração semanal de mAb287 a camundongos NOD pré-diabéticos atrasou o desenvolvimento de T1D em 35% dos camundongos tratados6. Para obstruir a apresentação do antígeno in vivo, as injeções freqüentes são exigidas tipicamente a fim manter uma concentração de circulação elevada. Nós supor que nós poderíamos superar esta dificuldade tirando proveito da especificidade elevada de Ab287 para reprogramar pilhas de T, assim fornecendo uma terapia antígeno-específica melhorada da pilha de T para T1D7.
As células T citotóxicas são relatadas para serem capazes de matar seu alvo se até mesmo uma única cópia de seu ligante cognato é expressa8,9,10. Assim, B: as pilhas CD8 T específicas de 9-23/MHCII são esperadas ter uma eficiência mais elevada em eliminar a apresentação indesejada do antígeno do que o anticorpo do pai, que precisará provavelmente de ligar aos complexos múltiplos no mesmo APC para exercer seu efeito. As pilhas de T do carro foram usadas tratando cancros humanos múltiplos11,12,13, e podem igualmente ser eficaz na autoimunidade14. No entanto, as células CAR-T com especificidade para complexos peptídeos-MHC patogênicos ainda não foram utilizadas para modificar a progressão da T1D. Ao usar a técnica de transdução de células T CD8 otimizada descrita abaixo, demonstramos recentemente uma prova de princípio de que isso representa, de fato, uma abordagem viável7.
Neste protocolo, nós esboçamos um método eficiente e aerodinamizado da transdução e da expansão. Nosso protocolo é aplicável a outros estudos que exigem a geração de pilhas CD8 do carro T do rato com eficiência elevada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

O diabetes tipo 1 (T1D) é caracterizado por autoimunidade específica de Islet, levando à destruição de células beta e perda absoluta da produção de insulina. No modelo espontâneo do rato do diabetes não-obeso (nod), o insulin é o alvo preliminar, e a manipulação genética destes animais para remover um único epítopo mapeado chave da insulina impede a doença. Assim, a eliminação seletiva de pilhas de apresentação do antígeno profissional (APCs) que carregam este epítopo patogénico é uma aproximação para inibir as respostas auto-imunes insulin-específicas indesejadas, e tem provavelmente o maior potencial translacional.
Os receptores de antígeno Quimérico (CARs) podem redirecionar as células T para segmentar seletivamente antígenos causadores de doenças. Esta técnica é fundamental para tentativas recentes de usar a engenharia celular para terapia celular adotiva para tratar vários cânceres. Neste protocolo, nós descrevemos uma transdução aperfeiçoada do retrovírus de célula T (RV) e o protocolo in vitro da expansão que gera números elevados de pilhas CD8 antígeno-específicas funcionais do Car-T que partem de um baixo número de pilhas ingênuas. Os protocolos previamente múltiplos da pilha de CAR-T foram descritos, mas tipicamente com eficiência relativamente baixa da transdução e viabilidade da pilha depois da transdução. Em contrapartida, nosso protocolo fornece até 90% de eficiência de transdução, e as células geradas podem sobreviver mais de duas semanas in vivo e atrasar significativamente o início da doença após uma única infusão. Nós fornecemos uma descrição detalhada do protocolo da manutenção e da transdução da pilha, de modo que as etapas críticas possam facilmente ser seguidas. Todo o procedimento do isolamento da célula primária para a expressão CAR pode ser realizado dentro de 14 dias. O método geral pode ser aplicado a qualquer modelo de doença do mouse no qual o alvo é conhecido. Da mesma forma, a aplicação específica (visando um complexo de peptídeo patogênico/MHC classe II) é aplicável a qualquer outro modelo de doença auto-imune para o qual um complexo-chave foi identificado.

Tipicamente, a eficiência da transdução que usa este protocolo é ~ 60-90%. No experimento mostrado na Figura 3, antes de classificar aproximadamente, 70% das células T CD8 expressaram a GFP. Eles também coexpressaram CD28 e CD3 (Figura 3C). É importante ressaltar que todas as células GFP+ de "teste" também estão cocoradas com os tetramers iaG7-b: R3, mas não com o controle tetrâmero (<strong clas...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Este protocolo permite gerar um grande número de células T específicas de antígeno funcional que são uma abordagem segura desejada no tratamento de doenças autoimunes. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um processo de transdução altamente eficiente e um grande número de células T funcionais. Esta técnica pode ser estendida para tratar diabetes tipo 1 e outras doenças autoimunes nas quais os antígenos são conhecidos.Além disso, as células CAR T podem ser um tratamento promissor para certos tipos de câncer. Este método pode ser usado para gerar células imunes expressando outros CARs. É importante ter uma técnica bem aceita, ler todo o protocolo e planejar todo o experimento com antecedência.Este protocolo de duas semanas inclui mini-passos e o sucesso depende do desempenho adequado de cada etapa. Demonstrações visuais deste método são fundamentais para que os alunos sigam corretamente. Prepare as células de Phoenix para transfecção, como descrito no manuscrito.É uma boa prática marcar a parede lateral onde o meio será adicionado e removido para minimizar o desmendo as células. No dia zero aspirar o supernaente das células e lavá-los com cinco mililitros de PBS. Adicione cuidadosamente sete mililitros de soro reduzido médio dropwise à parede lateral da placa e transfira as células de volta para a incubadora.Adicione 1,5 mililitros de meio de soro reduzido a dois tubos de polipropileno de fundo redondo de 14 milímetros. Adicione 40 micrômetros de reagente de transfecção a um dos tubos e 15 microgramas de plasmídeo CAR redirecionado de anticorpos, juntamente com cinco microgramas de plasmídeo de embalagem para o outro. Incubar os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicionar reagente de transfecção ao tubo plasmídeo.Misture gentilmente a solução três vezes e incuba-a à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Adicione três mililitros da mistura às células de Phoenix e coloque-as em uma incubadora de cultura tecidual. Depois de quatro a cinco horas adicione um mililitro de FCS às células e cultue-as durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, remova o supernasce das células e adicione quatro mililitros de meio de cultura pré-armada fresco. Colher o vírus no segundo dia coletando o vírus contendo meio das células de Phoenix e filtrando-o para remover detritos de células residuais. Adicione estoque de IL-2 humano recombinante ao vírus para uma concentração final de 200 unidades internacionais por mililitro e use-o imediatamente para transdução.Adicione quatro mililitros de meio fresco às células de Phoenix e coloque-os na incubadora durante a noite. Repita a coleta de vírus no dia seguinte para uma segunda transdução e descarte as células. Um dia antes de semear células murine CD8 T, adicione um mililitro de uma mistura de anticorpos anti-mouse CD3 e CD28 a cada poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa durante a noite a quatro graus Celsius.No dia zero, colhe o baço do rato e coloca-os em um coador de células imersos em 10 mililitros de PBS em um prato de cultura celular no gelo. Em uma capa de cultura celular, corte cada baço em três a cinco pedaços e use um êmbolo estéril de uma seringa para pressionar o tecido através da malha de arame. Remova suavemente os glóbulos vermelhos reutilizando esplenócitos em um a quatro tampão de lise de células vermelhas diluídas e incubando-os à temperatura ambiente por cinco minutos e depois dilua 10 microliters da suspensão celular com Trypan Blue para contagem celular.E pelota o resto das células por centrifugação a 350 vezes g por sete minutos. Use um kit de isolamento celular CD8 T para enriquecer as células CD8 T e suspender as pelotas de células em 400 microliters de buffer com 100 microliters de coquetel de anticorpos biotina por uma vez 10 a oitava células. Misture bem a suspensão celular e incuba-a por cinco minutos a quatro graus Celsius para permitir a ligação de anticorpos.Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de rotulagem e 200 microliters de MicroEsferas Anti-Biotina por uma vez 10 às oitavas células. Misture bem e incubar por mais 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, configure uma coluna de separação no separador e lave-a com três mililitros de tampão de rotulagem.Coloque um coador de células de 40 micrômetros na parte superior de uma coluna e passe um mililitro da mistura de contas e células através do coador na coluna de separação. Colete o fluxo através de um tubo pré-15 mililitro e lave a coluna de acordo com as instruções do fabricante, coletando efluentes no mesmo tubo. Conte as células e colete-as por centrifugação a 350 vezes g por cinco minutos.Lave-os com dois mililitros de células T média e centrífuga novamente. Em seguida, resuspensá-los em meio de células T pré-armados em uma concentração de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave as placas revestidas de anticorpos CD3 e CD28 previamente preparadas com um mililitro de PBS estéril três vezes e adicione dois mililitros da suspensão celular a cada poço.Use um movimento de redemoinho para dispensar as células uniformemente. Como controle, plaque o mesmo número de células CD8 T em um único poço não revestido da placa e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de tanques de gás de 10% de dióxido de carbono por 48 horas. No primeiro dia, prepare as placas revestidas de fragmento de fibronectina humana adicionando 0,5 mililitros de fibronectina aos poços de uma placa de 24 poços e incubando-a durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, remova a solução de fibronectina e adicione um mililitro de 2%BSA e PBS por poço. Incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos e lavar os poços tratados com um mililitro de PBS estéril. A placa está pronta para uso após a remoção da solução de lavagem.Conte as células CD8 T ativadas usando Trypan Blue. Colecioná-los por centrifugação. E resuspensá-los em cinco milhões de células viáveis por mililitro para transdução.Adicione 100 microliters da suspensão celular CD8 ativada a cada poço da placa revestida de fibronectina. Em seguida, adicione 1,5 a dois mililitros do vírus previamente preparado contendo meio e misture usando um movimento de redemoinho para dispensar uniformemente as células. Sele a placa em um saco Ziploc e centrifuá-la a 2.000 vezes g por 90 minutos a 37 graus Celsius.Remova a placa da centrífuga e leve-a para um armário de segurança biológica. Retire cuidadosamente o saco plástico e certifique-se de que a parte externa da placa não esteja contaminada com meio. Transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius.Após quatro horas, remova um mililitro de meio de cada poço, substitua-o por um mililitro de meio de célula T completo pré-armado e coloque a placa de volta na incubadora. Os aspectos críticos deste protocolo são um vírus de alta titulação, células T ativadas saudáveis e o método de transdução apropriado. As células foram co-manchadas com pe tamanho sete anti-CD8 conjugado, AF647 conjugado anti-CD3, e BV 421 conjugado anti-CD28 para análise citométrica de fluxo.Aproximadamente, 70% das células CD8 T co-expressas GFP que indica expressão CAR. Eles também co-expressaram CD28 e CD3. É importante ressaltar que todas as células positivas do teste GFP também co-mancham com tetramers de insulina I-Ag7 BR3 que indica expressão de CAR na superfície celular, mas não com o tetramer de controle.Além disso, as células CAR T classificadas de teste e controle se secretaram altos níveis de gama interferon somente após a cocultura com células-alvo expressando seus ligantes cognatos que confirmam que as células transduzidas têm um fenótipo de células T efeito CD8 direcionados para o alvo dos anticorpos-pais. A transdução de células produtoras de vírus, o isolamento das células T primárias cd8 e a ativação dessas células T são os passos mais importantes deste experimento. Ter células T ativadas saudáveis e transdução dessas células T com reagentes apropriados garante resultados favoráveis.Este método pode ser usado para transdutar outras células T, mas deve ser personalizado para o tipo específico de célula T. Este protocolo abre caminho para a prevenção do diabetes tipo 1 com terapia celular receptor de antígeno t específica de antígeno.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...