Name: modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

Bu çalışma Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

1. Hücre Kültürü
<ol><li>Kültür SH-SY5Y hücreleri (insan nöroblastom hücre hattı, CRL-2266) tam ortamda (Dulbecco modifiye Kartal orta: besin karışımı F12 [DMEM / F-12] ile birlikte 10% fetal sığır serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg/mL streptomyc). Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'debir kuvözde saklar. Hücreleri 10 cm'lik tabaklarda büyütün ve konca olduğunda bölün.</li>
</ol>2. Hücre Farklılaşması
<ol><li>SH-SY5Y hücrelerini ayır...

<ol>
	<li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration.">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li><li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain.">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li><li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures.">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li><li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+evidence+on+&#945;-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC*+rich+DNA:+Relevance+to+neurological+disorders.">New evidence on &#945;-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy &amp; Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li><li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand,+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation.">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li><li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation.">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li><li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions.">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li><li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical,+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein.">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).</li><li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus.">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li><li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Tau,+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection.">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li><li>Sj&#246;berg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA:+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization.">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li><li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions.">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li><li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure.">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau:+Involvement+in+chromosome+stability.">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome.">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy.">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li><li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies.">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li><li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer's+Disease.">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li><li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response.">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).</li><li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer.">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li><li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells.">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li><li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia.">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li><li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-&#954;B+p65+and+binding+to+cytokine+promoters:+Importance+of+extracellular+domain.">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-&#954;B p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li><li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice.">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li><li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation.">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li><li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes.">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li><li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation.">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li><li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex.">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li><li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells.">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li><li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomics:+Methodologies+and+Analysis.">Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis.</a> Functional Genomics. , (2012).</li><li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+Modulates+VGluT1+Expression.">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li><li>Serdar, B. S., Ko&#231;t&#252;rk, S., Akan, P., Erkmen, T., Erg&#252;r, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells?.">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?.</a> Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).</li><li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability.">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li><li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration.">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).</li><li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated,+Neurotrophic+Factor-Dependent,+Human+Neuron-Like+Cells.">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li></ol>

Nükleer Tau proteininin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini ölçmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol ile sitoplazmik Tau'nun katkısı kuvvetle sınırlıdır. Bu protokolün kritik adımları şunlardır: insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşması, subsellüler fraksiyonu ve nükleer bölmede Tau proteinlokalizasyonu.
İlk olarak, temsili sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, SH-SY5Y hücrelerinin RA ve BDNF ekleyerek farklılaşması kültürde nöron benze...

Çekirdekteki Tau proteininin işlevleri son yıllarda önemli bir ilgi kazanmıştır, çünkü nükleik asitler1,2,3,4,5,6ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir. Nitekim, yeni bir genom çapında çalışma Tau in vivo7jenik ve interjenik DNA dizileri bağlar gösterdi . Nükleolar organizasyonda bir rol8,9,10,11önerilmiştir. Ayrıca, Tau oksidatif ve hipertermik stres e karşı DNA koruması dahil olmak için önerilmiştir5,10,12,13, mutasyona uğramış Tau kromozom istikrarsızlığı ve aneuploidy14bağlantılı ise,15,16.
Şimdiye kadar, nükleer bölmede Tau'nun işlevlerini incelemedeki zorluklar, nükleer Tau'nun sitoplazmik Tau'nun katkısının incelenmesindeki güçlükler nedeniyle neredeyse çözülemedi. Dahası, nükleer bölmedeki Tau moleküllerine atfedilen fonksiyonlar, şimdiye kadar, sadece nükleer Tau proteinlerinin doğrudan tutulumu na dair açık bir gösteri den yoksun oldukları için ilişkilidir. Gerçekten de, retrotranspozons veya rRNA transkripsiyon veya DNA koruması11,12,17,18,19 hareketlilik Tau katılımı da sitoplazmik Tau katkısı veya nükleer Tau ile ilgili olmayan diğer downstream faktörlerin etkisi ile açıklanabilir.
Burada, nükleer lokalizasyon (NLS) veya nükleer ihracat sinyalleri (NES) ile etiketlenmiş 0N4R yapıları ile birlikte nükleer bölmeyi izole etmek için klasik bir prosedürden yararlanarak bu sorunu çözebilecek bir yöntem salıyoruz. Bu yaklaşım, Sitoplazmik bölmeden Tau moleküllerinin dökülmesi nedeniyle olası eserlerile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır. Ayrıca, Tau-NLS ve Tau-NES yapıları, nükleer Tau moleküllerinin belirli bir fonksiyonda yer alması için olumlu ve olumsuz kontroller sağlayarak, sırasıyla, nükleer bölmeden Tau moleküllerinin zenginleşmesini veya dışlanmasını sağlar. Protokol teknik olarak kolaydır ve geniş diğer hücre tiplerinde Tau nükleer fonksiyon çalışması için geçerli olan klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur, farklılaşmış ya da değil, Tau ifade yeniden kanser hücreleri gibi20,21. Ayrıca, farklı bölmelerle ilgili biyolojik fonksiyonları incelemek için hem sitoplazmada hem de çekirdekte bulunan diğer proteinlere de uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td>IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Actin Antibody</td>
			<td>BETHYL LABORATORIE</td>
			<td>A300-485A</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti GAPDH Antibody</td>
			<td>Fitzgerald Industries International</td>
			<td>10R-G109a</td>
			<td>anti-mouse WB 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti H2B Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1790</td>
			<td>anti-rabbit WB 1:15000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tau-13 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-21796</td>
			<td>anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti Tubulin alpha Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA5-16891</td>
			<td>anti-mouse WB 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti VGluT1 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMAb91041</td>
			<td>anti-mouse WB 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EMPO14500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting-Grade Blocker</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOVIN SERUM ALBUMIN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5678093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium Low Glucose</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM0060L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0390-100ml</td>
			<td>pH=8 0.5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>EC50182L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG-HPR</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>WB 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896-50ml</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon Western</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>WBKLS0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide</td>
			<td>nunc</td>
			<td>177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3000D</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12566014</td>
			<td>cationic lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322415-6X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>40,872-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/ml, 100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)</td>
			<td>OXOID</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosStop</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>phosphatase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Step 3.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supported Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1620097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-Plate 6well</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>833,920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP2 laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ml</td>
			<td>Non-ionic surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td>Step 3.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modulation of tau subcellular localization as a tool to investigate the expression of disease-related genes

Tau nöronlarda ifade edilen bir mikrotübül bağlayıcı proteindir ve bilinen ana işlevi sitoskeletal stabilitenin sürdürülmesi ile ilgilidir. Ancak, son kanıtlar Tau'nun DNA koruması, rRNA transkripsiyonunda, retrotranspozonların hareketliliğinde ve nükleolus. Yakın zamanda nükleer Tau'nun VGluT1 geninin ekspresyonunda yer aldığını gösterdik, Alzheimer hastalığının erken evrelerinde glutamat salınımının patolojik artışını açıklayabilecek moleküler bir mekanizma öneriyoruz. Yakın zamana kadar, nükleer Tau'nun hedef genlerin ekspresyonunu modüle etmedeki rolü, sitoplazmik Tau'nun katkısının dışlanmasını veya diğer genlerin etkisini engelleyen teknik sınırlamalar nedeniyle nispeten belirsiz ve belirsiz olmuştur. nükleer Tau ile ilgili olmayan aşağı faktörler. Bu belirsizliğin üstesinden gelmek için, özellikle nükleer Tau proteini tarafından modüle edilen hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için bir yöntem geliştirdik. Yerelleştirme sinyallerinive hücre altı fraksiyonlarını çiftlerin sitoplazmik Tau moleküllerinden parazitin dışlanmasını sağlayan bir protokol uyguladık. En önemlisi, protokol kolaydır ve diğer hücre tipleri ve hücresel koşullarda Tau'nun nükleer işlevini incelemek için geniş uygulanabilir klasik ve güvenilir yöntemlerden oluşur.

Sitoplazmik Tau proteinlerinin katkısından kaçınarak nükleer Tau'nun gen ekspresyonundaki etkisini incelemek için kullanılan strateji Şekil 1'degösterilmiştir. Kısaca, TAU proteinleri NLS veya NES ile etiketlenmiş veya nükleer bölme dışında, sırasıyla birikir. Bu dengesizliğin fonksiyonel etkisi VGluT1 geninin ürünü olarak ölçülen gen ekspresyonunun değiştirilmesidir.
Pro...

Watch this Scientific Journal Video about Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes at JoVE.com

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Bu yöntem, herhangi bir potansiyel sitoplazmik tau kontaminasyonhariç nükleer bölmede tau doğrudan rolü hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tau'nun diğer hücre tiplerinde ve farklı hücresel koşullarda nükleer işlevi üzerine yapılan çalışmaya geniş ölçüde uygulanabilir olmasıdır. Prosedürü gösteren Giacomo Siano, benim laboratuvar bir post-doc olacaktır.Dört kez 10 beş SH-SY5Y insan nöroblastom hücre hücreleri için kaplama ile başlayın boş kontrol vektörü ile transfected olmak, dört kez 10 beş hücre etiketsiz tau ile transfected olmak, dört kez 10 beş hücre tau-NLS ile transfected olmak, ve dört kez 10 beş hücre ye göre tau-NES ile altı plaka-iyi bir tabak bireysel kuyularına transfected olmak. Kaplamadan bir gün sonra, ayrı ayrı 400 nanogram DNA ve katyonik lipidlerin uygun hacmini her kuyuda 250 mikrolitre azaltılmış serumdan oluşan bir tüpe kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, katyonik lipid her vektör ü bir hacim birleştirmek ve oda sıcaklığında 20 dakika DNA lipid kompleksleri kuluçka.Kuluçka sonunda, her kuyudaki süpernatantları iki mililitre taze tam kültür ortamıile değiştirin ve her kuyuda 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için uygun DNA lipid kompleksi solüsyonu ile transfect. Ertesi gün, supernatants taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. Batı Blot analizi için, her kuyudaki transfected ve farklılaşmış hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri 500 mikrolitre 0,1 Tripsin ile kuluçkaya yatırın ve hücreleri 37 santigrat derecede dört dakika boyunca iyi başına %0,1 Tripsin'e dönüştürün.Hücreler ayrıldığında, tam orta eşit hacimli reaksiyonu durdurmak ve santrifüj için ayrı tüpler içine her kuyudan hücre süspansiyon aktarın. Supernatants dikkatlice çıkardıktan sonra, ikinci bir santrifüj için tüp başına PBS bir mililitre pelet yeniden askıya ve tekrar supernatants kaldırın. Toplam protein ekstreleri için, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye lisis tampon 50 ila 100 mikrolitre buz üzerinde 30 dakika pelet kuluçka.Kuluçka sonunda, 16, 000 kez g 15 dakika için ekstresi santrifüj ve herhangi bir standart niceleme testi ile protein konsantrasyonu ölçmek. Daha sonra her protein numunesinin 20 mikrogramını 5 mikrolitre 4X Laemmli tampon ile 20 mikrolitrelik bir hacimle karıştırın ve numuneleri 100 derecede beş dakika kaynatın. Hücre altı fraksiyonu için, sayma için tam ortamda hücreleri yeniden askıya ve örnek başına altı hücre için bir kez 10 aşağı spin.Sitozolik fraksiyonu izole etmek için, 10 dakika boyunca nazik karıştırma ile dört derece santigrat proteaz inhibitörleri ile takviye buz soğuk sitoplazmik ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre pelet kuluçka. Kuluçka sonunda, santrifüj ile örnekleri toplamak ve önceden soğutulmuş tüpler içine supernatants aktarın. Hafif karıştırma ile dört derece santigrat bir 10 dakikalık kuluçka için pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen buz soğuk membran ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre ekleyin.Sonra dört santigrat derece ve 3, 000 kez g beş dakika için pelet santrifüj ve yeni tüpler içine supernatants toplamak. Çözünür nükleer fraksiyonu toplamak için, 30 dakika boyunca dört derece santigrat örnekleri kuluçkadan önce girdap ile girdap ile pelet proteaz inhibitörleri ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, örnekleri santrifüj ve supernatants toplamak.Çözünmez nükleer fraksiyonu toplamak için, girdap ile peletlere proteaz inhibitörleri, kalsiyum klorür ve mikrokokal nükleaz ile desteklenen nükleer ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Girdap ve santrifüj önce 37 santigrat derece beş dakika boyunca örnekleri kuluçka. Sonra supernatants toplamak.Sitosiskelet fraksiyonu toplamak için, girdap ile peletprote inhibitörleri ile desteklenen sitoskeletal ekstraksiyon tampon 50 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçkadan sonra, numuneleri santrifüj edin ve süpernatantları toplayın. SDS-PAGE analizi için, toplanan hücre altı fraksiyon örneklerinin her birine 20 mikrolitre 4X Laemmli tampon yedi mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca 100 santigrat derecede örnekleri kaynatın.Kuluçka sonunda, örnekleri akrilamid jelüzerine yükleyin ve elektroforezi 120 voltluk sabit bir voltajda gerçekleştirin. Daha sonra proteinleri 250 miliamperde 90 dakika nitroselüloz membrana aktarın. Uygun protein jelelektroforezve başarılı bir lekelenme kontrol etmek için Ponceau boyama çözeltisi beş dakika boyunca membran kuluçka.Kuluçka sonunda, arka plan temiz olana kadar damıtılmış suda membran durulayın ve tris-tamponlu salin ile sürekli yıkama ile leke kaldırmak 20 Bir shaker üzerinde 10 dakika Ara ile takviye. Daha sonra, tris-tamponlu salin artı Tween 20 yıkama başına beş dakika yıkama ile üç kez yıkamadan önce sallayarak oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi ile membran kuluçka. Son yıkamadan sonra, dört derece santigrat de bir gecede çözüm engelleme ilgi birincil antikor ile membran hibrid tris-tamponlu tuzlu artı Tween 20 ile üç yıkama takip beş dakika.Son yıkamadan sonra, tris-tamponlu tuzlu artı Tween ile membran yıkama başına beş dakika için 20 üç kez yıkamadan önce oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleme çözeltisi uygun bir horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ile membran hibridize. Son yıkamadan sonra, kemilüminesans kullanarak protein bandını tespit edin ve ImageJ ile Western Blot bantlarının yoğunluğunu ölçün. Retinoik asit ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör yokluğunda, farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri yuvarlak morfolojisi varsayar ve hücre kümeleri oluştururlar.Beklendiği gibi, retinoik asit ile tedavi beş gün sonra, kümeleri gevşemek ve hücreler yayıldı. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile tedavi üç ek gün sonra, hücreler düzgün dağıtılmış ve dallı nöritler bir ağ üzerinden birbirine görünür. Tau-NLS veya tau-NES transfeksiyonundan sonra, tau subsellüler lokalizasyonu anti-tau antikorları ile immünoresans ile saptanabilir.Transfeksiyonun etkinliğine bağlı olarak, hücreler tau-NLS transfeksiyonu veya tau-NES sonrası boş çekirdeklerle sitoplazmik boyama sonrasında DAPI sinyali ile birleşen güçlü bir nükleer boyama görüntüler. Batı Blot analizi sitoskelet fraksiyonu içinde aktin zenginleştirme ortaya koymaktadır, sitoplazmik ve sitoskeletal fraksiyonları içinde tubulin, ve h2B nükleer fraksiyonları içinde. Batı Blot analizi de toplam ekstresi ve veziküler glutamat taşıyıcı içinde etiketli ve etiketsiz tau ifadesini doğrular.Gerçekten de, çözünür nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlarda tau oranı tau-NLS yüksek çözünür nükleer fraksiyonu zenginleştirilmiş ise tau-NES azalmıştır gerçeğini vurgulamaktadır. Ayrıca, tau-NLS sitoplazmik fraksiyona göre kromatin bağlı fraksiyonu zenginleştirilmiş ise tau-NES azalır. Her numunenin fraksiyonu için kullanılan hücre sayısını dikkatlice kontrol ettiğinizden ve uygun kesirlerde temizlik genlerinin zenginleştirmesini doğruladığından emin olun.Bu videoyu izledikten sonra, hücresel bölmeleri izole etmek ve çekirdek tau fonksiyonel rolünü değerlendirmek gerekir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Canalostomy yerel ilaç dağıtım yetişkin ve Neonatal farelerin iç kulaklarına bir cerrahi yaklaşım olarak

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: nicel Semi-automated yazmaktan katil hücreli immünglobulin benzeri reseptör gen

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...