Name: modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

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1. 세포 배양
<ol><li>배양 SH-SY5Y 세포(인간 신경아세포종 세포주, CRL-2266) 완전한 배지(덜베코의 변형된 이글 배지:영양 혼합물 F12 [DMEM/F-12]를 10% 태아 소 혈청[FBS], 2 mML-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충하였다. 37 °C 및 5 %CO2에서인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 10cm 접시에 세포를 성장하고 수렴 할 때 분할.</li>
</ol>2. 세포 분화
<ol><li>SH-SY...

<ol>
	<li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration.">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li><li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain.">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li><li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures.">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li><li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+on+&#945;-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC*+rich+DNA:+Relevance+to+neurological+disorders.">New evidence on &#945;-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand,+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation.">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation.">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li><li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions.">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li><li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical,+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein.">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).</li><li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus.">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li><li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Tau,+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection.">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li><li>Sj&#246;berg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA:+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization.">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li><li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions.">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li><li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure.">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau:+Involvement+in+chromosome+stability.">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome.">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy.">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li><li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies.">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer's+Disease.">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li><li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response.">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).</li><li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer.">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li><li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells.">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li><li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia.">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li><li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-&#954;B+p65+and+binding+to+cytokine+promoters:+Importance+of+extracellular+domain.">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-&#954;B p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li><li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice.">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li><li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation.">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li><li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes.">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li><li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation.">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li><li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex.">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li><li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells.">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li><li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomics:+Methodologies+and+Analysis.">Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis.</a> Functional Genomics. , (2012).</li><li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Modulates+VGluT1+Expression.">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li><li>Serdar, B. S., Ko&#231;t&#252;rk, S., Akan, P., Erkmen, T., Erg&#252;r, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells?.">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?.</a> Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).</li><li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability.">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li><li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration.">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated,+Neurotrophic+Factor-Dependent,+Human+Neuron-Like+Cells.">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li></ol>

우리는 유전자 발현에 핵 타우 단백질의 영향을 측정하는 방법을 기술한다. 이 프로토콜을 사용하면 세포질 타우의 기여가 강력하게 제한됩니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포의 분화, 핵 구획에서 타우 단백질의 세포 분열 및 국소화.
먼저, 대표적인 결과 섹션에 나타난 바와 같이, RA 및 BDNF를 첨가하여 SH-SY5Y 세포의 분화는 ?...

핵에서 타우 단백질의 기능은 핵산1,2,3,4,5,6과밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났기 때문에 최근 몇 년 동안 상당한 관심을 얻고 있다. 실제로, 최근 게놈 전체 연구는 타우가 생체 내에서 genic 및 intergenic DNA 서열을 결합한다는 것을 보여주었습니다7. 뉴클레올라 조직에서의 역할은8,9,10,11로제안되었다. 더욱이, 타우는 산화 및 고열 스트레스5,10,12,13,돌연변이 타우가 염색체 불안정성 및 이수성 및 이수성14,15,16에연결되는 반면, 산성 및 고열 스트레스로부터 DNA 보호에 관여하는 것으로 제안되었다.
지금까지 핵구획에서 타우의 기능을 연구하는 과제는 세포질 타우의 기여에서 핵타우의 구체적인 기여를 해부하는 어려움으로 인해 거의 해결되지 않았다. 더욱이, 핵 구획에 있는 타우 분자에 기인하는 기능은, 지금까지, 핵 타우 단백질의 직접적인 관여의 명백한 데모가 결여되기 때문에, 단지 상관관계가 있습니다. 실제로, 타우가 레트로트랜스포손의 이동성 또는 rRNA 전사 또는 DNA 보호에 11,12,17,18,19의 관여는 또한 세포질 타우의 기여 또는 핵 타우와 관련이 없는 다른 다운스트림 요인의 효과에 의해 설명될 수 있다.
여기서, 우리는 핵국극화(NLS) 또는 핵수출신호(NES)로 태그된 타우컨스0N4R의 사용과 결합된 핵구획을 분리하는 고전적인 절차를 이용하여 이 문제를 해결할 수 있는 방법을 제공한다. 이 접근법은 세포질 구획에서 타우 분자의 유출로 인해 가능한 유물과 관련된 복잡한 문제를 제거합니다. 더욱이, 타우-NLS 및 타우-NES 구성은 핵 구획에서 타우 분자의 농축 또는 배제를 유도하고, 특정 기능에서 핵 타우 분자의 개입에 대한 긍정적 및 음성 적 제어를 제공한다. 이 프로토콜은 기술적으로 용이하고 타우발현(20,21)을재활성화시키는 암세포와 같은 다른 세포 유형에서 타우의 핵기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용가능한 고전적이고 신뢰할 수 있는 방법으로 구성된다. 더욱이, 그것은 다른 구획에 관련되었던 생물학 기능을 해부하기 위하여 세포질 및 핵 둘 다에 존재하는 그밖 단백질에도 적용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Actin Antibody</td>
			<td>BETHYL LABORATORIE</td>
			<td>A300-485A</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti GAPDH Antibody</td>
			<td>Fitzgerald Industries International</td>
			<td>10R-G109a</td>
			<td>anti-mouse WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti H2B Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:15000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tau-13 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-21796</td>
			<td>anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tubulin alpha Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-16891</td>
			<td>anti-mouse WB 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti VGluT1 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAb91041</td>
			<td>anti-mouse WB 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-Grade Blocker</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOVIN SERUM ALBUMIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5678093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium Low Glucose</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM0060L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ml</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide</td>
			<td>nunc</td>
			<td>177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>cationic lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40,872-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml, 100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Step 3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supported Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Plate 6well</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ml</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>Step 3.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes

타우는 뉴런에서 발현되는 미세소관 결합 단백질이며, 그 주요 알려진 기능은 세포골격 안정성의 유지와 관련이 있다. 그러나, 최근의 증거는 타우가 DNA 보호, rRNA 전사, 레트로 트랜스포손의 이동성 및 구조 적 조직에 연루된 핵을 포함한 다른 세포 외 구획에도 존재한다는 것을 나타냈다. 핵균. 우리는 최근에 핵 타우가 VGluT1 유전자의 발현에 관여한다는 것을 보여주었습니다, 알츠하이머 병의 초기 단계에서 조미료 방출의 병리학적 증가를 설명할 수 있는 분자 기계장치를 건의하. 최근까지, 표적 유전자의 발현을 조절하는 핵타우의 개입은 세포질 타우의 기여의 배제 또는 다른 그 효과의 배제를 방지하는 기술적 한계로 인해 상대적으로 불확실하고 모호하게 되어 왔다. 핵 타우와 관련이없는 다운 스트림 요인. 이러한 불확실성을 극복하기 위해, 우리는 핵타우 단백질에 의해 특이적인 변조된 표적 유전자의 발현을 연구하는 방법을 개발하였다. 우리는 세포화 신호와 세포분열의 사용을 결합하는 프로토콜을 채택하여 세포질 타우 분자로부터의 간섭을 배제할 수 있게 했습니다. 가장 주목할 만한, 프로토콜은 쉽고 다른 세포 유형 및 세포 조건에서 Tau의 핵 기능을 연구하기 위해 광범위하게 적용 가능한 고전적이고 신뢰할 수있는 방법으로 구성됩니다.

세포질 타우 단백질의 기여를 피하는 유전자 발현에서 핵타우의 영향을 해부하는 데 사용되는 전략은 도 1에도시되어 있다. 간단히, NLS 또는 NES로 태그된 타우 단백질은 각각 핵 구획에서 축적되거나 배제된다. 이러한 불균형의 기능적 효과는 VGluT1 유전자의 생성물로 측정된 유전자 발현의 변화이다.
프?...

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Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

타우는 세포질과 미세관을 결합하는 핵에 모두 존재하는 신경 단백질로 알츠하이머 병 관련 유전자의 변조를 포함한 틀에 얽매이지 않는 기능을 발휘합니다. 여기서, 우리는 세포질 타우에서 오는 간섭을 배제하면서 핵타우의 기능을 조사하는 방법을 설명한다.

질병 관련 유전자의 발현을 조사하는 도구로 타우 세포 국소화의 변조

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

이 방법은 잠재적인 세포질 타우 오염을 제외하면서 핵 구획에서 타우의 직접적인 역할에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 세포 유형과 다른 세포 조건하에서 타우의 핵 기능에 대한 연구에 광범위하게 적용 가능하다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 지아코모 시아노, 내 실험실에서 포스트 닥터가 될 것입니다.빈 대조군 벡터로 전염되는 5개의 SH-SY5Y 인간 신경아세포종 세포세포를 4회 10회 도금하여 시작하여, 태그가 없는 타우로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NLS로 전염되는 5개의 세포에 4회 10회, 타우-NES에 4회 10회, 타우-NES에 잘 감염되는 5개의 세포에 4회 10회 를 감염한다. 도금 다음 날, 별도로 400 나노그램의 DNA와 양이온 지질의 적절한 양을 우물 당 250 마이크로리터의 1개의 튜브로 배양합니다. 실온에서 5분 후 각 벡터를 1부의 양이온 지질과 결합하고 실온에서 20분 동안 DNA 지질 복합체를 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 37섭씨에서 하룻밤 배양을 위한 적절한 DNA 지질 복합 용액과 함께 각각 2밀리리터의 신선한 완전한 배양 배지와 트랜스펙트의 2밀리리터로 각각 의 수퍼네티츠를 대체한다. 다음 날, 슈퍼네티츠를 신선한 분화 매체로 대체하십시오. 웨스턴 블롯 분석을 위해, PBS와 각각 잘 각 우물에서 전염 및 분화 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 4 분 동안 잘 당 0.1 %의 500 마이크로 리터로 세포를 배양한다.세포가 분리되면, 완전한 매체의 동등한 부피로 반응을 멈추고 각 우물에서 각 우물에서 원심분리를 위한 개별 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 수퍼네이션을 조심스럽게 제거한 후, 두 번째 원심분리를 위해 튜브당 PBS의 1밀리리터로 펠릿을 다시 중단하고 슈퍼네티츠를 다시 제거한다. 총 단백질 추출물의 경우, 프로테아제와 인산염 억제제로 보충된 용해 완충제의 50~100마이크로리터에서 30분 동안 펠릿을 얼음에 배양합니다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리기 추출물을 16, 000배 g에서 15분간, 임의의 표준 정량화 분석으로 단백질 농도를 정량화한다. 그런 다음 각 단백질 샘플 20 마이크로그램을 4X Laemmli 버퍼 5개마이크로리터와 총 20마이크로리터에 혼합하고 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 끓입니다. 세포 전분획의 경우, 계산을 위해 전체 배지에서 세포를 다시 중단하고 샘플당 6개의 세포로 10번 아래로 회전합니다.세포균 분획을 격리하려면 펠릿을 100 마이크로리터의 얼음 차가운 세포질 추출 버퍼에 10분 동안 부드러운 혼합으로 섭씨 4도의 프로테아제 억제제로 보충합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 미리 차가운 튜브로 슈퍼 네이션을 전송합니다. 프로테아제 억제제로 보충된 100마이크로리터의 얼음 냉막 추출 버퍼를 펠릿에 넣고 4°C에서 부드러운 믹싱을 10분간 배양합니다.그런 다음 4섭씨 에서 5분 동안 펠릿을 원심분리하고 3, 000배 g로 펠릿을 수집하고 수퍼네티츠를 새로운 튜브로 수집합니다. 수용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제로 보충된 50마이크로리터를 펠릿에 넣고 30분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다.불용성 핵 분획을 수집하려면 프로테아제 억제제, 염화칼슘 및 미세 코칼 뉴클레아제로 보충된 50개의 핵 추출 버퍼를 소용돌이가 있는 펠릿에 추가합니다. 피질 및 원심분리 전에 섭씨 37도에서 5분간 샘플을 배양합니다. 그런 다음 초월체를 수집합니다.사이토셀레탈 분획을 수집하려면, 피질이 있는 펠릿에 프로테아제 억제제로 보충된 시토스켈레탈 추출 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 10 분 잠복 후 샘플을 원심 분리하고 초월제를 수집합니다. SDS-PAGE 분석을 위해, 수집된 각 세포극 분수 샘플의 20 마이크로리터에 4X Laemmli 버퍼의 7개의 마이크로리터를 추가하고 5분 동안 섭씨 100도에서 샘플을 끓입니다.인큐베이션이 끝나면 샘플을 아크릴아미드 젤에 적재하고 120볼트의 일정한 전압으로 전기포전을 수행합니다. 그런 다음 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 90분 동안 250밀리암페어로 옮킵니다. Ponceau 염색 용액에서 5분 동안 멤브레인을 배양하여 적절한 단백질 젤 전기포고증과 성공적인 블로팅을 확인합니다.인큐베이션이 끝나면, 백그라운드가 깨끗할 때까지 증류수로 멤브레인을 헹구고 셰이커에서 10분 동안 Tween 20으로 보충된 트리스 버퍼링 식염수로 연속 세척하여 얼룩을 제거합니다. 다음으로, 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 20을 세척당 5분간 세 번 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 블로킹 용액을 차단하여 멤브레인을 배양합니다. 마지막 세척 후, 4섭씨에서 밤새 차단용에 대한 관심의 1차 항체와 멤브레인을 혼성화하고 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 5분 동안 3개의 세척으로 한다.마지막 세척 후, 적절한 고추냉이 과록시다제 공액으로 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 차단한 이차 항체로 혼합한 후 트리스 버퍼식식염수와 Tween 20을 세척당 5분 동안 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 화학 발광을 사용하여 단백질 밴드를 감지하고 ImageJ에 의해 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 정량화. 망막산과 뇌 유래 신경영양인이 없는 경우, 미분화 된 SH-SY5Y 세포는 둥근 형태학을 가정하고 세포 덩어리를 형성한다.예상대로, 망막산으로 5 일 치료 후, 덩어리가 풀림과 세포가 확산. 뇌 유래 신경 영양인을 가진 처리의 3 추가 일 후에, 세포는 분지 중성염의 네트워크를 통해 균일하게 분포되고 상호 연결된 나타납니다. 타우-NLS 또는 타우-NES 경질 후, 타우 아세포 지역화는 항타우 항체를 가진 면역 형광에 의해 검출될 수 있다.배혈의 효율에 따라, 세포는 타우-NLS 트랜스페션 후 DAPI 신호와 병합되는 강력한 핵 염색 또는 타우-NES 후 빈 핵과 세포질 얼룩을 표시한다. 웨스턴 블롯 분석은 세포골격 분획 내의 액틴의 농축, 세포질 및 세포골격 분획 내의 튜룰린, 핵 분획 내의 H2B를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 총 추출물에서 핵 구획 및 vesicular 조미료 수송기 1발 내에서 태그가 지정되고 태그되지 않은 타우의 발현을 확인합니다.실제로 용해성 핵과 세포질 분획에서 타우의 비율은 타우-NES가 감소하는 동안 수용성 핵 분획에서 타우-NLS가 매우 풍부하다는 사실을 강조합니다. 또한 타우-NLS는 세포질 분획에 대하여 크로마틴 결합 분획이 풍부해지며 타우-NES는 감소한다. 각 샘플의 분획에 사용되는 세포의 수를 주의 깊게 확인하고 적절한 분획에서 하우스 키핑 유전자의 농축을 확인해야합니다.이 비디오를 시청한 후 셀룰러 구획을 분리하고 핵에서 타우의 기능적 역할을 평가할 수 있어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

연구

유전학

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

성인 및 신생아 쥐의 내 귀에 로컬 약물 전달에 대 한 외과 접근으로 Canalostomy

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: 킬러 세포 같은 면역 글로불린 수용 체 유전자의 양적 반자동 입력

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...