Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

De auteurs bedanken drs. Scott R. Hutton en Meghan S. Blackledge voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de High Point University Research en gesponsorde programma's (MCS) en het biotechnologie programma aan de North Carolina State University (MCS).

1. preparaten
Opmerking: het hieronder beschreven protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met REF52 cellen en ATM+/+ of ATM-/- menselijke fibroblasten. Voor andere celtypen is mogelijk verdere optimalisatie vereist, zoals beschreven in de sectie opmerkingen en probleemoplossing hieronder.
<ol><li>Maak 500 mL volledig celkweekmedium voor REF52 cellen. Tot 500 mL hoge glucose bevattende Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) toevoegen 10% FBS, 2 mM L-glutamine, ...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Het hier beschreven protocol is een veelzijdige en voordelige manier om snel een aantal verankerings afhankelijke celtypen te schermen voor dynamische cytoskelet-remodellering tijdens het verspreiden van cellen. In het bijzonder onderzoekt deze methode kwantitatief stress vezels en focale adhesie vorming tijdens oxidatieve stress wanneer cellen zich houden aan FN (Figuur 1a). Bovendien kunnen deze cellulaire fenotypes een regelgevende rol suggereren voor leden van de familie Rho van kleine g...

Celmatrix verklevingen (d.w.z. focale verklevingen) zijn grote en dynamische multimoleculaire proteïne-complexen die de hechting en verspreiding van cellen bemedieren. Deze processen zijn essentieel voor weefsel ontwikkeling, onderhoud en fysiologische functie. Focale verklevingen zijn samengesteld uit membraan-gebonden receptoren, zoals integrinen, evenals steigers eiwitten die cytoskelet actine koppelen aan de extracellulaire matrix (ECM)1. Deze complexen zijn in staat om te reageren op fysiochemische signalen die aanwezig zijn in de extracellulaire omgeving door het activeren van verschillende signalering transductie trajecten. Als zodanig, focale adhesies dienen als signalering centra te propageren extracellulaire mechanische aanwijzingen in een aantal cellulaire processen, met inbegrip van gerichte migratie, celcyclus regulering, differentiatie, en overleving1,2. Een groep van signalering moleculen die reguleren en interactie met focale adhesies omvat leden van de familie van de Rho van kleine GTPases. Rho GTPases zijn belangrijke eiwitten die de Celmigratie en adhesie dynamiek reguleren via hun specifieke spatiotemporele activatie3. Niet verrassend, disregulatie van de Rho eiwit functie is betrokken bij een aantal menselijke pathologieën zoals metastase, angiogenese, en anderen. Van bijzonder belang, cellulaire redox status speelt een overheersende rol in de modulatie van de Celmigratie en adhesie. Veranderingen in redox homeostase, zoals stijgingen van de reactieve zuurstof soorten (Ros), zijn aangetoond dat het reguleren van de Rho-eiwit activiteit, evenals adhesie, in een aantal celtypen en menselijke ziekten4,5,6 ,7,8. Bijvoorbeeld, personen die lijden aan de neurologische aandoening ataxie-Telangiectasia (A-T), die wordt veroorzaakt door een mutatie in de DNA-schade herstel serine/Threonine kinase A-T-gemuleerd (ATM), hebben een verhoogd risico op gemetastaseerde kanker9, 10. Verlies van ATM kinase activiteit bij deze patiënten en cellijnen, hetzij door genetische mutatie of chemische remming, resulteert in hoge niveaus van oxidatieve stress als gevolg van disfunctie van de pentose fosfaat pathway7,11, 12. Bovendien hebben recente studies van het laboratorium een pathofysiologische rol voor ROS in A-T belicht door de cytoskelet dynamiek (d.w.z. adhesie en verspreiding) te veranderen als een direct gevolg van het activeren van de Rho familie GTPases in vitro5. Uiteindelijkkunnen deze veranderingen in de cytoskelet dynamiek veroorzaakt door de activering van de familie Rho leiden tot het verhoogde risico van gemetastaseerde kanker bij A-T patiënten5,13. Daarom kan het begrijpen van het samenspel tussen celmatrix interacties tijdens oxidatieve stress inzicht geven in de regulering van adhesie en verspreiding. Deze studies kunnen ook het podium voor verdere onderzoeken naar een mogelijke rol voor Rho familie GTPases in deze signalering processen.
Hierin beschreven is een protocol voor het bestuderen van de vroege cellulaire dynamiek van adhesie assemblage en verspreiding tijdens oxidatieve stress veroorzaakt door remming van ATM kinase activiteit. Deze test is gebaseerd op het goed gekarakteriseerde mechanisme van verankerings afhankelijke cellen adhesie aan het ECM-eiwit fibronectine (FN). Wanneer cellen in suspensie worden geplateerd op FN, coördineren verschillende Rho gtpases de controle van de actine cytoskelet remodellering3,14. Morfologische veranderingen worden waargenomen als cellen verschuiven van ronde en cirkelvormig in uiterlijk tot afgevlakt en uitgevouwen. Gelijktijdig met deze waarnemingen is de ontwikkeling van talrijke matrix verklevingen met de ECM. Deze veranderingen worden toegeschreven aan de bifasische activering van rhoa met Rac1 tijdens het eerste uur als cellen zich hechten en verspreiden 15,16.
Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt voor het onderzoeken van adhesie morfologie en dynamiek, alsmede de verspreiding van cellen. Deze methoden zijn echter gebaseerd op geavanceerde, op lange termijn, Live-Imaging totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie systemen. Gebruikers moeten dus toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur en software. Bovendien maakt de set-up tijd die nodig is voor deze bio-imagingsystemen het vastleggen van vroege adhesie gebeurtenissen uitdagend, vooral bij het testen van meerdere remmers of behandelings condities gelijktijdig.
De hier beschreven methoden bieden een eenvoudige, economische en toch kwantitatieve manier om parameters te beoordelen die de adhesie-assemblage beheersen en in vitro verspreiden. Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, zoals een epifluorescentie-Microscoop en een CCD-camera. Deze bepaling omvat het toepassen van verankerings afhankelijke cellen op een oppervlak met FN-coating na een periode van oxidatieve stress veroorzaakt door chemische remming van ATM kinase activiteit, die eerder is aangetoond5. Na het bekleden zijn cellen toegestaan om te hechten en zich te hechten voor gespecificeerde lengtes van tijd. Niet-bevestigde cellen worden weggespoeld, terwijl de bijgevoegde cellen zijn bevestigd en geëtiketteerd met fluorescentie-antilichamen tegen markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin)2,5. Deze eiwitten worden vervolgens gevisualiseerd en opgenomen met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Daaropvolgende data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van gratis beschikbare Fiji-software. Bovendien kan deze methode worden aangepast om de adhesie dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken, waaronder verschillende ECM-eiwitten, behandeling met verschillende oxidanten/celkweek omstandigheden of een verscheidenheid aan verankerings afhankelijke cellijnen om een breed scala aan biologische vragen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

De hechting en verspreiding van cellen op de extracellulaire matrix (ECM) zijn essentiële cellulaire processen tijdens de organismale ontwikkeling en voor de homeostase van volwassen weefsels. Interessant is dat oxidatieve stress deze processen kan veranderen en zo bijdraagt aan de pathofysiologie van ziekten zoals gemetastaseerde kanker. Daarom kan het begrijpen van het mechanisme (s) van hoe cellen hechten en zich verspreiden op de ECM tijdens verstoringen in redox status inzicht geven in de normale en ziektetoestanden. Hieronder beschreven is een stapsgewijs protocol dat een immunofluorescentietest gebruikt om specifiek celadhesie en verspreiding van vereeuwigd fibroblast cellen op fibronectin (FN) in vitro te kwantificeren. Kort, verankerings afhankelijke cellen worden vastgehouden in suspensie en blootgesteld aan de ATM kinase remmer Ku55933 voor het opwekken van oxidatieve stress. Cellen worden vervolgens geplateerd op een FN-gecoat oppervlak en mogen voor vooraf bepaalde perioden worden bevestigd. Cellen die bevestigd blijven, zijn vast en gelabeld met fluorescentie-antilichaam markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (bijv. F-actin). Gegevensverzameling en-analyse worden uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, waaronder een epifluorescentie Microscoop en gratis beschikbare Fiji-software. Deze procedure is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor een verscheidenheid aan cellijnen, ECM-eiwitten of remmers om een breed scala aan biologische vragen te onderzoeken.

Een algemeen schema van de experimentele opstelling
Figuur 1 vertegenwoordigt het algemene schema voor de celadhesie en het verspreidings protocol beginnend met de serum verhongering van REF52 cellen en eindigend met computationele analyse van verworven fluorescentie beelden. De belangrijkste stappen in het protocol worden geïllustreerd in de tijdlijn. Opmerking, stap 2 van het protocol beschrijft de bereiding van de FN-gecoate dekstroken, die gelijktijdig moeten w...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Deze methode is nuttig voor het kwantificeren van de vroege dynamiek van cellulaire adhesie en het verspreiden van verankerings afhankelijke cellen op het fibronectin. Bovendien kan deze test worden gebruikt om de effecten van veranderde redox homeostase op celspreiding en/of celadhesie-gerelateerde intracellulaire signalering trajecten te onderzoeken.

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Deze methode zal onderzoekers in staat stellen om de vroege dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van verankering-afhankelijke cellen te kwantificeren op de extracellulaire matrix eiwit fibronectin tijdens oxidatieve stress. Deze techniek is veelzijdig en kan worden aangepast om de cytoskeletale dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken. Bovendien worden gegevensverwerving en -analyse uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur en vrij beschikbare software.Inzicht in de mechanismen voor hoe cellen hechten en verspreiden op de ECM tijdens veranderingen in redox status kan waardevol inzicht geven in normale en ziektetoestanden, zoals uitgezaaide kanker. Deze methode kan worden gebruikt om celverspreiding en hechting te onderzoeken onder verschillende celkweekomstandigheden, verankeringsafhankelijke cellijnen en/oxidanten om een breed scala aan biologische vragen te beantwoorden. Er zijn tal van reagentia nodig om deze techniek uit te voeren.Daarom is het essentieel dat alle oplossingen van tevoren worden gemaakt voordat u begint. In een BSL-II gecertificeerde laminaire flow hood uiteengezet een weefsel cultuur-gecertificeerde 24-well plaat. Plaats een glazen coverslip in elke put.Label de plaat volgens figuur 1B van het tekstprotocol. Vervolgens pipette 500 microliters van de fibronectin oplossing in elke put. Pipette de oplossing over elke coverslip een paar keer om een gelijkmatige coating en volledige onderdompeling te garanderen.Bedek de plaat met het deksel. Broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Verwijder vervolgens de plaat uit de couveuse en haal de fibronectin-oplossing uit de putten.Was de putten drie keer met 500 microliter van 1X PBS per wasbeurt. Aspirate de laatste wasbeurt van 1X PBS, en blok putten met 500 microliters van een 0,5% gedelipideerde BSA oplossing bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor een minimum van 15 minuten. Eerst, pre-warm de benodigde oplossingen in een waterbad op 37 graden Celsius.In een BSL-II gecertificeerde laminaire stroomkap, beginnen met een confluent monolayer van REF52 cellen in een 10-vierkante centimeter schotel en was de cellen twee keer met zes milliliter warme 1X PBS. Serum verhongeren de cellen gedurende ten minste een uur in zes milliliter warme gedelipidde BSA-oplossing. Was vervolgens de cellen met zes milliliter opgewarmde 1X PBS.Aspirate de PBS en voeg 1,5 milliliter warme 0,5% trypsin-EDTA oplossing. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende ongeveer twee minuten. Observeer de cellen onder een lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat het onthechting compleet is.Als de cellen nog steeds aanhangen na het tikken op de plaat op de bank top, terug te keren naar de couveuse voor een extra twee minuten. Pipette 1,5 milliliter warme trypsine neutraliserende oplossing, TNS, aan de schotel om trypsinization te stoppen en losstaande cellen te verzamelen. Pipette de oplossing op en neer over de bodem van de plaat vele malen om alle resterende aanhangende cellen te verwijderen.Als de cellen verschijnen klonterig, verder triturate de cel suspensie door zachtjes pipetten op en neer over de achterkant van de schotel. Tel vervolgens de cellen met trypanblauwe uitsluiting in een geautomatiseerde celteller. Verwijder een geschikte hoeveelheid cellen om een celsuspensie te maken met de celdichtheid tussen 10.000 en 30.000 cellen per milliliter in delipidated BSA in een 15-milliliter conische buis.Gebruik een rotor met vaste hoek in een tafelbladcentrifuge om de cellen gedurende vijf minuten op 300 keer g te centrifugeren. Aspirate de supernatant en opnieuw op te schorten de cel pellet in zeven milliliter van warme gedelipidde BSA oplossing. Dan gelijkmatig verdelen de cel schorsing in twee 15-milliliter conische buizen, een voor voertuig-alone controle, en een voor Ku55933.Met behulp van een buis rotator, draaien de buizen voor 90 tot 120 minuten in een cel cultuur incubator op 37 graden Celsius. Voeg 30 minuten voor het beplating Ku55933 en DMSO aan elke buis toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar. Breng de celsuspensie voor de resterende tijd terug naar de rotator.Haal onmiddellijk voor het plating van de cellen de plaat uit de couveuse en aspiraat de gedelipidde BSA-oplossing. Verwijder hierna 500 microliter van de celsuspensie uit elke behandelingsgroep en voeg ze elk een van de met fibronectin gecoate afdekkingslips in de 24-putplaat toe. Doorgaan met het uitbroeden van de plaat en de celsuspensie bij de vorige omstandigheden.Laat de cellen vervolgens gedurende de gewenste tijd aan de coverlip kleven. Nadat de gewenste tijd voor hechting is verstreken, aspirate de celoplossing van elke coverslip in de plaat. Doe voorzichtig 500 microliters van 3,7% paraformaldehydeoplossing op elke coverslip door de zijkanten van de putten te pipetten en wacht 10 tot 15 minuten.Verwijder vervolgens de paraformaldehydeoplossing en was elke coverlip twee maal met 1X PBS met behulp van 500 microliter PBS per wasbeurt. Aspirate de PBS en permeabilized cellen op elke coverslip met 500 microliters van 0,2% Triton X-100 en 1X PBS gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens elke coverslip drie keer met 1X PBS met behulp van 500 microliters pbs per wasbeurt.Blokkeer de cellen op elke coverslip met 500 microliters van immunofluorescentie blokkeren buffer gedurende 30 tot 60 minuten. Verdun het primaire anti-paxillineantilichaam in de blokkeringsbuffer bij een verhouding van één tot 250. Meng goed en voeg 200 microliter van de antilichaamoplossing toe aan elke coverslip.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste een uur. Daarna de antilichaamoplossing aanzuigen en elke coverslip gedurende 10 minuten wassen met 500 microliters van 1X PBS. Bescherm de monsters vanaf dit punt tegen licht.Verdun de phalloïden F-actin sonde geconjugeerd aan de rode fluorescerende Alexa 594 kleurstof en de geit anti-muis 488 fluorescerende secundaire antilichaam in dezelfde blokkeren buffer oplossing. Meng goed en voeg 200 microliter van de antilichaamoplossing gedurende 30 minuten toe aan elke coverslip. Spoel de antilichaamoplossing aan en was elke coverslip met 500 microliter 1X PBS gedurende 10 minuten.Spoel de PBS aan en spoel de afdekking één keer af met 500 microliter gedeïsized water. Bevestig vervolgens de cover slips op microscoop dia's met behulp van anti-fade montage medium met DAPI. Na fixatie en kleuring met een anti-paxillin antilichaam worden fluorescerende 8-bits grijswaardenbeelden van de REF52-cellen verkregen.Na voltooiing van alle stappen voor beeldverwerking moeten individuele focale verklevingen prominent, scherp en gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn. Grijswaardenfluorescentie beelden van anti-paxilline en phalloidin F-actin sonde gekleurde cellen worden vervolgens genomen na te zijn verguld op fibronectine. Prominente focale verklevingen en stressvezels moeten gemakkelijk zichtbaar zijn in REF52-cellen nadat ze 20 tot 30 minuten op fibronectine mogen blijven kleven.F-actin verrijkte ruches aan de voorrand van celmembranen worden aangegeven met een pijl. Soortgelijke fluorescerende beelden van phalloïden F-actin sonde en anti-paxilline vlekken worden geanalyseerd voor het percentage stress vezels in cel verspreiding. Met name oxidant behandeling veroorzaakt een aanzienlijke toename van stress vezel vorming op alle adhesie tijdpunten onderzocht, en een afname van de cel verspreiding na 15 minuten van de celhechting fibronectine.Plating op hogere celdichtheden leidt tot cellulaire verdringing die cellen verbiedt volledig te verspreiden als gevolg van overvloeiing. Merk op dat de celranden niet te onderscheiden zijn van aangrenzende cellen. Als gevolg hiervan wordt kwantificering van individuele cellen uitgesloten en kan de verspreiding van de omtrek niet nauwkeurig worden bepaald.Een aparte cellijn van de muis embryonale fibroblasten worden gehouden in suspensie en vervolgens verguld op fibronectine gedurende 30 minuten. Cellen werden vervolgens gefixeerd en gekleurd met een anti-paxillin antilichaam. Let op de onscherpe cellen.Bovendien zal de kruisreactiviteit van het anti-paxilline-antilichaam met cellulair puin de drempelwaarde veranderen tijdens kwantitatieve beeldanalyse en mag deze niet in de analyse worden opgenomen. Gebruik tijdens beeldverwerking het opzoekgereedschap in Fiji om het beeld histogram te onderzoeken terwijl u de helderheid/contrast aanpast om valkuilen in verband met signaalverzadiging te voorkomen. Veranderingen in hechting en verspreiding kunnen de celmigratie beïnvloeden.Methoden om eencellige migratie, wondgenezing, of chemotaxis invasie tests kunnen bepalen of veranderingen in de migratie optreden. Rho familie GTPases reguleren celhechting dynamiek door middel van hun specifieke ruimtelijke temporele activering. Fenotypische veranderingen in hechting en verspreiding tijdens oxidatieve stress kunnen wijzen op downstream regulerende rollen voor deze eiwitten.Deze methode vereist het gebruik van BSL-II-cellijnen en gevaarlijke chemische reagentia. Onderzoekers vereisen chemische en biologische veiligheidstraining, zoals bepaald door het milieu-gezondheids- en veiligheidsbureau van hun instelling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitheliale darmcellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Evaluatie van het effect van eiwit aggregatie op cellulaire oxidatieve Stress in gist

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipuleren van levende cellen om te bouwen van stabiele 3D cellulaire vergadering zonder kunstmatige steiger

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-geautomatiseerde fluorescerende meting van de luchtweg oppervlak vloeibare pH van primaire menselijke luchtweg epitheelcellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...