Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Forfatterne takker DRs. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gennemgang af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af High point Universitetets forskning og sponsorerede programmer (MCS) og den bioteknologiske program på North Carolina State University (MCS).

1. præparater
Bemærk: den protokol, der er beskrevet nedenfor, er optimeret til brug med REF52-celler og ATM+/+ eller ATM-/- humane fibroblaster. Andre celletyper kan kræve yderligere optimering som beskrevet i afsnittene noter og fejlfinding nedenfor.
<ol><li>Lav 500 mL komplet cellekulturmedium for REF52 celler. Til 500 mL højt glucose indeholdende Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) tilsættes 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 100 enheder/mL penicillin-strept...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her, er en alsidig og økonomisk måde til hurtigt at screene en række forankrings afhængige celletyper til dynamisk cytoskelet remodeling under celle spredning. Især undersøger denne metode kvantitativt stress fiber og fokal vedhæftnings dannelse under oxidativ stress, når cellerne overholder FN (figur 1a). Desuden kan disse cellulære fænotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer af Rho familien af små gtpases, da de har dokumenteret roller un...

Celle-matrix sammenvoksninger (dvs. fokale sammenvoksninger) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser, som mægle celle vedhæftning og spredning. Disse processer er afgørende for vævs udvikling, vedligeholdelse og fysiologiske funktion. Fokale sammenvoksninger er sammensat af membran-bundne receptorer, såsom integriner, samt stilladser proteiner, der forbinder cytoskelet actin til den ekstracellulære matrix (ECM)1. Disse komplekser er i stand til at reagere på fysisk-kemiske signaler til stede i det ekstracellulære miljø gennem aktivering af forskellige signalering transduktionsveje. Som sådan, fokale sammenvoksninger tjene som signalering centre til at udbrede ekstracellulære mekaniske signaler i en række cellulære processer, herunder instrueret migration, celle cyklus regulering, differentiering, og overlevelse1,2. En gruppe af signalering molekyler, der regulerer og interagerer med fokale sammenvoksninger omfatter medlemmer af Rho familien af små GTPases. Rho GTPases er nøgle proteiner, der regulerer celle migration og vedhæftnings dynamik gennem deres specifikke spatiotemporale aktivering3. Ikke overraskende, dysregulering af Rho protein funktion har været impliceret i en række menneskelige patologier såsom metastase, angiogenese, og andre. Af særlig interesse, cellulære redox status spiller en fremtrædende rolle i modulering af celle migration og vedhæftning. Ændringer i redox homøostase, såsom stigninger i reaktive oxygenarter (ros), er blevet påvist at regulere Rho protein aktivitet, samt vedhæftning, i en række celletyper og sygdomme hos mennesker4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer, der lider af den neurologiske lidelse Ataxia-telangiectasia (A-T), som er forårsaget af en mutation i DNA-skade reparation Serin/threonine kinase A-T-muteret (ATM), har en øget risiko for metastatisk kræft9, 10. Tab af ATM kinaseaktivitet hos disse patienter og cellelinjer, enten gennem genetisk mutation eller kemisk hæmning, resulterer i høje niveauer af oxidativ stress på grund af dysfunktion af pentose fosfat pathway7,11, 12. Desuden har nylige undersøgelser fra laboratoriet fremhævet en patofysiologisk rolle for ROS i A-T ved at ændre cytoskelet dynamik (dvs. vedhæftning og spredning) som et direkte resultat af aktivering af Rho Family GTPases in vitro5. Isidste ende kan disse ændringer i cytoskelet dynamik forårsaget af Rho familie aktivering føre til den øgede risiko for metastatisk kræft konstateret i A-T patienter5,13. Derfor kan forståelse af samspillet mellem celle-matrix interaktioner under oxidativ stress give indsigt i reguleringen af vedhæftning og spredning. Disse undersøgelser kan også sætte scenen for yderligere undersøgelser af en mulig rolle for Rho Family GTPases i disse signalerings processer.
Beskrevet heri er en protokol til at studere den tidlige cellulære dynamik af vedhæftning samling og spredning under oxidativ stress forårsaget af hæmning af ATM kinase aktivitet. Denne analyse er baseret på den velkarakteriserede mekanisme af forankring-afhængige celler vedhæftning til ECM protein fibronektin (FN). Når celler opretholdes i suspension er belagt på FN, flere Rho gtpases koordinere kontrol af actin cytoskelet remodeling3,14. Morfologiske ændringer observeres som celler skifte fra runde og cirkulære i udseende til fladtrykt og ekspanderet. Samtidig med disse observationer er udviklingen af talrige matrix sammenvoksninger med ECM. Disse ændringer tilskrives bifasisk aktivering af rhoa med Rac1 i løbet af den første time, da cellerne klæber og spredes 15,16.
En række forskellige metoder er blevet udnyttet til at undersøge vedhæftnings morfologi og dynamik samt celle spredning. Men disse metoder er afhængige af sofistikerede langsigtede, Live-imaging samlede interne refleksion fluorescens (TIRF) eller confokale mikroskopi systemer. Således, brugere skal have adgang til specialiseret udstyr og software. Desuden gør den opsatte tid, der kræves af disse Bio-Imaging systemer, indfangning af tidlige vedhæftnings hændelser udfordrende, især ved testning af flere hæmmere eller behandlingsbetingelser samtidig.
Metoderne detaljeret, heri, giver en enkel, økonomisk, men alligevel kvantitativ måde at vurdere parametre, der regulerer vedhæftnings samlingen og sprede in vitro. Protokollen udføres ved hjælp af almindeligt tilgængelige laboratorieudstyr, såsom et epifluorescens mikroskop og CCD-kamera. Denne analyse omfatter anvendelse af forankrings afhængige celler på en FN-belagt overflade efter en periode med oxidativt stress forårsaget af kemisk hæmning af ATM kinaseaktivitet, hvilket tidligere er påvist5. Efter plating, er cellerne tilladt at vedhæfte og overholde specificerede længder af tid. Ikke-tilsluttede celler vaskes væk, mens tilknyttede celler er faste og mærket med fluorescens baserede antistoffer til markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og breder sig (f.eks. f-actin)2,5. Disse proteiner visualiseres og registreres derefter ved hjælp af et epifluorescens mikroskop. Efterfølgende dataanalyse udføres ved hjælp af frit tilgængelige Fiji software. Desuden kan denne metode tilpasses til at undersøge vedhæftnings dynamik under en lang række betingelser, herunder forskellige ECM-proteiner, behandling med forskellige oxidanter/celle dyrkningsbetingelser eller en række forankrings afhængige cellelinjer for at løse en bred vifte af biologiske spørgsmål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

Adhæsion og spredning af celler til den ekstracellulære matrix (ECM) er essentielle cellulære processer under organismal udvikling og til homeostase af voksent væv. Interessant, oxidativ stress kan ændre disse processer, og dermed bidrage til Patofysiologi af sygdomme som metastatisk kræft. Derfor forståelse mekanismen (r) af, hvordan cellerne vedhæfte og sprede på ECM under forstyrrelser i redox status kan give indsigt i normale og sygdomstilstande. Beskrevet nedenfor er en Step-Wise protokol, der udnytter en immunofluorescens-baseret assay til specifikt kvantificere celle vedhæftning og spredning af udødeliggjort fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, forankrings-afhængige celler holdes i suspension og udsat for ATM kinase-hæmmer Ku55933 at fremkalde oxidativt stress. Cellerne er derefter belagt på FN-belagt overflade og lov til at vedhæfte i forudbestemte perioder. De celler, der forbliver fastgjort, er faste og mærket med fluorescens baserede antistof markører for adhæsion (f. eks. paxillin) og spreder sig (f. eks. F-actin). Data opsamling og-analyse udføres ved hjælp af almindeligt tilgængeligt laboratorieudstyr, herunder et epifluorescens mikroskop og frit tilgængeligt Fiji-software. Denne procedure er meget alsidig og kan ændres for en række forskellige cellelinjer, ECM proteiner, eller hæmmere for at undersøge en bred vifte af biologiske spørgsmål.

Et generelt skema for den eksperimentelle opsætning
Figur 1 repræsenterer det generelle skema for celle vedhæftnings-og sprednings protokollen begyndende med serum-sult af REF52 celler og slutter med beregningsmæssige analyse af erhvervede fluorescensbilleder. De vigtigste trin i protokollen er illustreret på tidslinjen. Bemærk, at trin 2 i protokollen beskriver forberedelsen af de FN-belagte dæksedler, som skal udføres samtidig med trin 3: serum sultende RE...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Denne metode er nyttig til at kvantificere den tidlige dynamik i cellulær vedhæftning og spredning af forankring-afhængige celler på fibronectin. Desuden kan denne analyse anvendes til at undersøge virkningerne af ændret redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedhæftning-relaterede intracellulære signalering veje.

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Denne metode vil gøre det muligt for forskere at kvantificere den tidlige dynamik cellulære vedhæftning og spredning af forankring-afhængige celler på den ekstracellulære matrix protein fibronectin under oxidativstress. Denne teknik er alsidig og kan tilpasses til at undersøge cytoskeletal dynamik under en bred vifte af betingelser. Desuden udføres dataindsamling og -analyse ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr og frit tilgængelig software.Forståelse af mekanismerne for, hvordan celler binder og spredes på ECM under ændringer i redox-status, kan give værdifuld indsigt i normal- og sygdomstilstande, såsom metastatisk kræft. Denne metode kan bruges til at undersøge cellespredning og vedhæftning under forskellige cellekulturforhold, forankringsafhængige cellelinjer og/oxidanter for at besvare en bred vifte af biologiske spørgsmål. Der er mange reagenser, der kræves for at udføre denne teknik.Derfor er det vigtigt, at alle løsninger er lavet på forhånd, før du begynder. I en BSL-II certificeret laminar flow hætte, der er fastsat en væv kultur-certificeret 24-brønd plade. Placer en glas coverslip i hver brønd.Mærke pladen i henhold til figur 1B i tekstprotokollen. Dernæst pipette 500 mikroliter af fibronectin opløsning i hver brønd. Pipette opløsningen over hver coverslip et par gange for at sikre en jævn belægning og komplet nedsænkning.Dæk pladen med låget. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i en time. Fjern derefter pladen fra inkubatoren og aspirere fibronectinopløsningen fra brøndene.Vask brøndene tre gange med 500 mikroliter 1X PBS pr. vask. Aspirere den endelige vask af 1X PBS, og blok brønde med 500 mikroliter af en 0,5% delipidated BSA opløsning ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i mindst 15 minutter. Først forvarme de nødvendige løsninger i et vandbad ved 37 grader Celsius.I en BSL-II certificeret laminar flow hætte, starte med et sammenløb monolag af REF52 celler i en 10-kvadratcentet fad og vaske cellerne to gange med seks milliliter varm 1X PBS. Serum sulter cellerne i mindst en time i seks milliliter varm afdædt BSA-opløsning. Dernæst vaskes cellerne med seks milliliter opvarmet 1X PBS.Indsugning af PBS og tilsæt 1,5 milliliter varm 0,5% trypsin-EDTA opløsning. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i cirka to minutter. Overhold cellerne under et lysmikroskop for at sikre, at løsrivelsen er komplet.Hvis cellerne stadig er klæbet efter at have trykket på pladen på bordpladen, skal de returneres til inkubatoren i yderligere to minutter. Pipette 1,5 milliliter varm trypsin neutraliserende opløsning, TNS, til fadet for at stoppe trypsinisering og indsamle fritliggende celler. Pipette opløsningen op og ned over bunden af pladen mange gange for at fjerne alle de resterende klæbende celler.Hvis cellerne ser klumpede ud, tritureres cellesuspensionen yderligere ved forsigtigt at pipettere op og ned over skålens bager. Derefter skal du tælle cellerne ved hjælp af eksempeludelukket ekskludering i en automatisk celletæller. Fjern en passende mængde celler for at skabe en cellesuspension med celletætheden mellem 10, 000 og 30.000 celler pr. milliliter i delipideret BSA i et 15 milliliter konisk rør.Brug en fastvinklet rotor i en bordpladecentrifuge til at centrifuge cellerne ved 300 gange g i fem minutter. Inspirer supernatanten og re-suspension af cellepellet i syv milliliter varm afdæmpet BSA opløsning. Derefter skal cellesuspensionen fordeles jævnt i to koniske rør med 15 milliliter, et til kontrol af køretøjet og et til Ku55933.Ved hjælp af et rør rotator, dreje rørene i 90 til 120 minutter i en celle kultur inkubator ved 37 grader Celsius. 30 minutter før plating, tilsæt Ku55933 og DMSO til hvert rør til en endelig koncentration på 10 mikromolar. Returner cellesuspensionen til rotatoren i den resterende tid.Umiddelbart før cellerne pletteres, skal pladen hentes fra inkubatoren, og den afvædrede BSA-opløsning aspirere. Derefter fjernes 500 mikroliter af cellesuspensionen fra hver behandlingsgruppe, og hver enkelt til en af de fibronectinbelagte dækselssedler i 24-brøndpladen. Fortsæt med at inkubere pladen og celleaffjedringen ved de tidligere forhold.Lad derefter cellerne at holde sig til dækslæbet i den ønskede tid. Når den ønskede tid til vedhæftning er gået, aspirere celleopløsningen fra hver dæksel i pladen. Forsigtigt dispensere 500 mikroliter af 3,7% paraformaldehyd opløsning på hver coverslip ved pipettering ned siderne af brøndene, og vent 10 til 15 minutter.Dernæst fjernes paraformaldehydopløsningen, og hver dækslædel to gange vaskes med 1X PBS med 500 mikroliter PBS pr. vask. Aspirere PBS og permeabilized celler på hver coverslip med 500 mikroliter på 0,2% Triton X-100 og 1X PBS i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter hver dækslæd tre gange med 1X PBS med 500 mikroliter PBS pr. vask.Bloker cellerne på hver dækslet med 500 mikroliter immunofluorescensblokerende buffer i 30 til 60 minutter. Det primære anti-paxillinantistof fortyndes i blokeringsbufferen i et forhold på en til 250. Bland godt og tilsæt 200 mikroliter af antistofopløsningen til hver coverslip.Inkuber ved stuetemperatur i mindst en time. Derefter aspirere antistofopløsningen og vask hver dækslæb med 500 mikroliter på 1X PBS i 10 minutter. Beskyt prøverne mod lys fra dette punkt fremad.Fortynd falloidin F-actin sonden konjugeret til den røde fluorescerende Alexa 594 farvestof og ged anti-mus 488 fluorescerende sekundært antistof i samme blokerende buffer opløsning. Bland godt og tilsæt 200 mikroliter af antistofopløsningen til hver coverslip i 30 minutter. Inspirer antistofopløsningen, og vask hver dækslæb med 500 mikroliter på 1X PBS i 10 minutter.Aspirere PBS og skyl dækslet glider én gang med 500 mikroliter deioniseret vand. Fastgør derefter dækslet på mikroskopdias ved hjælp af anti-fade monteringsmedium, der indeholder DAPI. Efter fiksering og farvning med et anti-paxillin antistof, fluorescerende 8-bit gråtonebilleder af REF52 celler erhverves.Ved afslutningen af alle billedbehandlingstrin bør individuelle fokalesammenvoksninger være fremtrædende, i fokus og let skelnes fra hinanden. Gråtone fluorescens billeder af anti-paxillin og phalloidin F-actin sonde farvede celler er derefter taget efter at være blevet belagt på fibronectin. Fremtrædende fokale sammenvoksninger og stressfibre bør være let synlige i REF52 celler efter at have fået lov til at holde sig på fibronectin i 20 til 30 minutter.F-actin beriget flæser på forkant af cellemembraner er angivet med en pil. Lignende fluorescerende billeder af falloidin F-actin sonde og anti-paxillin farvning analyseres for procentdelen af stressfibre i cellespredning. Især oxidant behandling forårsager en betydelig stigning i stress fiber dannelse på alle vedhæftning tidspunkter undersøgt, og et fald i cellespredning efter 15 minutter af celle vedhæftning til fibronectin.Plating ved højere celletætheder fører til cellulære fortrængning, som forbyder celler fra fuldt ud at sprede sig på grund af overkonfluency. Bemærk, at cellekanterne ikke kan skelnes fra tilstødende celler. Som følge heraf er kvantificering af de enkelte celler udelukket, og spredningsomkreds kan ikke bestemmes nøjagtigt.En separat celle linje af mus embryonale fibroblaster holdes i suspension og derefter belagt på fibronectin i 30 minutter. Celler blev derefter fastsat og farves med en anti-paxillin antistof. Bemærk cellerne uden for fokus.Endvidere vil krydsreaktiviteten af anti-paxillin-antistoffet med cellulært snavs ændre tærskelværdien under kvantitativ billedanalyse og bør ikke indgå i analysen. Under billedbehandling skal du bruge opslagsværktøjet i Fiji til at undersøge billedets histogram, mens du justerer lysstyrken/kontrasten for at undgå faldgruber i forbindelse med signalmætning. Ændringer i vedhæftning og spredning kan påvirke cellemigrering.Metoder til at spore enkelt celle migration, sårheling, eller chemotaxis invasion assays kan afgøre, om ændringer i migration forekommer. Rho familie GTPases regulere celle vedhæftning dynamik gennem deres specifikke rumlige tidsmæssige aktivering. Fænotopypiske ændringer i vedhæftning og spredning under oxidativt stress kan være et tyder på downstream-reguleringsroller for disse proteiner.Denne metode kræver anvendelse af BSL-II cellelinjer og farlige kemiske reagenser. Forskere har brug for kemisk og biologisk sikkerhedsuddannelse som bestemt af deres institutions arbejdsmiljøkontor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Evaluering af virkningen af Protein aggregering på cellulært Oxidative Stress i gær

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulere levende celler til at konstruere stabil 3D cellulære forsamling uden kunstige stillads

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...