Name: modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

この作品は、スクオラ・ノーマル・スペリオーレ(SNS14_B_DIPRIMIO;)からの助成金によって支えられた。SNS16_B_DIPRIMIO)。

1. 細胞培養
<ol><li>培養SH-SY5Y細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞株、CRL-2266)を完全培地(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F12[DMEM/F-12]10%胎児ウシ血清[FBS]、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリンおよび100μ細胞を37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで維持する。10cmプレートで細胞を成長させ、コンフルエントになると分割します。</li>
</ol>2. 細胞分化
<ol><li>SH-SY5Y細胞を分...

<ol>
	<li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration.">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li><li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain.">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li><li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures.">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li><li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+on+&#945;-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC*+rich+DNA:+Relevance+to+neurological+disorders.">New evidence on &#945;-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand,+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation.">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation.">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li><li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions.">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li><li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical,+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein.">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).</li><li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus.">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li><li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Tau,+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection.">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li><li>Sj&#246;berg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA:+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization.">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li><li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions.">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li><li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure.">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau:+Involvement+in+chromosome+stability.">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome.">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy.">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li><li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies.">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer's+Disease.">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li><li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response.">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).</li><li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer.">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li><li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells.">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li><li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia.">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li><li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-&#954;B+p65+and+binding+to+cytokine+promoters:+Importance+of+extracellular+domain.">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-&#954;B p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li><li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice.">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li><li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation.">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li><li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes.">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li><li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation.">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li><li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex.">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li><li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells.">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li><li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomics:+Methodologies+and+Analysis.">Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis.</a> Functional Genomics. , (2012).</li><li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Modulates+VGluT1+Expression.">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li><li>Serdar, B. S., Ko&#231;t&#252;rk, S., Akan, P., Erkmen, T., Erg&#252;r, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells?.">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?.</a> Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).</li><li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability.">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li><li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration.">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated,+Neurotrophic+Factor-Dependent,+Human+Neuron-Like+Cells.">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li></ol>

核タウタンパク質が遺伝子発現に及ぼす影響を測定する方法について述べたい。このプロトコルを使用すると、細胞質タウの寄与は強く制限される。このプロトコルの重要なステップは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞の分化、細胞内分画および核コンパートメントにおけるタウタンパク質の局在化である。
まず、代表結果セクションに示すように、RAおよびBDNFを添加する?...

核内のタウタンパク質の機能は、核酸1、2、3、4、5、6と密接に関連していることが示されているように、近年大きな関心を集めている。実際、最近のゲノムワイド研究では、タウが生体内7で原性およびインタージェニックDNA配列に結合することを実証した。ヌクレオラー組織における役割は、8、9、10、11が示唆されている。さらに、タウは酸化および高熱ストレス5、10、12、13からのDNA保護に関与することが提案されているのに対し、変異タウは染色体不安定性およびアヌプロイディ14、15、16に関連している。
これまで、核区画におけるタウの機能を研究する上での課題は、細胞質タウの寄与から核タウの具体的な寄与を解剖する難しさのためにほとんど未解決のままでした。さらに、核区画内のタウ分子に起因する機能は、これまで、核タウタンパク質の直接的な関与の明確な実証を欠いているため、相関に過ぎない。実際、レトロトランスポゾンの移動性またはrRNA転写またはDNA保護11、12、17、18、19におけるタウの関与は、細胞質タウの寄与または核タウに関連しない他の下流因子の影響によっても説明され得る。 
ここでは、核局在化(NLS)または核輸出信号(NES)でタグ付けされたタウコンストラクト0N4Rの使用と組み合わせて核コンパートメントを分離する古典的な手順を利用して、この問題を解決する方法を提供します。このアプローチは、細胞質コンパートメントからのタウ分子の波及による可能なアーティファクトに関連する複雑な問題を排除します。さらに、タウNLSおよびタウファミコン構築物は、それぞれ核コンパートメントからのタウ分子の濃縮または排除を誘導し、特定の機能における核タウ分子の関与に対する正および負の制御を提供する。このプロトコルは技術的に容易であり、タウ発現20、21を再活性化する癌細胞などの他の細胞型におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能な古典的で信頼性の高い方法で構成されている。さらに、異なる区画に関連する生物学的機能を解剖するために、細胞質と核の両方に存在する他のタンパク質にも適用され得る。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Actin Antibody</td>
			<td>BETHYL LABORATORIE</td>
			<td>A300-485A</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti GAPDH Antibody</td>
			<td>Fitzgerald Industries International</td>
			<td>10R-G109a</td>
			<td>anti-mouse WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti H2B Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:15000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tau-13 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-21796</td>
			<td>anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tubulin alpha Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-16891</td>
			<td>anti-mouse WB 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti VGluT1 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAb91041</td>
			<td>anti-mouse WB 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-Grade Blocker</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOVIN SERUM ALBUMIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5678093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium Low Glucose</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM0060L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ml</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide</td>
			<td>nunc</td>
			<td>177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>cationic lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40,872-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml, 100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Step 3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supported Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Plate 6well</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ml</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>Step 3.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes

タウは、ニューロンで発現される微小管結合タンパク質であり、その主な既知の機能は、細胞骨格安定性の維持に関連している。しかし、最近の証拠は、タウがDNA保護に関与する核を含む他の細胞内コンパートメントにも存在することを示し、rRNA転写において、レトロトランスポゾンの移動性および構造組織において核小体。我々は最近、核タウがVGluT1遺伝子の発現に関与していることを実証し、アルツハイマー病の初期段階におけるグルタミン酸放出の病理学的増加を説明できる分子機構を示唆している。最近まで、標的遺伝子の発現を調節する核タウの関与は、細胞質タウの寄与または他の効果の排除を妨げた技術的な制限のために比較的不確実であいまいであった核タウとは関係のない下流要因この不確実性を克服するために、核タウタンパク質によって特異的に変調された標的遺伝子の発現を研究する方法を開発しました。我々は、局在シグナルと細胞下分画の使用を結合するプロトコルを採用し、細胞質タウ分子からの干渉を排除することを可能にした。最も顕著なのは、プロトコルは簡単であり、他の細胞型および細胞状態におけるタウの核機能を研究するために広く適用可能である古典的で信頼できる方法で構成されている。

細胞質タウタンパク質の寄与を避ける遺伝子発現における核タウの影響を解剖するために用いられる戦略を図1に示した。簡単に言えば、NLSまたはNESでタグ付けされたタウタンパク質は、それぞれ核コンパートメントに蓄積されるか、または核コンパートメントから除外されます。このアンバランスの機能効果は、VGluT1遺伝子の産物として測定さ...

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Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

この方法は、潜在的な細胞質タウ汚染を除いた一方で、核コンパートメントにおけるタウの直接的な役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の細胞型および異なる細胞条件下におけるタウの核機能に関する研究に広く適用可能である。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるジャコモ・シアーノです。空のコントロールベクターにトランスフェクトされる5つのSH-SY5Yヒト神経芽細胞細胞に10回、タグなしタウでトランスフェクトされる5つの細胞に10回、タウNLSでトランスフェクトされる5つの細胞に4回10回、タウ-NESをトランスフェクトする5つの細胞に4回10回、5つの細胞に4回10を3つのウェルプレートの個々のウェルウェルにトランスフェクトする。めっきの翌日、400ナノグラムのDNAと適切な量のカチオン脂質を1つのチューブに分けて、1ウェルあたり250マイクロリットルの減少した血清をインキュベートする。室温で5分後、各ベクターを1体積のカチオン脂質と組み合わせ、室温で20分間DNA脂質複合体をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、各ウェルの上清を2ミリリットルの新鮮な完全な培養培地に置き換え、摂氏37度で一晩インキュベーションするための適切なDNA脂質複合体溶液でそれぞれをうまくトランスフェクトする。翌日、上清を新鮮な分化培地に置き換えます。ウェスタンブロット分析では、各井戸のトランスフェクトおよび分化した細胞をPBSで洗浄し、摂氏37度で4分間、1ウェルあたり0.1%トリプシンの500マイクロリットルで細胞をインキュベートします。細胞が剥離したら、完全な培地の等量で反応を停止し、遠心分離のために各ウェルから個々のチューブに細胞懸濁液を移す。上清を慎重に除去した後、2番目の遠心分離のためにチューブあたりPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、再び上清を除去する。全タンパク質抽出物の場合、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加したリシスバッファーの50〜100マイクロリットルで氷上で30分間ペレットをインキュベートします。インキュベーションの終了時に、抽出物を16,000回gで15分間遠心分離し、任意の標準的な定量アッセイによってタンパク質濃度を定量する。その後、各タンパク質サンプルの20マイクログラムを4Xレムリバッファーの5マイクロリットルと混合し、合計容量20マイクロリットルにし、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。細胞内分画の場合は、カウント用の完全な培地中の細胞を再懸濁し、サンプルあたり6個の細胞に10回スピンダウンします。細胞質分画を分離するには、10分間穏やかな混合で摂氏4度のプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷細胞質抽出バッファーの100マイクロリットルでペレットをインキュベートする。インキュベーションの終了時に、遠心分離によってサンプルを収集し、上清を冷やされたチューブに移します。100マイクロリットルの氷冷膜抽出バッファーをペレットに加え、穏やかな混合で摂氏4度で10分間インキュベーションします。その後、ペレットを摂氏4度と3,000倍gで5分間遠心し、上清を新しいチューブに集めます。可溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤を添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを渦液でペレットに加え、サンプルを摂氏4度で30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。不溶性核分率を収集するには、プロテアーゼ阻害剤、塩化カルシウムおよびミクロコッカルヌクレアーゼをボルテックスでペレットに添加した核抽出バッファーの50マイクロリットルを加えます。渦と遠心分離機の前に摂氏37度で5分間サンプルをインキュベートします。その後、上清を収集します。細胞骨格分画を収集するには、50マイクロリットルの細胞骨格抽出バッファーを加え、プロテアーゼ阻害剤を添加し、渦を伴うペレットに添加します。室温で10分間のインキュベーションの後、サンプルを遠心分離し、上清を収集します。SDS-PAGE分析では、収集した細胞内分率サンプルのそれぞれ20マイクロリットルに4Xレムリバッファーの7マイクロリットルを加え、サンプルを摂氏100度で5分間沸騰させます。インキュベーションの最後に、サンプルをアクリルアミドゲルにロードし、120ボルトの一定電圧で電気泳動を行います。その後、タンパク質をニトロセルロース膜に250ミリアンペアで90分間移します。ポンソー染色液で膜を5分間インキュベートし、適切なタンパク質ゲル電気泳動とブロットが成功していることを確認します。インキュベーションの終わりに、バックグラウンドがきれいになるまで蒸留水で膜をすすい、シェイカーで10分間Tween 20を補ったトリス緩衝生理食液で連続洗浄して汚れを取り除きます。次に、トリスバッファー生理食糸と Tween 20 を洗浄ごとに 5 分間洗浄する前に、振盪で室温で 1 時間ブロック溶液で膜をインキュベートします。最後の洗浄後、摂氏4度で一晩ブロッキング溶液に関心のある一次抗体で膜をハイブリダイズし、続いてトリス緩衝生理食肉とTween 20を5分間洗浄します。最後の洗浄後、トリス緩衝生理食肉とTween 20を洗浄1回5分間3回洗浄する前に、ブロック溶液中の適切な西洋ワサビペルオキシダーゼを常温で1時間、ブロッキング溶液に組み合わせて膜をハイブリダイズします。最後の洗浄後、化学発光を用いてタンパク質バンドを検出し、ImageJでウェスタンブロットバンドの強度を定量化します。レチノイン酸および脳由来神経栄養因子がない場合、未分化SH-SY5Y細胞は、丸い形態を仮定し、細胞塊を形成する。予想通り、レチノイン酸による5日間の治療の後、塊は解き戻され、細胞は広がった。脳由来神経栄養因子による3日間の治療の後、細胞は分岐した神経突起のネットワークを介して均一に分布し、相互接続されて現れる。タウ-NLSまたはタウ-ファミコントランスフェクション後、タウ細胞内局在化は、抗タウ抗体による免疫蛍光によって検出することができる。トランスフェクションの効率に応じて、細胞はタウ-NLSトランスフェクション後のDAPIシグナルと結合する強い核染色を示すか、タウ-ファミコン後の空核で細胞質染色を行う。ウェスタンブロット分析は、細胞骨格分画内のアクチン、細胞質および細胞骨格分画内の管状管、および核画分内のH2Bの濃縮を明らかにする。ウエスタンブロット分析はまた、全抽出物中の核コンパートメントおよびベシカルグルタミン酸トランスポーター内のタグ付きおよびタグなしタウの発現を確認する。実際、可溶性核および細胞質画分におけるタウの比率は、タウ-NLSが可溶性核分率に高く富化され、タウ-NESが減少するという事実を強調している。さらに、タウ-NLSは、タウ-ファミコンが減少している間、細胞質画分に関してクロマチン結合画分で濃縮される。各サンプルの分画に使用される細胞の数を注意深くチェックし、適切な分数でハウスキーピング遺伝子の濃縮を確認してください。このビデオを見た後, 細胞コンパートメントを分離し、核のタウの機能的役割を評価することができるはずです.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

マウスハーツでの遺伝子を過剰発現またはノックダウンするrAAV9の調製

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

線虫の遺伝子発現レベルの間に寿命変調下広い範囲食事制限によってエンコードされた情報の定量化

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...