Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Denna studie stöddes av JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, och SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes utbildning och åtgärder Award, och Caroline Wiess Law Fund för forskning inom molekylär medicin vid Baylor College of Medicine. Cell sortering stöddes av Cytometry och cell sortering kärna vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (S10RR024574 och P30CA125123). Alla peptid-MHC tetramer erhölls från NIH tetramer Core facility.

Möss upprätthölls under särskilda patogenfria förhållanden vid en transgen mus anläggning, och alla djurförsök utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Baylor College of Medicine djuromsorg och användnings kommitté.
Anmärkning: experimentet kräver att förbereda viruset och T-celler parallellt. I tabell 1 sammanfattas protokollet. Nyckelreagenser och buffertar listas i material tabellen. Vi fokuserar på generering och utbyggnad av bil-...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att producera antigen-specifika CD8 CAR-T-celler genom antiretrovirala transduktion. Transduktionseffektiviteten i vårt protokoll är typiskt hög, och robust uttryck för bilen är i allmänhet observeras. De utökade bil T-cellerna behåller de viktigaste funktionerna hos de moder-aktiverade T-cellerna och antikroppselektivitet, och lämpar sig för både in vitro-och in vivo-användning. Vi har tillämpat AB-bil CD8 T celler i reprogramming typ 1 diabetes i NOD möss<s...

Med tanke på den sannolika minskade risken för oönskade off-Target effekter, antigen-specifika immunterapier (ASI) är lovande behandlingar för autoimmuna sjukdomar som T1D. Ackumulerande bevis antyder att immunsvar till (prepro) insulin kan vara särskilt viktigt i T1D1. Under det senaste decenniet, studier från flera grupper, inklusive vår egen, starkt tyder på att presentationen av en epitop innehållande insulin B-kedjan aminosyror 9 till 23 av specifika MHC klass II molekyler (B: 9-23/MHCII), spelar en viktig roll i utvecklingen av T1D i möss och människor2,3,4,5. För att selektivt inrikta sig på B: 9-23/MHCII-komplexet genererade vi en monoklonal antikropp, kallad mAb287, som inte har någon kors reaktivitet till hormonet insulin eller komplex som innehåller andra peptider6. MAb287 blockerar antigen presentation in vitro, och veckovis administrering av mAb287 till pre-diabetiker NOD möss fördröjde utvecklingen av T1D i 35% av de behandlade möss6. För att blockera antigen presentation in vivo krävs ofta injektioner för att bibehålla en hög cirkulerande koncentration. Vi hypotes om att vi kunde övervinna denna svårighet genom att dra nytta av den höga specificitet Ab287 att programmera T-celler, vilket ger en förbättrad antigen-specifik T-cellterapi för T1D7.
Cytotoxiska T-celler rapporteras kunna döda sina mål om ens en enda kopia av deras besläktat ligand uttrycks8,9,10. Sålunda, B: 9-23/MHCII specifika CD8 T celler förväntas ha högre effektivitet i att eliminera oönskade antigen presentationen än den överordnade antikroppen, som sannolikt kommer att behöva binda till flera komplex på samma APC att utöva sin effekt. Bil T-celler har använts för behandling av flera mänskliga cancerformer11,12,13, och kan också vara effektiv i autoimmunitet14. Emellertid, CAR-T-celler med specificitet för patogena peptid-MHC-komplex har hittills inte använts för att ändra utvecklingen av T1D. Genom att använda den optimerade CD8 T cell signaltransduktion teknik som beskrivs nedan, vi nyligen visat bevis för principen att detta verkligen utgör en livskraftig metod7.
I detta protokoll skisserar vi en effektiv och strömlinjeformad transduktion och expansions metod. Vårt protokoll är tillämplig på andra studier som kräver generering av mus CD8 bil T-celler med hög verkningsgrad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Typ 1-diabetes (T1D) kännetecknas av Holmen-specifik autoimmunitet leder till beta cell förstörelse och absolut förlust av insulinproduktion. I den spontana icke-feta diabetes (NOD) musmodell, insulin är det primära målet, och genetisk manipulation av dessa djur för att ta bort en enda nyckel insulin epitop förhindrar sjukdom. Sålunda, selektiv eliminering av professionella antigen presenterande celler (APCs) med denna patogena epitop är ett sätt att hämma oönskade insulinspecifika autoimmuna reaktioner, och sannolikt har större translationell potential.
Chimeric antigen receptorer (bilar) kan omdirigera T-celler för att selektivt rikta sjukdomsframkallande antigener. Denna teknik är grundläggande för de senaste försöken att använda cellulära teknik för adoptiv cellterapi för att behandla flera cancerformer. I detta protokoll, beskriver vi en optimerad T-cell retrovirus (RV) signaltransduktion och in vitro expansions protokoll som genererar ett stort antal funktionella antigen-specifika CD8 bil-T-celler från ett lågt antal naiva celler. Tidigare har flera bil-T cell protokoll beskrivits, men typiskt med relativt låg transduktionseffektivitet och cellernas lönsamhet efter transduktion. I kontrast, vårt protokoll ger upp till 90% signaltransduktion effektivitet, och de celler som genereras kan överleva mer än två veckor in vivo och signifikant fördröja sjukdomsdebut efter en enda infusion. Vi ger en detaljerad beskrivning av cell underhåll och transduktionsprotokoll, så att de kritiska stegen lätt kan följas. Hela proceduren från primär cell isolering till bil uttryck kan utföras inom 14 dagar. Den generella metoden kan tillämpas på alla mus sjukdomsmodeller där målet är känt. På samma sätt är den specifika tillämpningen (som riktar sig till en patogena peptid/MHC klass II-komplex) tillämplig på alla andra autoimmuna sjukdomsmodeller för vilka ett nyckel komplex har identifierats.

Normalt är transduktionseffektiviteten med detta protokoll ~ 60-90%. I experimentet som visas i figur 3, före sortering cirka, 70% av CD8 T-celler Co-uttryckte GFP. De också Co-uttryckte CD28 och CD3 (figur 3c). Viktigt är att alla "test" GFP+ celler också samfärgas med IAG7-b:R3 tetramers, men inte med kontroll Tetramer (figur 4). På samma sätt, den sorterade test och k...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Denna artikel beskriver ett protokoll för generering av antigen-specifika CD8 T-celler, och deras expansion in vitro, i syfte att ge ett stort antal funktionella T-celler för användning in vitro-och in vivo.

Högeffektiv generering av antigen-specifika primära mus cytotoxiska T-celler för funktionell testning i en autoimmun diabetes modell

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Detta protokoll kan du generera ett stort antal funktionella antigen-specifika T-celler som är en önskad säker metod vid behandling av autoimmuna sjukdomar. Den största fördelen med denna teknik är att den ger dig en mycket effektiv transduktionsprocess och ett stort antal funktionella T-celler. Denna teknik kan utvidgas till att behandla typ 1-diabetes och andra autoimmuna sjukdomar där antigener är kända.Vidare kan CAR T-celler vara en lovande behandling för vissa typer av cancer. Denna metod kan användas för att generera immunceller som uttrycker andra CARs. Det är viktigt att ha bra accepterad teknik, läsa hela protokollet och planera hela experimentet i förväg.Detta två veckor långa protokoll innehåller mini-steg och framgång är beroende av korrekt prestanda för varje steg. Visuella demonstrationer av denna metod är avgörande för att inlärarna ska kunna följa rätt. Förbered Phoenix-celler för transfektion enligt beskrivningen i manuskriptet.Det är god praxis att markera sidoväggen där medium kommer att läggas till och tas bort för att minimera blåser av celler. På dag noll aspirera supernatanten från cellerna och tvätta dem med fem milliliter PBS. Tillsätt försiktigt sju milliliter reducerat serum medium dropwise till plattans sidovägg och för över cellerna tillbaka till inkubatorn.Tillsätt 1,5 milliliter av reducerat serum medium till två 14 millimeter rund botten polypropylen rör. Lägg till 40 mikrometer transfektionsreagens till ett av rören och 15 mikrogram antikropp omdirigerad CAR plasmid tillsammans med fem mikrogram förpackningar plasmid till den andra. Inkubera rören i rumstemperatur i fem minuter och tillsätt sedan transfektionsreagens till plasmidröret.Blanda genom att försiktigt pipettera lösningen upp och ner tre gånger och inkubera den i rumstemperatur i minst 20 minuter. Tillsätt tre milliliter av blandningen till Phoenix cellerna och placera dem i en vävnad kultur inkubator. Efter fyra till fem timmar lägga till en milliliter av FCS till cellerna och odla dem över natten på 37 grader Celsius.På nästa dag, ta bort supernatanten från cellerna och tillsätt fyra milliliter färskt förvärmda odlingsmedium. Skörda viruset på dag två genom att samla in viruset som innehåller medium från Phoenix celler och filtrera den för att ta bort kvarvarande cell skräp. Lägg till rekombinanta mänskliga IL-2 lager till viruset för en slutlig koncentration av 200 internationella enheter per milliliter och använda den omedelbart för transduktion.Tillsätt fyra milliliter färskt medium till Phoenix cellerna och placera dem i inkubatorn över natten. Upprepa virusinsamlingen nästa dag för en andra transduktion och kasta cellerna. En dag före sådd murine CD8 T-celler, tillsätt en milliliter av en blandning av anti-mus CD3 och CD28 antikroppar mot varje brunn av en 24 brunnsplatta och inkubera plattan över natten i fyra grader Celsius.På dag noll, skörda mus mjälte och lägg dem på en cell sil blötläggning i 10 milliliter PBS i en cell kultur skålen på is. I en cellkultur huva, skär varje mjälte i tre till fem bitar och använda en steril kolv av en spruta för att trycka vävnaden genom trådnätet. Ta försiktigt bort röda blodkroppar genom resuspending splenocytes i en till fyra utspädd röd cell lys buffert och inkubera dem i rumstemperatur i fem minuter sedan späda 10 mikroliter av cellen suspension med Trypan Blue för cellräkning.Och pellet resten av cellerna genom centrifugering vid 350 gånger g i sju minuter. Använd en mus CD8 T cell isolering kit för att berika CD8 T-celler och upphäva cell pellets i 400 mikroliter av buffert med 100 mikroliter av biotin antikropp cocktail per en gånger 10 till den åttonde celler. Blanda cellupphängningen väl och inkubera den i fem minuter vid fyra grader Celsius för att möjliggöra antikroppsbindning.Lägg sedan till 300 mikroliter av märkningsbuffert och 200 mikroliter av Anti-Biotin MicroBeads per en gånger 10 till de åttonde cellerna. Blanda väl och inkubera i ytterligare 10 minuter vid fyra grader Celsius. Under tiden, inrätta en separation kolumn på avgränsaren och tvätta den med tre milliliter märkning buffert.Sätt en 40 mikrometer cell sil på toppen av en kolumn och passera en milliliter av pärla och cell blandningen genom silen i separationskolumnen. Samla flödet genom i en prechilled 15 milliliter rör och tvätta kolumnen enligt tillverkarens anvisningar, samla spillvatten i samma rör. Räkna cellerna och samla dem genom centrifugering vid 350 gånger g i fem minuter.Tvätta dem med två milliliter T-cellmedium och centrifug igen. Sedan resuspend dem i förvärmda T-cell medium vid en koncentration av 250, 000 till 500, 000 celler per milliliter. Tvätta de tidigare beredda CD3- och CD28-antikroppsbelagda plattorna med en milliliter steril PBS tre gånger och tillsätt två milliliter av cellupphängningen till varje brunn.Använd en virvlande rörelse för att dosera celler jämnt. Som en kontroll, platta samma antal CD8 T-celler i en enda icke-belagd brunn av plattan och inkubera cellerna på 37 grader Celsius i en 10%koldioxid gastank inkubator i 48 timmar. På dag ett, förbereda mänskliga fibronectin fragment belagda plattor genom att lägga till 0,5 milliliter fibronectin till brunnarna i en 24-brunns platta och inkubera den över natten vid fyra grader Celsius.Nästa dag tar du bort fibronectinlösningen och lägger till en milliliter på 2 %BSA och PBS per brunn. Inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter och tvätta de behandlade brunnarna med en milliliter steril PBS. Plattan är klar att användas efter att tvätta lösningen tagits bort.Räkna de aktiverade CD8 T-cellerna med trypanblå. Samla dem genom centrifugering. Och resuspend dem på fem miljoner livskraftiga celler per milliliter för transduktion.Tillsätt 100 mikroliter av den aktiverade CD8-cellupphängningen till varje brunn av den fibronectinbelagda plattan. Tillsätt sedan 1,5 till två milliliter av det tidigare beredda viruset som innehåller medium och blanda med hjälp av en virvlande rörelse för att jämnt dosera cellerna. Försegla plattan i en Ziploc väska och centrifug den på 2, 000 gånger g i 90 minuter vid 37 grader Celsius.Ta bort plattan från centrifugen och ta den till ett biologiskt säkerhetsskåp. Ta försiktigt bort plastpåsen och se till att plattans utsida inte kontamineras med medium. Överför plattan till en 37 grader Celsius koldioxid inkubator.Efter fyra timmar, ta bort en milliliter medium från varje brunn, ersätta den med en milliliter av förvärmda komplett T-cell medium och lägg plattan tillbaka i inkubatorn. De kritiska aspekterna av detta protokoll är ett hög titervirus, friska aktiverade T-celler och lämplig transduktionsmetod. Celler var co-färgas med PE storlek sju konjugerade anti-CD8, AF647 konjugerat anti-CD3 och BV 421 konjugerad anti-CD28 för flöde cytometriska analys.Ungefär, 70%av CD8 T-celler co-uttryckt GFP som anger CAR uttryck. De var också med och uttryckte CD28 och CD3. Viktigt, alla testet GFP positiva celler också co-färgade med I-Ag7 insulin BR3 tetramers som indikerar uttryck för CAR på cellytan men inte med kontroll tetramer.Vidare, den sorterade test och kontroll CAR T-celler varje utsöndras höga nivåer av interferon gamma först efter kokultur med målceller uttrycka sina cognate ligander som bekräftar att de transduced cellerna har en CD8 effektor T cell fenotyp riktad mot målet för de överordnade antikroppar. Transduktion av virusproducentceller, isolering av primära CD8 T-celler och aktivering av dessa T-celler är de viktigaste stegen i detta experiment. Med friska aktiverade T-celler och transduktion av dessa T-celler med lämpliga reagenser säkerställer fördelaktiga resultat.Den här metoden kan användas för att transduce andra T-celler men det måste anpassas för den specifika T-celltypen. Detta protokoll banar väg för förebyggande av typ 1 diabetes med antigen-specifika chimär antigen receptor T cell terapi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Beredning och användning av HIV-1 infekterade Primär CD4 + T-celler som målceller i Natural Cytotoxiska Killer Cell analyser

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i realtid konsekvens av Pneumococcal Virulensfaktorer i en akut Mus Lunginflammation Modell Använda självlysande bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificiell antigenpresenterande celler (KaAPC) för effektiv<em&gt; In Vitro</em&gt; Utarmning av humant antigen-specifika T-celler

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Utveckling av stamcellshärledda antigen-specifika regulatoriska T-celler mot autoimmunitet

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...