Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
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Este estudio fue apoyado por las becas JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, y SRA-2-S-2018-648-S-B, un Premio a la Educación y Acción para la Diabetes, y el Fondo de Derecho Caroline Wiess para la Investigación en Medicina Molecular en Baylor College of Medicine. La clasificación celular fue apoyada por el Núcleo de Citometría y Clasificación Celular de Baylor College of Medicine con fondos del NIH (S10RR024574 y P30CA125123). Todos los tetrámeros péptidos-MHC se obtuvieron de la Instalación De Núcleo de Tetramer niH.

Los ratones se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos en una instalación transgénica de ratones, y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales del Baylor College of Medicine.
NOTA: El experimento requiere preparar el virus y las células T en paralelo. La Tabla 1 resume el protocolo. Los reactivos y búferes clave se enumeran en la Tabla de materiales</st...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Este protocolo describe un método eficiente para producir células CD8 CAR-T específicas para antígenos por transducción retroviral. La eficiencia de transducción de nuestro protocolo es típicamente alta, y la expresión robusta de la CAR se observa generalmente. Las células T CAR expandidas conservan las características esenciales de las células T activadas por los padres, y la especificidad de los anticuerpos, y son adecuadas tanto para el uso in vitro como in vivo. Hemos aplicado células T Ab-CAR CD8 en la r...

Dado el riesgo probablemente reducido de efectos fuera del objetivo no deseados, las terapias inmunitarias específicas de antígenos (ASI) son tratamientos prometedores para enfermedades autoinmunes como la T1D. La acumulación de evidencia sugiere que las respuestas inmunitarias a (prepro)insulina pueden ser particularmente importantes en T1D1. En la última década, estudios de múltiples grupos, incluido el nuestro, sugieren fuertemente que la presentación de un epítopo que contiene aminoácidos de cadena De insulina 9 a 23 por moléculas específicas de Clase II de MHC (B:9-23/MHCII), juega un papel importante en el desarrollo de T1D en ratones y humanos2,3,4,5. Para atacar selectivamente el complejo B:9-23/MHCII, generamos un anticuerpo monoclonal, llamado mAb287, que no tiene reactividad cruzada a la hormona insulina o complejos que contienen otros péptidos6. MAb287 bloquea la presentación de antígenos in vitro, y la administración semanal de mAb287 a ratones NOD prediabéticos retrasó el desarrollo de T1D en el 35% de los ratones tratados6. Para bloquear la presentación de antígeno in vivo, normalmente se requieren inyecciones frecuentes para mantener una alta concentración circulante. Hemos planteado la hipótesis de que podríamos superar esta dificultad aprovechando la alta especificidad de Ab287 para reprogramarlas células T, proporcionando así una terapia mejorada de células T específicas de antígenos para T1D 7.
Se ha informado que las células T citotóxicas son capaces de matar a su objetivo si incluso una sola copia de su ligando cognado se expresa8,9,10. Por lo tanto, se espera que las células T CD8 específicas B:9-23/MHCII tengan una mayor eficiencia en la eliminación de la presentación de antígenono no deseado que el anticuerpo principal, que probablemente tendrá que unirse a múltiples complejos en el mismo APC para ejercer su efecto. Las células T CAR se han utilizado para el tratamiento de múltiples cánceres humanos11,12,13, y también pueden ser eficaces en la autoinmunidad14. Sin embargo, las células CAR-T con especificidad para complejos patógenos de péptido-MHC no se han utilizado hasta ahora para modificar la progresión de la T1D. Mediante el uso de la técnica optimizada de transducción de células T CD8 que se describe a continuación, recientemente demostramos una prueba de principio de que esto realmente representa un enfoque viable7.
En este protocolo, delineamos un método de transducción y expansión eficiente y simplificado. Nuestro protocolo es aplicable a otros estudios que requieren la generación de células CD8 CAR T de ratón con alta eficiencia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

La diabetes tipo 1 (T1D) se caracteriza por una autoinmunidad específica de los islos que conduce a la destrucción de células beta y a la pérdida absoluta de la producción de insulina. En el modelo de ratón espontáneo de diabetes no obesa (NOD), la insulina es el objetivo principal, y la manipulación genética de estos animales para eliminar un único epítopo de insulina clave previene la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación selectiva de células que presentan antígenos profesionales (AAP) que llevan este epítopo patógeno es un enfoque para inhibir las respuestas autoinmunes no deseadas específicas de insulina, y probablemente tiene un mayor potencial traslacional.
Los receptores de antígeno quimérico (CAR) pueden redirigir las células T a diana selectivamente los antígenos causantes de la enfermedad. Esta técnica es fundamental para los recientes intentos de utilizar la ingeniería celular para la terapia celular adoptiva para tratar múltiples cánceres. En este protocolo, describimos una transducción optimizada del retrovirus de células T (RV) y un protocolo de expansión in vitro que genera un alto número de células CD8 CAR-T específicas del antígeno funcional a partir de un bajo número de células ingenuas. Anteriormente se han descrito múltiples protocolos de células CAR-T, pero típicamente con una eficiencia de transducción relativamente baja y viabilidad celular después de la transducción. Por el contrario, nuestro protocolo proporciona hasta un 90% de eficiencia de transducción, y las células generadas pueden sobrevivir más de dos semanas in vivo y retrasar significativamente la aparición de la enfermedad después de una sola perfusión. Proporcionamos una descripción detallada del mantenimiento celular y el protocolo de transducción, para que los pasos críticos se puedan seguir fácilmente. Todo el procedimiento desde el aislamiento de células primarias hasta la expresión CAR se puede realizar en un plazo de 14 días. El método general se puede aplicar a cualquier modelo de enfermedad del ratón en el que se conozca el objetivo. Del mismo modo, la aplicación específica (dirigida a un complejo patógeno de péptido/clase II de MHC) es aplicable a cualquier otro modelo de enfermedad autoinmune para el que se haya identificado un complejo clave.

Por lo general, la eficiencia de transducción mediante este protocolo es de 60-90 %. En el experimento mostrado en la Figura3, antes de ordenar aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresaron GFP. También expresaron CD28 y CD3 (Figura3C). Es importante destacar que todas las células GFP+ de "prueba" también co-teñidas con los tetrámeros IAg7-B:R3, pero no con el tetrámero de control (Figur...

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High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Este protocolo le permite generar un gran número de células T funcionales específicas del antígeno que son un enfoque seguro deseado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes. La principal ventaja de esta técnica es que le proporciona un proceso de transducción altamente eficiente y un gran número de células T funcionales. Esta técnica se puede ampliar para tratar la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes en las que se conocen los antígenos.Además, los células T CAR pueden ser un tratamiento prometedor para ciertos tipos de cáncer. Este método se puede utilizar para generar células inmunitarias que expresen otros CAR. Es importante tener una buena técnica aceptada, leer todo el protocolo y planificar todo el experimento con antelación.Este protocolo de dos semanas de duración incluye mini-pasos y el éxito depende del rendimiento adecuado de cada paso. Las demostraciones visuales de este método son fundamentales para que los alumnos las sigan correctamente. Prepare las células Phoenix para la transfección como se describe en el manuscrito.Es una buena práctica marcar la pared lateral donde se agregará y eliminará el medio para minimizar el soplado de las células. En el día cero aspirar el sobrenadante de las células y lavarlos con cinco mililitros de PBS. Agregue cuidadosamente siete mililitros de medio sérico reducido a la pared lateral de la placa y transfiera las células de vuelta a la incubadora.Añadir 1,5 mililitros de medio sérico reducido a dos tubos de polipropileno de fondo redondo de 14 milímetros. Añadir 40 micrómetros de reactivo de transfección a uno de los tubos y 15 microgramos de anticuerpos redirigidos plásmido CAR junto con cinco microgramos de plásmido de envase al otro. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego añadir reactivo de transfección al tubo de plásmido.Mezclar en pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo tres veces e incubarla a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Añadir tres mililitros de la mezcla a las células Phoenix y colocarlos en una incubadora de cultivo de tejido. Después de cuatro a cinco horas añadir un mililitro de FCS a las células y cultivarlos durante la noche a 37 grados Celsius.Al día siguiente, retire el sobrenadante de las células y agregue cuatro mililitros de medio de cultivo precalificado fresco. Cosecha el virus el segundo día recogiendo el medio que contiene el virus de las células Phoenix y filtrándolo para eliminar los desechos celulares residuales. Añadir acciones humanas IL-2 recombinantes al virus para una concentración final de 200 unidades internacionales por mililitro y utilizarla inmediatamente para la transducción.Agregue cuatro mililitros de medio fresco a las células Phoenix y colóquelos en la incubadora durante la noche. Repita la recolección de virus al día siguiente para una segunda transducción y deseche las células. Un día antes de sembrar células T8 murinas, añadir un mililitro de una mezcla de anticuerpos antiratón CD3 y CD28 a cada pozo de una placa de 24 pozos e incubar la placa durante la noche a cuatro grados Celsius.En el día cero, cosecha bazos de ratón y colóquelos en un colador celular empapando en 10 mililitros de PBS en un plato de cultivo celular sobre hielo. En una capucha de cultivo celular, corte cada bazo en tres a cinco piezas y use un émbolo estéril de una jeringa para presionar el tejido a través de la malla de alambre. Retire suavemente los glóbulos rojos resuspendiendo los espleocitos en un oto amortiguador de lelisis de células rojas diluidos e incubarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos y luego diluya 10 microlitros de la suspensión celular con Trypan Blue para el recuento de células.Y pele el resto de las células centrifugando a 350 veces g durante siete minutos. Utilice un kit de aislamiento de células T CD8 de ratón para enriquecer las células T CD8 y suspender los pellets celulares en 400 microlitros de tampón con 100 microlitros de cóctel de anticuerpos de biotina por uno por 10 a las células octavas. Mezcle bien la suspensión celular e icleine durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados para permitir la unión de anticuerpos.Luego agregue 300 microlitros de tampón de etiquetado y 200 microlitros de micro-biotina MicroBeads por uno por 10 a las octavas células. Mezclar bien e incubar durante otros 10 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras tanto, configure una columna de separación en el separador y lávela con tres mililitros de tampón de etiquetado.Coloque un colador celular de 40 micrómetros en la parte superior de una columna y pase un mililitro de la mezcla de cordón y célula a través del colador en la columna de separación. Recoger el flujo a través de un tubo de 15 mililitros prechilled y lavar la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante, recogiendo efluentes en el mismo tubo. Contar las células y recogerlas por centrifugación a 350 veces g durante cinco minutos.Lávelos con dos mililitros de medio de célula t y centrífuga de nuevo. Luego resuspenderlos en medio de células T precalentadas a una concentración de 250.000 a 500.000 células por mililitro. Lave las placas recubiertas de anticuerpos CD3 y CD28 previamente preparadas con un mililitro de PBS estéril tres veces y agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada pozo.Utilice un movimiento de remolino para dispensar las células uniformemente. Como control, vajilla el mismo número de células T CD8 en un único pozo no recubierto de la placa e incuba las células a 37 grados Celsius en una incubadora de tanques de gas de dióxido de carbono del 10% durante 48 horas. En el primer día, preparar placas recubiertas de fragmentos de fibronectina humana añadiendo 0,5 mililitros de fibronectina a los pozos de una placa de 24 pozos e incubando durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, retire la solución de fibronectina y agregue un mililitro de 2%BSA y PBS por pozo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos y lavar los pozos tratados con un mililitro de PBS estéril. La placa está lista para usar después de retirar la solución de lavado.Cuente las células T CD8 activadas usando Trypan Blue. Recógelos por centrifugación. Y los resuspend a cinco millones de células viables por mililitro para la transducción.Agregue 100 microlitros de la suspensión de células CD8 activadas a cada pozo de la placa recubierta de fibronectina. Luego agregue 1.5 a dos mililitros del virus previamente preparado que contiene el medio y mezcle usando un movimiento de remolino para dispensar uniformemente las células. Selle la placa en una bolsa Ziploc y centríféquela a 2.000 veces g durante 90 minutos a 37 grados centígrados.Retire la placa de la centrífuga y lléela a un armario de seguridad biológica. Retire con cuidado la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con el medio. Transfiera la placa a una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Centígrados.Después de cuatro horas, retire un mililitro de medio de cada pozo, reemplácelo por un mililitro de medio de célula T completo preadmanido y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Los aspectos críticos de este protocolo son un virus de alto título, células T activadas en buen estado y el método de transducción adecuado. Las células se teñiron conjuntamente con el tamaño de PE siete conjugados anti-CD8, AF647 conjugado anti-CD3, y BV 421 conjugado anti-CD28 para el análisis citométrico de flujo.Aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresadas GFP que indica la expresión CAR. También co-expresaron CD28 y CD3. Es importante destacar que todas las células positivas de GFP de prueba también se han cotumizado con tetrámeros I-Ag7 insulina BR3, lo que indica la expresión de CAR en la superficie celular pero no con el tetrómero de control.Además, las células T DE CAR de prueba y control ordenadas secretaron altos niveles de interferón gamma sólo después de la cocultura con células diana que expresan sus ligandos cognosos, lo que confirma que las células transducidas tienen un fenotipo de células T efector CD8 dirigido hacia el objetivo de los anticuerpos primarios. La transducción de células productoras de virus, el aislamiento de las células T CD8 primarias y la activación de estas células T son los pasos más importantes de este experimento. Tener células T activadas sanas y transducción de estas células T con reactivos adecuados asegura resultados favorables.Este método se puede utilizar para transducir otras células T, pero debe personalizarse para el tipo de celda T específico. Este protocolo allana el camino para la prevención de la diabetes tipo 1 con la terapia de células T del receptor de antígeno específico del antígeno.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial células presentadoras de antígenos (KaAPC) para la utilización eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; El agotamiento de células T humanas específicas de antígeno

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...