Name: modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من "سكوولا نورمالي سوبريوري" (SNS14_B_DIPRIMIO ؛ SNS16_B_DIPRIMIO).

1. ثقافة الخلية
<ol><li>الثقافة SY5Y الخلايا (خط خليه الورم الارومي العصبي البشري ، CRL-2266) في المتوسط الكامل (النسر المعدل دولبيكو المتوسطة: خليط المغذيات F12 [DMEM/F-12] تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية ، 2 ملم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين). الحفاظ علي الخلايا في حاضنه في ...

<ol>
	<li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration.">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li><li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain.">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li><li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures.">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li><li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+on+&#945;-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC*+rich+DNA:+Relevance+to+neurological+disorders.">New evidence on &#945;-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand,+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation.">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation.">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li><li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions.">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li><li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical,+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein.">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).</li><li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus.">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li><li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Tau,+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection.">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li><li>Sj&#246;berg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA:+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization.">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li><li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions.">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li><li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure.">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau:+Involvement+in+chromosome+stability.">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome.">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy.">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li><li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies.">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer's+Disease.">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li><li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response.">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).</li><li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer.">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li><li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells.">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li><li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia.">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li><li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-&#954;B+p65+and+binding+to+cytokine+promoters:+Importance+of+extracellular+domain.">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-&#954;B p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li><li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice.">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li><li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation.">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li><li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes.">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li><li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation.">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li><li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex.">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li><li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells.">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li><li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomics:+Methodologies+and+Analysis.">Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis.</a> Functional Genomics. , (2012).</li><li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Modulates+VGluT1+Expression.">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li><li>Serdar, B. S., Ko&#231;t&#252;rk, S., Akan, P., Erkmen, T., Erg&#252;r, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells?.">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?.</a> Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).</li><li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability.">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li><li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration.">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated,+Neurotrophic+Factor-Dependent,+Human+Neuron-Like+Cells.">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li></ol>

ونحن نوضح طريقه لقياس تاثير بروتين تاو النووي علي التعبير الجيني. مع هذا بروتوكول المساهمة من [سيتوميك] [تاو] بقوة محدوده. الخطوات الهامه لهذا البروتوكول هي التالية: التفريق بين خلايا الورم الارومي العصبي البشري SY5Y ، والتجزئة تحت الخلوي وتوطين بروتين تاو في المقصورة النووية.
<p class="jove_content...

وقد اكتسبت وظائف بروتين تاو في النواة اهتماما كبيرا في السنوات الاخيره ، حيث ثبت انها ترتبط ارتباطا وثيقا بالأحماض النووية1،2،3،4،5،6. وفي الواقع ، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا علي نطاق الجينوم ان تاو تربط متواليات الحمض النووي الوراثية والجينية في الجسم الحيوي7. وقد اقترح دور في نوكليولار منظمه8و9و10و11. وعلاوة علي ذلك, وقد اقترح تاو لتكون متورطة في حماية الحمض النووي من الاكسده وفرط الضغط المفرط5,10,12,13, في حين تم ربط المتحول تاو إلى عدم استقرار الكروموسوم و صيغه الصبغيه14,15,16.
حتى الآن ، ظلت التحديات في دراسة وظائف تاو في المقصورة النووية دون حل تقريبا بسبب الصعوبات في تشريح مساهمه محدده من تاو النووية من مساهمه السيتوبلازمية تاو. وعلاوة علي ذلك ، فان الوظائف المنسوبة إلى جزيئات تاو في المقصورة النووية ، حتى الآن ، ليست سوي صله نسبيه لأنها تفتقر إلى دليل قاطع علي المشاركة المباشرة لبروتينات تاو النووية. وفي الواقع ، فان مشاركه تاو في التنقل من الرجعية أو في النسخ rrna أو في حماية الحمض النووي11،12،17،18،19 يمكن ان تفسر أيضا من خلال مساهمه الخلوية تاو أو تاثير العوامل الأخرى المصب غير المرتبطة تاو النووية.
هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يمكن ان تحل هذه المسالة عن طريق استغلال الإجراءات الكلاسيكية لعزل المقصورة النووية مع استخدام يبني تاو 0N4R الموسومة التعريب النووي (NLS) أو إشارات التصدير النووية (NES). هذا النهج يلغي القضايا المعقدة المتعلقة بالمصنوعات اليدوية المحتملة بسبب امتداد جزيئات تاو من المقصورة السيتوبلازمية. وعلاوة علي ذلك ، فان بناء تاو-NLS و Tau-NES يحفز علي إثراء أو استبعاد جزيئات تاو من المقصورة النووية ، علي التوالي ، مما يوفر ضوابط ايجابيه وسلبيه لاشراك جزيئات تاو النووية في وظيفة محدده. والبروتوكول سهل من الناحية التقنية وهو يتالف من أساليب تقليديه وموثوق بها تنطبق علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى ، المتمايزة ام لا ، مثل الخلايا السرطانية التي تعيد تنشيط تعبير تاو20،21. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا علي البروتينات الأخرى الموجودة في كل من السيتوبلاسما والنواة من أجل تشريح الوظائف البيولوجية المتعلقة بالمقصورات المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Actin Antibody</td>
			<td>BETHYL LABORATORIE</td>
			<td>A300-485A</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti GAPDH Antibody</td>
			<td>Fitzgerald Industries International</td>
			<td>10R-G109a</td>
			<td>anti-mouse WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti H2B Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:15000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tau-13 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-21796</td>
			<td>anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tubulin alpha Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-16891</td>
			<td>anti-mouse WB 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti VGluT1 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAb91041</td>
			<td>anti-mouse WB 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-Grade Blocker</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOVIN SERUM ALBUMIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5678093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium Low Glucose</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM0060L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ml</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide</td>
			<td>nunc</td>
			<td>177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>cationic lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40,872-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml, 100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Step 3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supported Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Plate 6well</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ml</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>Step 3.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes

تاو هو بروتين ملزم ميكروتوبولي المعرب عنها في الخلايا العصبية ويرتبط وظيفتها الرئيسية المعروفة للحفاظ علي الاستقرار خلوي. ومع ذلك ، أشارت الادله الاخيره إلى ان تاو موجود أيضا في مقصورات فرعيه أخرى بما في ذلك النواة حيث انها متورطة في حماية الحمض النووي ، في النسخ rRNA ، في حركه الرجعية وفي التنظيم الهيكلي لل نويه. وقد أظهرنا مؤخرا ان تاو النووية تشارك في التعبير عن جين VGluT1 ، مما يوحي بوجود اليه الجزيئية التي يمكن ان تفسر الزيادة المرضية من الإفراج الغلوتامات في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر. حتى وقت قريب ، كانت مشاركه تاو النووية في تحوير التعبير عن الجينات المستهدفة غير مؤكده نسبيا وغامضه بسبب القيود التقنية التي منعت استبعاد مساهمه السيتوبلازمية تاو أو تاثير الأخرى عوامل المصب غير المرتبطة بالنووية تاو. للتغلب علي هذا الشك ، قمنا بتطوير طريقه لدراسة التعبير عن الجينات المستهدفة التي يتم تضمينها علي وجه التحديد من قبل بروتين تاو النووي. استخدمنا بروتوكولا ان الأزواج استخدام إشارات التعريب وتجزئه سوبسيلولار ، مما يسمح باستبعاد التدخل من جزيئات تاو سيتوبلازمي. والاهم من ذلك ، ان البروتوكول سهل ويتالف من أساليب كلاسيكية وموثوقه يمكن تطبيقها علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى والظروف الخلوية.

وقد تم تصوير الاستراتيجية المستخدمة لتشريح تاثير النووية تاو في التعبير الجيني تجنب مساهمه بروتينات تاو السيتوبلازمي في الشكل 1. لفتره وجيزة ، يتم تجميع البروتينات تاو الموسومة NLS أو NES في أو مستبعده من المقصورة النووية ، علي التوالي. والأثر الوظيفي لهذا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.

تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الدور المباشر لتاو في المقصورة النووية مع استبعاد أي تلوث محتمل من التاو السيتوبلازمي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنطبق على نطاق واسع على الدراسة المتعلقة بالوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى وفي ظل ظروف خلوية مختلفة. إثبات الإجراء سيكون جياكومو سيانو، طبيب ما بعد الدكتوراه من مختبري.تبدأ عن طريق الطلاء أربع مرات 10 إلى خمس خلايا خط الخلايا الأرومية العصبية البشرية S-SY5Y التي سيتم نقلها مع ناقل التحكم الفارغ، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم تحويلها إلى تاو غير الموسومة، أربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي سيتم إرسالها إلى تاو-NLS، وأربع مرات 10 إلى الخلايا الخمس التي يتم نقلها مع تاو-NES في آبار فردية من طبق من ستة آبار. في اليوم التالي للطلاء ، بشكل منفصل احتضان 400 نانوغرام من الحمض النووي والحجم المناسب من الدهون الموجبة في أنبوب واحد من 250 ميكرولترات من المصل المخفض في البئر. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، والجمع بين كل ناقل مع حجم واحد من الدهون الموجبة واحتضان مجمعات الدهون الحمض النووي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، استبدال االنابات في كل بئر مع مليلترين من الثقافة الكاملة الطازجة المتوسطة وtransfect كل بئر مع الحل المناسب الدهون الحمض النووي المعقدة لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل المُتَسَنّون بوسيلة تمايز جديدة. لتحليل لطخة الغربية، وغسل الخلايا المُصابة والمتمايزة في كل بئر مع برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا مع 500 ميكرولترات من 0.1٪ التربسين في بئر لمدة أربع دقائق في 37 درجة مئوية.عندما تكون الخلايا قد فصلت، ووقف رد فعل مع حجم متساو من المتوسط كاملة ونقل تعليق الخلية من كل بئر إلى أنابيب الفردية للطرد المركزي. بعد إزالة بعناية من المواد الخارقة، resuspend الكريات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب للطرد المركزي الثاني وإزالة عظمى مرة أخرى. لاستخراج البروتين الكلي، احتضان الكريات لمدة 30 دقيقة على الجليد في 50 إلى 100 ميكرولتر من عازلة تحلل تكملها مثبطات البروتياز والفوسفاتاز.في نهاية الحضانة، الطرد المركزي استخراج في 16، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة، وتحديد تركيز البروتين عن طريق أي معيار القياس الكمي. ثم اخلط 20 ميكروغرام من كل عينة بروتين مع خمس ميكرولترات من عازل 4X Laemmli إلى حجم إجمالي قدره 20 ميكرولترات وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بالنسبة للكسر دون الخلوي، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل للعد والدوران لأسفل مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل عينة.لعزل الكسر السيتوسوليك، احتضان الكريات في 100 ميكرولترات من الجليد البارد سيتوبلازمميك استخراج العازلة تكملها مثبطات البروتياز في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة، وجمع العينات عن طريق الطرد المركزي ونقل المابس إلى أنابيب ما قبل التبريد. إضافة 100 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج الأغشية العازلة تستكمل مع مثبطات البروتياز إلى بيليه لاحتضان 10 دقيقة في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف.ثم الطرد المركزي الكريات لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية و 3،000 مرات ز وجمع supernatants في أنابيب جديدة. لجمع الكسر النووي القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمّل بمثبطات البروتياز إلى الكريات ذات الدوامة قبل احتضان العينات بأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينات وجمع اابر.لجمع الكسر النووي غير القابل للذوبان، أضف 50 ميكرولترات من مخزن الاستخراج النووي المكمل بمثبطات البروتياز، كلوريد الكالسيوم والنيوكلاز الدقيق إلى الكريات ذات الدوامة. احتضان العينات لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية قبل دوامة وrifuging. ثم جمع ابر.لجمع كسر الهيكل العظمي، إضافة 50 ميكرولترات من العازلة استخراج الهيكل العظمي cyto والهيكل العظمي تكملها مثبطات البروتياز إلى الكريات مع دوامة. بعد حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي العينات وجمع اغراء. لتحليل SDS-PAGE، إضافة سبعة ميكرولترات من 4X Laemmli العازلة إلى 20 ميكرولترات من كل من العينات الكسر دون الخلوية التي تم جمعها وغلي العينات في 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.في نهاية الحضانة، تحميل العينات على هلام الاكريلاميد وتنفيذ الكهرباء في الجهد المستمر من 120 فولت. ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز في 250 مللي امبير لمدة 90 دقيقة. احتضان الغشاء لمدة خمس دقائق في بونساو تلطيخ حل للتحقق من وجود البروتين السليم هلام electrophoresis والنشاف ناجحة.في نهاية الحضانة، شطف الغشاء في الماء المقطر حتى الخلفية نظيفة وإزالة وصمة عار مع الغسيل المستمر مع تريس المخزنة المالحة تكملها توين 20 لمدة 10 دقائق على شاكر. بعد ذلك، احتضان الغشاء مع محلول منع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قبل غسل ثلاث مرات مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة في حل منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية تليها ثلاثة يغسل مع محلول ملحي تريس المخزنة بالإضافة إلى توين 20 لمدة خمس دقائق.بعد الغسيل الأخير ، تهجين الغشاء مع جسم مضاد ثانوي مناسب من الفجل peroxidase في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الغشاء بالمحلول الملحي المخزنة على تريس بالإضافة إلى توين 20 ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسيل. بعد الغسيل الأخير ، الكشف عن الفرقة البروتين باستخدام chemiluminescence وقياس شدة عصابات لطخة الغربية من قبل ImageJ. في غياب حمض الريتينويك وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ، والخلايا SH-SY5Y غير المتمايزة تفترض شكل دائري وكتل الخلايا الشكل.كما هو متوقع ، بعد خمسة أيام من العلاج بحمض الريتينويك ، تسترخي الكتل وتنتشر الخلايا. بعد ثلاثة أيام إضافية من العلاج مع عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ ، تظهر الخلايا موزعة بشكل موحد ومتشابكة عبر شبكة من النوريات المتفرعة. بعد تاو-NLS أو تاو-NES transfection, تاو التعريب دون الخلوية يمكن الكشف عن طريق immunofluorescence مع الأجسام المضادة المضادة تاو.اعتمادا على كفاءة transfection، والخلايا عرض تلطيخ نووي قوي مع إشارة DAPI بعد تسربل تاو-NLS أو تلطيخ السيتوبلازمي مع نوى فارغة بعد تاو-NES. ويكشف تحليل البلوط الغربي عن إثراء الـ actin داخل الكسر الهيكلي، والتبولين داخل الكسور السيتوبلازمية والسيكومية، وH2B داخل الكسور النووية. كما يؤكد تحليل البلوط الغربي التعبير عن تاو الموسوم وغير الموسومة داخل المقصورة النووية ونقل الغلوتامات في حويغية تعبير واحد في المقتطف الكلي.في الواقع، فإن نسبة تاو في الكسور النووية والسيكتوبلازمية القابلة للذوبان تسلط الضوء على حقيقة أن تاو-NLS يتم تخصيبه بدرجة عالية في الجزء النووي القابل للذوبان بينما يتم تقليل تاو-NES. وعلاوة على ذلك، يتم إثراء تاو-NLS في الكسر المرتبط بالكروماتين فيما يتعلق بالكسر السيتوبلازمي بينما ينخفض تاو-NES. تأكد من فحص بعناية عدد الخلايا المستخدمة لتجزئة كل عينة والتحقق من إثراء الجينات التدبير المنزلي في الكسور المناسبة.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرة على عزل المقصورات الخلوية وتقييم الدور الوظيفي لتاو في النواة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

إعداد rAAV9 إلى بإفراط أو ضربة قاضية الجينات في قلوب ماوس

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

التحديد الكمي "المعلومات المشفرة" واسطة الجينات التعبير مستويات خلال عمر التحوير تحت نطاق واسع "الغذائية التقييد" في C. ايليجانس

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

كانالوستومي كنهج العمليات جراحية لإيصال الأدوية المحلية إلى آذان الداخلية من الفئران الكبار والأطفال حديثي الولادة

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

قكات: "كتابة سيميوتوماتيد الكمية" من القاتل-الخلية "جينات مستقبلات" الغلوبولين المناعي مثل

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...