Name: high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

Bu çalışma JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B ve SRA-2-S-2018-648-S-B, Diyabet Eğitim ve Eylem Ödülü ve Baylor College of Medicine'de Moleküler Tıp Araştırma Caroline Wiess Hukuk Fonu tarafından desteklenmiştir. Hücre sıralama nih (S10RR024574 ve P30CA125123) finansmanı ile Baylor Tıp Koleji'nde Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek tarafından desteklendi. Tüm peptid-MHC tetramerleri NIH Tetramer Çekirdek Tesisi'nden elde edilmiştir.

Fareler transgenik fare tesisinde belirli patojensiz koşullar altında muhafaza edildi ve tüm hayvan deneyleri Baylor Tıp Fakültesi hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapıldı.
NOT: Deney, virüs ve T hücrelerinin paralel olarak hazırlanmasını gerektirir. Tablo 1 protokolü özetler. Anahtar reaktifler ve arabellekler MalzemelerTablosunda listelenir. Bu protokoldeki belirli ADC popülasyonlarını hedef...

<ol>
	<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+Diabetes.">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li><li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove:+theory+becomes+reality.">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li><li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice.">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li><li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4++T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+(NOD)+mouse.">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li><li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected,+weak+binding+register.">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes.">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II:peptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes.">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li><li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells.">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells.">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li><li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors.">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li><li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes.">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li><li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice.">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li><li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunochemistry in practice. , (1996).</li><li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytes: a practical approach. , (2000).</li><li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li><li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons.">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li><li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse.">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).</li><li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice.">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li><li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways.">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li><li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules.">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li><li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides.">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li><li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+(DELFIA)+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection.">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay &amp; Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li></ol>

Bu protokol retroviral transdüksiyon ile antijene özgü CD8 CAR-T hücreleri üretmek için etkili bir yöntem açıklar. Protokolümüzün transdüksiyon verimliliği genellikle yüksektir ve CAR'ın sağlam ifadesi genellikle gözlenir. Genişletilmiş CAR T hücreleri üst-aktive T hücrelerinin temel özelliklerini korumak, ve antikor özgüllüğü, ve in vitro ve in vivo kullanım için hem uygundur. Biz NOD farelerde Tip 1 Diyabet yeniden programlanmasında Ab-CAR CD8 T hücreleri uyguladık7</...

İstenmeyen hedef dışı etkilerin olası azaltılmış risk göz önüne alındığında, antijene özgü immün tedaviler (ASI) T1D gibi otoimmün hastalıklar için umut verici tedaviler vardır. Kanıt birikmesi( prepro)insülin immün yanıtların T1D 1'de özellikle önemli olabileceğini düşündürmektedir. Son on yılda, bizimki de dahil olmak üzere birden fazla gruptan yapılan çalışmalar, belirli MHC sınıf II molekülleri (B:9-23/MHCII) tarafından 9 ila 23 arasında insülin B zinciri amino asitleriçeren bir epitopun sunumunun T1D'nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını kuvvetle göstermektedir. fareler ve insanlar2,3,4,5. Seçici B:9-23/MHCII kompleksi hedef için, biz bir monoklonal antikor üretti, mAb287 adlı, hormon insülin veya kompleksleri diğer peptidler içeren çapraz reaktivite vardır6. MAb287 bloklar antijen sunum in vitro, ve pre-diyabetik NOD fareler için mAb287 haftalık uygulama tedavi farelerin% 35 T1D gelişimini geciktirdi6. In vivo antijen sunumengellemek için, sık enjeksiyonları genellikle yüksek sirkülasyon konsantrasyonu korumak için gereklidir. Biz t hücreleri yeniden programlamak için Ab287 yüksek özgüllük yararlanarak bu zorluğun üstesinden gelebilir hipotez, böylece T1D için geliştirilmiş bir antijen-spesifik T hücre tedavisi sağlayan7.
Sitotoksik T hücrelerinin biliş likörlerinin tek bir kopyası bile8,9,10olarak ifade edilirse hedeflerini öldürebildiği bildirilir. Böylece, B:9-23/MHCII spesifik CD8 T hücrelerinin, etkisini uygulamak için aynı APC'de birden fazla komplekse bağlanması gereken ana antikordan daha istenmeyen antijen sunumunu ortadan kaldırmada daha yüksek verimliliğe sahip olması beklenmektedir. CAR T hücreleri birden fazla insan kanseri tedavisinde kullanılmıştır11,12,13, ve aynı zamanda otoimmünite etkili olabilir14. Ancak, patojenik peptid-MHC kompleksleri için özgüllüğü olan CAR-T hücreleri şimdiye kadar T1D ilerlemesini değiştirmek için kullanılmamıştır. Aşağıda açıklanan en iyi şekilde optimize edilmiş CD8 T hücre transdüksiyon tekniğini kullanarak, son zamanlarda bunun gerçekten uygulanabilir bir yaklaşımı temsil ettiğini nispatinin kanıtını gösterdik7.
Bu protokolde, verimli ve modern bir transdüksiyon ve genişletme yöntemini özetliyoruz. Protokolümüz yüksek verimlilikte fare CD8 CAR T hücrelerinin oluşumunu gerektiren diğer çalışmalar için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>50 uM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; RACE PCR</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD28 antibodies</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0281-86</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD3e antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>final concentration at 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554410</td>
			<td>Working concentration at 0.5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free Maxi-Prep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Final 50 &#181;g/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated FCS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Final 10% FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAg7-insulin P8E tetramer-BV421</td>
			<td>NIH tetramer Facility at Emory</td>
			<td>per approval</td>
			<td>Working concentration at 6 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51500056</td>
			<td>Final concentraion is 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miletenyi Biotec Inc</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5000U/ml)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070063</td>
			<td>50 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoenix-ECO cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMIG II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-IRES-GFP II</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse IFN-&#947;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551216</td>
			<td>Working concentration at 3 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RetroNectin</td>
			<td>Takara</td>
			<td>T100A</td>
			<td>Working concentration at 50 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td>Final concentration at 200 IU/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>407-ML-005</td>
			<td>Final concentration at 0.5ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency generation of antigen-specific primary mouse cytotoxic t cells for functional testing in an autoimmune diabetes model

Tip 1 Diyabet (T1D) beta hücre yıkımı ve insülin üretiminin mutlak kaybına yol açan adacık spesifik otoimmünite ile karakterizedir. Spontan obez olmayan diyabet (NOD) fare modelinde, insülin birincil hedeftir ve tek bir anahtar insülin epitop kaldırmak için bu hayvanların genetik manipülasyon hastalığı önler. Bu nedenle, bu patojenik epitop taşıyan profesyonel antijen sunan hücrelerin seçici ortadan kaldırılması (AKO'lar) istenmeyen insülin spesifik otoimmün yanıtları inhibe etmek için bir yaklaşımdır, ve büyük olasılıkla daha büyük çeviri potansiyeline sahiptir.
Şimerik antijen reseptörleri (CAR) seçici hastalık neden antijenleri hedef T hücreleri yönlendirebilirsiniz. Bu teknik, birden fazla kanser tedavisinde benimseyen hücre tedavisi için hücresel mühendislik kullanmak için son girişimleri için temeldir. Bu protokolde, düşük sayıda naif hücreden başlayarak yüksek sayıda fonksiyonel antijene özgü CD8 CAR-T hücresi üreten optimize edilmiş bir T-hücre retrovirüsü (RV) transdüksiyonu ve in vitro genleşme protokolünü açıklıyoruz. Daha önce birden fazla CAR-T hücre protokolü tanımlanmıştır, ancak genellikle transdüksiyon sonrası nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve hücre canlılığı ile. Buna karşılık, protokolümüz %90'a kadar transdüksiyon verimliliği sağlar ve üretilen hücreler iki haftadan fazla invivo hayatta kalabilir ve tek bir infüzyon dan sonra hastalığı önemli ölçüde geciktirebilir. Kritik adımların kolayca izleilebilmeleri için hücre bakım ve transdüksiyon protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Birincil hücre yalıtımından CAR ifadesine kadar tüm işlem 14 gün içinde gerçekleştirilebilir. Genel yöntem, hedefin bilindiği herhangi bir fare hastalığı modeline uygulanabilir. Benzer şekilde, spesifik uygulama (patojenik peptid/MHC sınıf II kompleksini hedeflemek) önemli bir kompleksin tanımlandığı diğer otoimmün hastalık modelleri için de geçerlidir.

Genellikle, bu protokolü kullanarak transdüksiyon verimliliği ~ 60-90%. Şekil3'te gösterilen deneyde, sıralamadan önce, CD8 T hücrelerinin yaklaşık %70'i GFP ile birlikte ifade edilir. Ayrıca CD28 ve CD3 (Şekil3C)ile birlikte ifade edilirler. Daha da önemlisi, tüm "test" GFP+ hücreleri de IAg7-B:R3 tetramer ile eş-lekeli, ancak kontrol tetramer ile değil (Şekil...

Watch this Scientific Journal Video about High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model at JoVE.com

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Bu protokol, otoimmün hastalıkların tedavisinde istenilen güvenli bir yaklaşım olan fonksiyonel antijene özgü T hücrelerinin çok sayıda oluşturmanızı sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, size çok verimli bir transdüksiyon süreci ve çok sayıda fonksiyonel T hücresi sağlamasıdır. Bu teknik tip 1 diyabet ve antijenlerin bilindiği diğer otoimmün hastalıkların tedavisinde genişletilebilir.Ayrıca, CAR T hücreleri kanser belirli türleri için umut verici bir tedavi olabilir. Bu yöntem, diğer CAR ifade bağışıklık hücreleri oluşturmak için kullanılabilir. İyi kabul edilen bir teknik olması, tüm protokolü okuması ve tüm denemeyi önceden planlaması önemlidir.Bu iki haftalık uzun protokol mini adımlar içerir ve başarı her adımın uygun performansbağlıdır. Bu yöntemin görsel gösterimleri, öğrencilerin doğru şekilde izlemeleri için çok önemlidir. Makalede açıklandığı gibi transfeksiyon için Phoenix hücreleri hazırlayın.Hücrelerin uçmasını en aza indirmek için ortamın eklendiği ve kaldırılacağı yan duvarı işaretlemek iyi bir uygulamadır. Gün sıfır hücrelerden supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile yıkayın. Dikkatlice plakayan duvara azaltılmış serum orta damla yedi mililitre ekleyin ve kuvöz geri hücreleri aktarın.İki 14 milimetre yuvarlak alt polipropilen tüpler için azaltılmış serum orta 1,5 mililitre ekleyin. Tüplerden birine 40 mikrometre transfeksiyon reaktifi ve 15 mikrogram antikor yönlendirilmiş CAR plazmidini ve beş mikrogram ambalaj plazmidini diğerine ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın ve sonra plazmid tüpüne transfeksiyon reaktifi ekleyin.Çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı boruyla hafifçe karıştırın ve en az 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Phoenix hücrelerine karışımın üç mililitre ekleyin ve bir doku kültürü kuluçka yerleştirin. Dört ila beş saat sonra hücrelere fcs bir mililitre ekleyin ve kültür onları bir gecede 37 santigrat derece.Ertesi gün, hücrelerden supernatant çıkarın ve taze önceden ısıtılmış kültür ortamı dört mililitre ekleyin. Phoenix hücrelerinden orta içeren virüs toplayarak ve artık hücre enkaz kaldırmak için filtreleme tarafından ikinci gün virüs Hasat. Mililitre başına 200 uluslararası birim son konsantrasyon için virüse rekombinant insan IL-2 stok ekleyin ve transdüksiyon için hemen kullanabilirsiniz.Phoenix hücrelerine dört mililitre taze ortam ekleyin ve bir gecede kuvöze yerleştirin. İkinci bir transdüksiyon için ertesi gün virüs toplama tekrarlayın ve hücreleri atın. Bir gün önce murine CD8 T hücreleri tohumlama, bir anti-fare CD3 ve CD28 antikorların karışımı bir mililitre ekleyin 24 iyi plaka her iyi ve dört derece Santigrat gecede plaka kuluçka.Gün sıfır, hasat fare dalak ve buz üzerinde bir hücre kültürü çanak PBS 10 mililitre sırılsıklam bir hücre süzgeci üzerine koyun. Bir hücre kültürü başlık olarak, üç ila beş parçaya her dalak kesilmiş ve tel örgü ile doku basın için bir şırınga steril bir piston kullanın. Splenositleri 1-4 seyreltilmiş kırmızı hücre lisis tamponunda yeniden sulandırarak ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatarak kırmızı kan hücrelerini nazikçe çıkarın ve hücre sayımı için Trypan Blue ile hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini seyreltin.Ve yedi dakika boyunca 350 kez g santrifüj ederek hücrelerin geri kalanı pelet. CD8 T hücrelerini zenginleştirmek ve hücre peletlerini 400 mikrolitre tamponda, 100 mikrolitre biotin antikor kokteyli ile bir kere10'dan sekizinci hücrelere kadar askıya almak için bir fare CD8 T hücre izolasyon kiti kullanın. Hücre süspansiyonuna iyice karıştırın ve antikor bağlanmasıiçin dört santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra etiketleme tampon 300 mikrolitre ve 8 hücreleri için bir kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 200 mikrolitre ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve 4 santigrat derecede 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Bu arada, ayırıcı üzerinde bir ayırma sütunu ayarlayın ve etiketleme arabellek üç mililitre ile yıkayın.Bir sütunun üstüne 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci koyun ve bir mililitre boncuk ve hücre karışımını süzgeçten ayırma sütununa geçirin. Önceden itil 15 mililitrelik bir tüp içine akışı toplamak ve aynı tüp içine atık toplama, üreticinin talimatlarına göre sütun yıkayın. Hücreleri sayın ve beş dakika boyunca 350 kez g santrifüj ile toplayın.Tekrar t hücreli orta ve santrifüj iki mililitre ile yıkayın. Daha sonra mililitre başına 250, 000 ila 500, 000 hücre konsantrasyonu ile önceden ısıtılmış T hücre orta onları yeniden askıya. Önceden hazırlanmış CD3 ve CD28 antikor kaplı plakaları bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Hücreleri eşit olarak dağıtmak için dönen bir hareket kullanın. Bir kontrol olarak, plaka tek bir kaplamasız kuyu içine CD8 T hücreleri aynı sayıda plaka plaka ve 48 saat boyunca% 10 karbondioksit gaz tankı kuluçka 37 derece santigrat hücreleri kuluçka. İlk gün, 24 kuyulu bir plakanın kuyularına 0,5 mililitre fibronektin ekleyerek ve gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatarak insan fibronektin parçalı kaplamalı plakalar hazırlayın.Ertesi gün, fibronektin çözeltisi kaldırmak ve iyi başına% 2 BSA ve PBS bir mililitre ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve tedavi edilen kuyuları bir mililitre steril PBS ile yıkayın. Plaka yıkama çözeltisi çıkardıktan sonra kullanıma hazırdır.Trypan Blue kullanarak etkinleştirilen CD8 T hücrelerini sayın. Santrifüj ile toplayın. Ve onları mililitre başına 5 milyon canlı hücrede yeniden uzaklaştırArak transdüksiyon için.Fibronectin kaplı plakanın her kuyuya aktif CD8 hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra orta içeren daha önce hazırlanmış virüs 1,5 ila iki mililitre ekleyin ve eşit hücreleri dağıtmak için dönen bir hareket kullanarak karıştırın. Plakayı Ziploc çantasına kapatın ve 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca 2,000 kez g'de santrifüj edin.Plakayı santrifüjden çıkarın ve biyolojik bir güvenlik kabinine götürün. Plastik poşeti dikkatlice çıkarın ve plakanın dışının orta ile kirlenmediğinden emin olun. Plakayı 37 santigrat derece karbondioksit kuvöze aktarın.Dört saat sonra, her kuyudan bir mililitre orta yıkın, önceden ısıtılmış tam T hücreli ortamın bir mililitresini değiştirin ve plakayı kuvöze geri koyun. Bu protokolün kritik yönleri yüksek bir titre virüs, sağlıklı aktif T hücreleri ve uygun transdüksiyon yöntemidir. Hücreler, akım sitometrik analizi için PE boyutu yedi konjuge anti-CD8, AF647 konjuge anti-CD3 ve BV 421 konjuge anti-CD28 ile birlikte boyandı.Yaklaşık olarak, CD8 T hücrelerinin yaklaşık %70'i CAR ekspresyonunu gösteren GFP'yi birlikte ifade eder. Ayrıca CD28 ve CD3'ün ortak ifadesini de verdiler. Daha da önemlisi, test GFP pozitif hücrelerin tüm i-Ag7 insülin BR3 tetramerleri ile eş-lekeli hücre yüzeyinde CAR ifade gösterir ama kontrol tetramer ile değil.Ayrıca, sıralanmış test ve kontrol CAR T hücreleri her transduced hücrelerin bir CD8 efektörü T hücre fenotip ana antikorların hedefe yönelik olduğunu doğrulayan onların cognate ligands ifade hedef hücreleri ile coculture sonra interferon gama yüksek düzeyde salgılanan. Virüs üretici hücrelerinin transdüksiyonu, birincil CD8 T hücrelerinin izole edilmesi ve bu T hücrelerinin aktivasyonu bu deneyin en önemli adımlarıdır. Sağlıklı aktive T hücrelerinin olması ve uygun reaktifler ile bu T hücrelerinin transdüksiyon olumlu sonuçlar sağlar.Bu yöntem diğer T hücrelerini nakletmek için kullanılabilir, ancak belirli T hücre türü için özelleştirilmelidir. Bu protokol antijene özgü şimerik antijen reseptör T hücre tedavisi ile tip 1 diyabetin önlenmesi için önünü açar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...