Name: modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של Scuola Normale הסופרור (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

1. תרבית תאים
<ol><li>תרבות SH-SY5Y תאים (קו תאים נוירובלסטומה האדם, CRL-2266) בינונית לחלוטין (מדיום הנשר שונה של בינונית: תערובת מזינים F12 [DMEM/F-12] בתוספת עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין 100 μg/mL סטרפטומיצין). לשמור על התאים בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2. לגדול תאים ב 10 ס מ לוחות ולפצל כאש...

<ol>
	<li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration.">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li><li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain.">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li><li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures.">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li><li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+on+&#945;-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC*+rich+DNA:+Relevance+to+neurological+disorders.">New evidence on &#945;-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand,+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation.">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation.">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li><li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions.">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li><li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical,+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein.">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).</li><li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus.">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li><li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Tau,+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection.">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li><li>Sj&#246;berg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA:+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization.">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li><li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions.">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li><li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure.">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau:+Involvement+in+chromosome+stability.">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome.">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy.">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li><li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies.">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer's+Disease.">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li><li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response.">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).</li><li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer.">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li><li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells.">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li><li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia.">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li><li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-&#954;B+p65+and+binding+to+cytokine+promoters:+Importance+of+extracellular+domain.">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-&#954;B p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li><li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice.">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li><li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation.">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li><li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes.">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li><li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation.">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li><li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex.">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li><li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells.">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li><li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomics:+Methodologies+and+Analysis.">Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis.</a> Functional Genomics. , (2012).</li><li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Modulates+VGluT1+Expression.">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li><li>Serdar, B. S., Ko&#231;t&#252;rk, S., Akan, P., Erkmen, T., Erg&#252;r, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells?.">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?.</a> Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).</li><li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability.">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li><li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration.">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated,+Neurotrophic+Factor-Dependent,+Human+Neuron-Like+Cells.">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li></ol>

אנו מתארים שיטה למדוד את ההשפעה של חלבון הטאו גרעיני על ביטוי גנים. עם הפרוטוקול הזה התרומה. של cytoplasmic טאו מוגבלת מאוד צעדים קריטיים של פרוטוקול זה הם הבאים: הבידול של האדם נוירובלסטומה SY5Y תאים, את השבר הסלולר ואת הלוקליזציה של חלבון הטאו בתא הגרעיני.
ראשון, כפי שמוצג בסעיף תו...

הפונקציות של החלבון טאו בגרעין צברה עניין משמעותי בשנים האחרונות, כפי שהוא הוכח להיות קשור הדוק עם חומצות גרעין1,2,3,4,5,6. אכן, הגנום לאחרונה מחקר רחב הראה כי טאו נקשר רצפי DNA הגניים הבין vivo7. תפקיד בארגון נוקלאוולאר הוצע8,9,10,11. יתר על כן, טאו הציע להיות מעורב הגנת דנ א מ חמצוני היפרתרמיה5,10,12,13, ואילו מוטציה טאו היה קשור לחוסר יציבות כרומוזום ו מאנולודיה14,15,16.
עד היום, האתגרים בלימוד התפקודים של הטאו בתוך התא הגרעיני נותרו כמעט בלתי פתורים בשל הקשיים בניתוח התרומה הספציפית של הטאו הגרעיני מתרומתה של cytoplasmic טאו. יתרה מזאת, הפונקציות המיוחסות למולקולות של הטאו בתוך התא הגרעיני, עד כה, הן רק משום שהן חסרות הדגמה חד משמעית של המעורבות הישירה של החלבונים הגרעיניים של הטאו. ואכן, מעורבות של הטאו בניידות של הרטרוטרנספסונים או בתמלול או ב-DNA הגנה11,12,17,18,19 יכול להיות גם הסביר על ידי תרומת cytoplasmic טאו או על ידי השפעה של גורמים אחרים במורד הזרם לא קשור לטאו גרעיני.
כאן, אנו מספקים שיטה שיכולה לפתור בעיה זו על ידי ניצול הליך קלאסי כדי לבודד את התא הגרעיני בשילוב עם השימוש של בונה הטאו 0N4R מתויג עם לוקליזציה גרעינית (NLS) או אותות היצוא הגרעיני (NES). גישה זו מבטלת את הסוגיות המורכבות הקשורות לחפצי האמנות האפשריים בשל הגלישה של מולקולות טאו מהתא cytoplasmic. יתר על כן, המבנים של טאו-NLS וטאו-נס מעניקים להעשרה או להדרה של מולקולות של הטאו מהתא הגרעיני, בהתאמה, מתן שליטה חיובית ושלילית למעורבות של מולקולות באוניברסיטת טאו גרעינית בפונקציה מסוימת. הפרוטוקול הוא מבחינה טכנית קל והוא מורכב שיטות קלאסיות ואמינות, כי הם החלים באופן כללי כדי ללמוד את הפונקציה הגרעינית של הטאו בסוגי תאים אחרים, הבדיל או לא, כמו תאים סרטניים להפעיל מחדש את הביטוי טאו20,21. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים הנמצאים הן הציטופלסמה ואת הגרעין על מנת לנתח פונקציות ביולוגיות הקשורות לתאים שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Actin Antibody</td>
			<td>BETHYL LABORATORIE</td>
			<td>A300-485A</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti GAPDH Antibody</td>
			<td>Fitzgerald Industries International</td>
			<td>10R-G109a</td>
			<td>anti-mouse WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti H2B Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:15000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tau-13 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-21796</td>
			<td>anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tubulin alpha Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-16891</td>
			<td>anti-mouse WB 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti VGluT1 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAb91041</td>
			<td>anti-mouse WB 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-Grade Blocker</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOVIN SERUM ALBUMIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5678093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium Low Glucose</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM0060L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ml</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide</td>
			<td>nunc</td>
			<td>177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>cationic lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40,872-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml, 100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Step 3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supported Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Plate 6well</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ml</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>Step 3.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes

טאו הוא חלבון קשירה מיקרוטודורית המתבטאת הנוירונים הפונקציה הידועה העיקרית שלה קשורה לתחזוקה של יציבות ציטושלד. עם זאת, הראיות האחרונות הראו כי טאו נמצא גם בתאי subcellular אחרים כולל הגרעין שבו הוא מעורב הגנת ה-DNA, בתמלול rRNA, בניידות של retrotransposons ובארגון המבני של גרעינון. לאחרונה הוכיחו כי טאו גרעיני מעורב בביטוי של הגן VGluT1, מציע מנגנון מולקולרי שיכול להסביר את הגידול הפתולוגי של שחרור גלוטמט בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר. עד לאחרונה, מעורבות של הטאו הגרעיני ב מודולים את הביטוי של גנים היעד היה בטוח יחסית מעורפל בשל מגבלות טכניות שמנע את הדרה של תרומת cytoplasmic טאו או את ההשפעה של אחרים גורמים במורד הזרם. לא קשורים לטאו גרעיני כדי להתגבר על חוסר ודאות זה, פיתחנו שיטה ללמוד את הביטוי של גנים היעד במיוחד מאופנן על ידי חלבון הטאו הגרעיני. העסקנו בפרוטוקול שזוגות את השימוש באותות הלוקליזציה ובשבר הסלולר, דבר המאפשר להתיר את ההפרעה ממולקולות הטאו של הציטוטופלמיק. בעיקר, הפרוטוקול הוא קל והוא מורכב משיטות קלאסיות ואמינות החלות באופן כללי על מנת ללמוד את התפקוד הגרעיני של הטאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים סלולריים.

האסטרטגיה המשמשת לנתח את ההשפעה של טאו גרעיני ביטוי גנים הימנעות מתרומת חלבונים cytoplasmic טאו מתוארת באיור 1. בקצרה, החלבונים של טאו שתויגו עם NLS או NES נצברים או אינם נכללים בתא הגרעיני, בהתאמה. ההשפעה הפונקציונלית של חוסר איזון זה הוא שינוי של ביטוי הגנים שנמד...

Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

טאו הוא חלבון עצבי מהווה הן בציטופלסמה, שם הוא נקשר microtubules, ובגרעין, שם הוא מפעיל פונקציות לא שגרתי כולל אפנון של הגנים הקשורים למחלות אלצהיימר. כאן, אנו מתארים שיטה לחקור את תפקידה של הטאו הגרעיני, תוך הימנעות כל הפרעות המגיעים cytoplasmic טאו.

מודולציה של הלוקליזציה של טאו הסלולר ככלי כדי לחקור את הביטוי של גנים הקשורים למחלות

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על התפקיד הישיר של טאו בתא הגרעיני תוך אי הכללת כל זיהום טאו ציטופלסמי פוטנציאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה באופן נרחב למחקר על הפונקציה הגרעינית של טאו בסוגי תאים אחרים ובתנאים תאיים שונים. הדגמת ההליך תהיה ג'אקומו סיאנו, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.התחל על ידי ציפוי ארבע פעמים 10 לחמשת תאי קו תא נוירובלסטומה אנושי SH-SY5Y להיות מתחלף עם וקטור הבקרה הריק, ארבע פעמים 10 עד חמשת התאים שיש לשנות עם טאו לא מתויג, ארבע פעמים 10 עד חמשת התאים להיות מומרים עם טאו-NLS, וארבע פעמים 10 עד חמשת התאים להיות מומרים עם טאו-NES לתוך בארות בודדות של צלחת שש בארות. יום לאחר ציפוי, בנפרד דגירה 400 ננוגרם של DNA ואת הנפח המתאים של שומנים cationic לתוך צינור אחד של 250 microliters של סרום מופחת לתוך באר. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשלב כל וקטור עם נפח אחד של שומנים קטוריים דגירה קומפלקסים שומנים DNA במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להחליף את supernatants בכל באר עם שני מיליליטר של בינוני תרבות שלמה טריים ולהחליף כל היטב עם פתרון תוסף השומנים DNA המתאים עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, החלף את העל-טבעיים במדיום ההתבוללה הטרי. לניתוח כתם מערבי, לשטוף את התאים מפוספסים ומובחנים בכל באר עם PBS ולהדקר את התאים עם 500 microliters של 0.1% טריפסין לגם במשך ארבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס.כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם נפח שווה של מדיום שלם ולהעביר את ההשעיה התא מכל באר לתוך צינורות בודדים עבור צנטריפוגה. לאחר הסרת בזהירות את supernatants, resuspend כדורי במיליליטר אחד של PBS לצינור עבור צנטריפוגה שנייה ולהסיר את supernatants שוב. עבור תמציות חלבון הכולל, דגירה כדורי במשך 30 דקות על הקרח ב 50 כדי 100 microliters של חיץ תזה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז.בסוף הדגירה, צנטריפוגה התמצית ב 16, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות לכמת את ריכוז החלבון על ידי כל מקדם כימות סטנדרטי. לאחר מכן מערבבים 20 מיקרוגרם של כל דגימת חלבון עם חמישה מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 4X לנפח כולל של 20 מיקרוליטר ומרתיחים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. עבור שברים תת-תאיים, חלק מחדש את התאים במדיום מלא לספירה וסובב כלפי מטה פי 10 עד ששת התאים לדגימה.כדי לבודד את השבר הציטוסולי, הדגירה את כדורי ב 100 microliters של חיץ מיצוי ציטופלסמי קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין במשך 10 דקות. בסוף הדגירה, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לתוך צינורות טרום מקורר. הוסף 100 microliters של חיץ מיצוי קרום קר קרח בתוספת מעכבי פרוטאז גלולה עבור דגירה 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין.ואז צנטריפוגה כדורי במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 3, 000 פעמים g ולאסוף את supernatants לתוך צינורות חדשים. כדי לאסוף את השבר הגרעיני המסיס, להוסיף 50 microliters של מאגר החילוץ הגרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז לכדורים עם מערבולת לפני הדגירה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה הדגימות ולאסוף את supernatants.כדי לאסוף את השבר הגרעיני הבלתי מסיס, להוסיף 50 microliters של חיץ מיצוי גרעיני בתוספת מעכבי פרוטאז, סידן כלורי ונוקלאז מיקרוסקופלי לכדורים עם מערבולת. הדגירה את הדגימות במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני מערבולת וצנטריפוגה. אז תאסוף את העל-טבעיים.כדי לאסוף את שבר cytoskeletal, להוסיף 50 microliters של מאגר מיצוי cytoskeletal בתוספת מעכבי פרוטאז לכדורים עם מערבולת. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הדגימות ולאסוף את supernatants. לניתוח SDS-PAGE, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של חיץ לאמלי 4X ל-20 מיקרוליטרים של כל אחת מדגימות השבר התת-תאי שנאספו והרתיחו את הדגימות ב-100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.בסוף הדגירה, לטעון את הדגימות על ג'ל אקרילאמיד ולבצע את האלקטרופורזה במתח קבוע של 120 וולט. לאחר מכן מעבירים את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס ב 250 מיליאמפר במשך 90 דקות. הדגירה את הממברנה במשך חמש דקות בתספור הכתמים Ponceau כדי לבדוק אלקטרופורזה ג'ל חלבון נכונה סופג מוצלח.בסוף הדגירה, שוטפים את הממברנה במים מזוקקים עד שהרקע נקי ומסירים את הכתם עם כביסה רציפה עם מלוחים עם טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך 10 דקות על שייקר. לאחר מכן, הדגירה את הממברנה עם פתרון חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות לפני כביסה שלוש פעמים עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, להכליא את הממברנה עם הנוגדן העיקרי של עניין בחסימת פתרון לילה בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שלוש שטיפות עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 במשך חמש דקות.לאחר הכביסה האחרונה, לכליא את הממברנה עם פרוקסידס חזרת מתאים מצומד נוגדן משני בתמיסת חסימה במשך שעה בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הממברנה עם מלוחים טריס-buffered בתוספת Tween 20 שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לזהות את רצועת החלבון באמצעות chemiluminescence לכמת את העוצמה של להקות כתם מערבי על ידי ImageJ. בהיעדר חומצה רטינואית וגורם נוירוטרופי המופק על ידי המוח, תאי SH-SY5Y מוצהרים מניחים מורפולוגיה מעוגל יותר ויוצרים גושי תאים.כצפוי, לאחר חמישה ימים של טיפול בחומצה רטינואית, הגושים נרגעים והתאים מתפשטים. לאחר שלושה ימים נוספים של טיפול עם גורם נוירוטרופי במוח, התאים מופיעים מופצים באופן אחיד ומחוברים באמצעות רשת של neurites מסועפים. לאחר טרנספינציה טאו-NLS או טאו-NES, לוקליזציה תת-תאית טאו יכול להיות מזוהה על ידי immunofluorescence עם נוגדנים נגד טאו.בהתאם ליעילות של ההתמזגות, התאים מציגים מיזוג כתמים גרעיני חזק עם אות DAPI לאחר ההמרה טאו-NLS או כתם ציטופלסמי עם הגרעינים הריקים לאחר טאו-NES. ניתוח כתם מערבי חושף את העשרת actin בתוך שבר cytoskeletal, tubulin בתוך שברים ציטופלסמי ציטוסקלטלי, ו H2B בתוך שברים גרעיניים. ניתוח כתם מערבי גם מאשר את הביטוי של טאו מתויג ולא מתויג בתוך התא הגרעיני ו טרנספורטר גלוטמט כלי דם ביטוי אחד בתמצית הכוללת.ואכן, היחס בין טאו לשברים הגרעיניים והציטופלסמיים המסיסים מדגיש את העובדה כי טאו-NLS מועשר מאוד בשבר הגרעיני המסיס בעוד טאו-NES מצטמצם. יתר על כן, טאו-NLS מועשר בשבר הכרומטין הקשור ביחס לשבר הציטופלסמי בעוד טאו-NES הוא ירד. הקפד לבדוק בזהירות את מספר התאים המשמשים לשבר של כל מדגם ולאמת את העשרת הגנים משק הבית בשברים הנכונים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד תאים סלולריים ולהעריך את התפקיד הפונקציונלי של טאו בגרעין.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy כמו הגישה כירורגי של משלוח סמים מקומי לתוך האוזן הפנימית של עכברים בוגרים ו Neonatal

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: Semi-automated כמותיים הקלדה של הרוצח-תא גנים קולטני דמוי נוגדן

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...