Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר סקוט ר. האטון ומייגן ס. בלקאדן לסקירה הקריטית של כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי מחקר של אוניברסיטת High Point ותוכניות ממומנים (MCS) ותוכנית ביוטכנולוגיה באוניברסיטת צפון קרוליינה סטייט (MCS).

1. ההכנות
הערה: הפרוטוקול המתואר להלן מותאם במיוחד לשימוש עם REF52 תאים ו-ATM+/+ או כספומט-/- כדוריות האדם. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת כמתואר בסעיפים הערות ופתרון בעיות להלן.
<ol><li>להפוך 500 mL של התרבות התא המלא בינונית עבור תאים REF52. כדי 500 mL של גלוקוז ג...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר כאן הוא דרך מגוונת וחסכונית למסך במהירות מספר סוגי תאים תלויי האנקורג ' עבור שיפוץ השלד הדינאמי במהלך התפשטות התא. בפרט, שיטה זו בוחנת בוחן את סיבי הסטרס ואת היווצרות הדבקה מוקד במהלך הלחץ חמצוני כאשר התאים לדבוק FN (איור 1A). יתר על כן, אלה פנוטיפים סלולריים ע...

הידקויות תא מטריצות (כלומר, הידקויות מוקד) הן מכלולי חלבון רב ודינאמיים מרובי-מולקולרית, אשר מתווכים בין הדבקה והפצת תאים. תהליכים אלה קריטיים לפיתוח רקמות, תחזוקה ותפקוד פיזיולוגי. הידקויות מיקוד מורכבים קולטנים מאוגדים ממברנה, כגון אינטנס, כמו גם הפיגומים חלבונים המקשרים אקטין השלד בתוך מטריצה החילוץ (ecm)1. מתחמי אלה מסוגלים להגיב לרמזים פיזיוכימיים נוכח בסביבה המומנת באמצעות הפעלה של שבילים איתות שונים התמרה. ככזה, הידקויות מיקוד לשמש מרכזי איתות כדי להפיץ רמזים מכניים לתוך מספר תהליכים סלולריים כולל הגירה מכוונת, רגולציה מחזור התא, בידול, והישרדות1,2. קבוצה אחת של מולקולות איתות המווסת ומאינטראקציה עם הידקויות מוקד כוללות חברים של משפחת Rho של GTPases קטנים. Rho GTPases הם חלבונים מרכזיים המסדירים את הגירה התא ואת הדינמיקה הדבקה דרך ההפעלה הטמפורלית הספציפית שלהם3. לא באופן מפתיע, דיסתקנה של תפקוד החלבון של רו היתה מעורב במספר הפתווגיות אנושיות כגון גרורות, אנגיוגנזה, ועוד. מעניין מיוחד, מעמד הסלולר התאי משחק תפקיד דומיננטי באפנון של הגירה תא והדבקה. שינויים ב הומאוסטזיס, כגון הגדלת מינים חמצן תגובתי (ROS), הוכחו להסדיר פעילות חלבון Rho, כמו גם הדבקה, במספר סוגי תאים ומחלות אדם4,5,6 ,7,8. לדוגמה, אנשים הסובלים הפרעת נוירולוגיות אטקסיה telangiectasia (A-T), אשר נגרמת על ידי מוטציה בתיקון הנזק DNA סרין/טראונין קינאז A-T-מוטציה (ATM), יש סיכון מוגבר של סרטן גרורתי9, . בסדר, עשר הפסד של פעילות ATM קינאז בחולים אלה קווי תאים, או באמצעות מוטציה גנטית או עיכוב כימי, תוצאות רמות גבוהות של מתח חמצוני עקב חוסר תפקוד של מסלול פוספטפנז 7,11, . שתיים עשרה יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מן המעבדה הדגישו תפקיד פתופסולוגי עבור ROS ב-T על ידי שינוי דינמיקה השלד הציטומי (כלומר הדבקה והתפשטות) כתוצאה ישירה של הפעלת GTPases משפחת רו ב מבחנה5. בסופו של דבר, שינויים אלה הדינמיקה השלד ציטומי נגרמת על ידי הפעלת משפחת Rho עלול להוביל לסיכון מוגבר של סרטן גרורתי ציין בחולים5,13. לכן, הבנת הגומלין בין אינטראקציות תא מטריקס במהלך לחץ חמצוני יכולה לספק תובנות לגבי התקנה של הדבקה והתפשטות. מחקרים אלה יכולים גם להגדיר את הבמה לחקירה נוספת לתפקיד אפשרי עבור משפחת Rho GTPases בתהליכים אלה איתות.
מתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את הדינמיקה התאית המוקדמת של הרכבה הדבקה והתפשטות במהלך לחץ חמצוני הנגרמת על ידי עיכוב של פעילות ATM קינאז. שיטת הפעולה מבוססת על המנגנון המאופיין היטב של תאים התלויים באנקורג ' לחלבון ה-ecbronectin (FN). כאשר התאים הנשמרים ההשעיה מצופים FN, מספר רו gtpases לתאם את השליטה של שיפוץ אקטין השלד שיפוצים3,14. שינויים מורפולוגיים נצפו כאשר התאים משתנים מעגול ועגול במראה לשיטוח ולהרחבה. במקביל עם תצפיות אלה הוא התפתחות של הידקויות רבות של מטריקס עם ECM. שינויים אלה מיוחסים להפעלת biphasic של rhoa עם Rac1 בשעה הראשונה כמו תאים לדבוק ולהתפשט 15,16.
נעשה שימוש במגוון שיטות לבדיקת מורפולוגיה ודינמיקה של התאים והתפשטות התא. עם זאת, שיטות אלה מסתמכות על השתקפות מתוחכמת ארוכת טווח לאורך זמן, הדמיה פנימית (TIRF) או מערכות המיקרוסקופיה. לפיכך, על המשתמשים להיות בעלי גישה לציוד ולתוכנה מיוחדים. יתר על כן, זמן הגדרת הנדרש על ידי אלה הדמיה מערכות ביולוגי עושה לכידת אירועים הדבקה מוקדם מאתגרת, במיוחד בעת בדיקת מעכבי מרובים או תנאי טיפול במקביל.
השיטות המפורטות, להלן, מספקות דרך ישירה, חסכונית, אך כמותית, להעריך את הפרמטרים השולטים בהרכבת הדבקה ובהפצת מבחנה. הפרוטוקול מבוצע באמצעות ציוד מעבדה זמין בדרך כלל, כגון מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצלמת CCD. שיטת הפעולה כרוכה בהחלת תאים התלויים באנקורג ' למשטח FN-מצופה לאחר תקופה של מתח חמצוני הנגרם על ידי עיכוב כימי של פעילות ATM קינאז, אשר הפגינו בעבר5. לאחר הציפוי, תאים מורשים לצרף ולדבוק לאורך הזמן שצוין. תאים שאינם מצורפים נשטפים, בעוד התאים המחוברים הם קבועים ומסומנים עם נוגדנים מבוססי פלואורסצנטית סמנים של הדבקה (למשל, פקעבלין) ומתפשטת (למשל, F-actin)2,5. חלבונים אלה הם דמיינו ונרשמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי. ניתוח הנתונים הבאים מבוצע באמצעות תוכנת פיג'י זמינה בחופשיות. כמו-כן, ניתן להתאים שיטה זו לבדיקת דינמיקת הדבקה תחת מגוון רחב של תנאים, לרבות חלבונים מסוג ECM שונים, טיפול במספר רב של מצבים של חמצון/התרבות התאית או מגוון קווים תלויי-עגינה הקשורים למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

הדבקה והפצת תאים על מטריצת החילוץ (ECM) הם תהליכים סלולאריים חיוניים במהלך התפתחות ארגונית והומאוסטזיס של רקמות למבוגרים. מעניין, לחץ חמצוני יכול לשנות תהליכים אלה, ובכך לתרום פתופסיולוגיה של מחלות כגון סרטן גרורתי. לכן, הבנת המנגנון (ים) של כיצד תאים מתחברים ומתפשטים על ECM במהלך רטבאליות במצב מחדש יכול לספק תובנה לתוך מצבים נורמליים ומחלות. המתואר להלן פרוטוקול צעד נבון אשר מנצל באופן מבוסס immunofluorescence המבוססת במיוחד לכמת הדבקה תא והפצת התאים המוחיים פיברובטין על fibronectin (FN) ב מבחנה. בקצרה, התאים התלויים באנקורג ' מוחזקים בהשעיה וחשופים ל כספומט קינאז מעכבי Ku55933 כדי לגרום ללחץ חמצוני. התאים מצופים לאחר מכן במשטח מצופה FN ומורשים לצרף לפרקי זמן קבועים מראש. תאים שנשארים מחוברים הם קבועים ומסומנים עם סמני נוגדנים מבוססי-פלואורסצנטית של הדבקה (למשל, פקעבלין) ומריחה (למשל, F-actin). רכישת נתונים וניתוח מתבצעים באמצעות ציוד מעבדה זמין בדרך כלל, כולל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית וזמין באופן חופשי תוכנת פיג'י. הליך זה הוא רב-תכליתי מאוד וניתן לשנותה למגוון קווי תאים, חלבונים מסוג ECM או מעכבי כדי לבחון מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

סכימה כללית של הגדרת הניסוי
איור 1 מייצג את הסכימה הכללית עבור הדבקה תא והפצת הפרוטוקול החל מהרעב בסרום של תאים REF52 ומסתיים בניתוח חישובית של תמונות פלואורסצנטית שנרכשו. שלבי המפתח בפרוטוקול מומחשים בציר הזמן. הערה, שלב 2 של הפרוטוקול מתאר את הכנת שמיכות FN-מצו?...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

שיטה זו שימושית לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הדבקה תאית והפצת תאים התלויים באנקורג ' בתוך הפיברוטין. יתר על כן, שינוי זה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעות של שינוי הומאוסטזיס מחדש על התפשטות התא ו/או הדבקה תא הקשורות מסלולים תאיים איתות.

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

שיטה זו תאפשר לחוקרים לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הידבקות תאית והתפשטות של תאים תלויי עגנים על גבי חלבון המטריצה החוץ-תאית פיברונקטין במהלך סטרס חמצוני. טכניקה זו היא רב-תכליתית ו ניתן להתאים אותה לבחינת הדינמיקה הציטוסקלטלית במגוון רחב של תנאים. יתר על כן, איסוף וניתוח נתונים מבוצעים באמצעות ציוד מעבדה משותף ותוכנות זמינות בחופשיות.הבנת המנגנונים לאופן שבו תאים מתחברים ומתפשטים על ה- ECM במהלך שינויים במצב redox יכולה לספק תובנה חשובה למצבים נורמליים ומחלות, כגון סרטן גרורתי. שיטה זו יכולה לשמש לבחינת התפשטות תאים והיתוךם בתנאי תרבות תאים שונים, קווי תאים תלויי עגן ו/אוחמצונים כדי לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. ישנם רייגנטים רבים הנדרשים כדי לבצע טכניקה זו.לכן, חיוני כי כל הפתרונות נעשים מראש לפני תחילת. במכסה המנוע של זרימה למינארית מאושרת BSL-II, קבעו צלחת 24 בארות מוסמכת לתרבות רקמות. מניחים כיסוי אחד לתוך כל באר.סמן את הלוח לפי איור 1B של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, פיפטה 500 microliters של פתרון fibronectin לתוך כל באר. פיפטה הפתרון על כל coverslip כמה פעמים כדי להבטיח ציפוי אפילו טבילה מלאה.כסו את הצלחת עם המכסה. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר מכן להסיר את הצלחת מן החממה ולשאוב את הפתרון פיברונקטין מן בארות.לשטוף את בארות שלוש פעמים באמצעות 500 microliters של 1X PBS לכל לשטוף. שאפו את הכביסה הסופית של 1X PBS, וחסמו בארות עם 500 מיקרוליטרים של פתרון BSA משוער של 0.5% ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך 15 דקות לפחות. ראשית, לחמם מראש את הפתרונות הדרושים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.במכסה המנוע של זרימה למינארית מאושרת BSL-II, התחל עם מונוליאר קונפלנטי של תאי REF52 בצלחת של 10 ס"מ רבועים ושטוף את התאים פעמיים עם שישה מיליליטר של PBS 1X חם. סרום להרעיב את התאים לפחות שעה אחת בשישה מיליליטר של פתרון BSA מתלבט חם. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם שישה מיליליטר של PBS 1X מחומם.שאפו את ה-PBS והוסיפו 1.5 מיליליטר של פתרון חם של 0.5%trypsin-EDTA. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך כשתי דקות. שימו לב לתאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהניתוק הושלם.אם התאים עדיין חסידים לאחר הקשה על הצלחת על הספסל העליון, להחזיר אותם לאנקובטור במשך שתי דקות נוספות. פיפטה 1.5 מיליליטר של פתרון נטרול טריפסין חם, TNS, לצלחת להפסיק trypsinization ולאסוף תאים מנותקים. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה על החלק התחתון של הצלחת פעמים רבות כדי להסיר את כל התאים חסידים הנותרים.אם התאים נראים מגושם, עוד יותר triturate ההשעיה התא על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה על החלק האחורי של המנה. לאחר מכן, ספור את התאים באמצעות אי-הכללה כחולה של trypan ב מונה תאים אוטומטי. הסר כמות מתאימה של תאים כדי ליצור השעיית תא עם צפיפות התא בין 10, 000 ו 30, 000 תאים למיליליטר ב BSA משונה בצינור חרוט 15 מיליליטר.השתמש רוטור בזווית קבועה בצנטריפוגה שולחן כדי צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא בשבעה מיליליטר של פתרון BSA משוער וחם. ואז לחלק באופן שווה את ההשעיה התא לשני צינורות חרוט 15 מיליליטר, אחד לשליטה ברכב לבד, ואחד עבור Ku55933.באמצעות מסובב צינור, סובבו את הצינורות במשך 90 עד 120 דקות באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס. 30 דקות לפני ציפוי, להוסיף Ku55933 ו DMSO לכל צינור לריכוז הסופי של 10 micromolar. החזר את השעיית התא למסובב לזמן הנותר.מיד לפני ציפוי התאים, לאחזר את הצלחת מהאינקובטור ולשאוב את פתרון BSA משונה. לאחר מכן, להסיר 500 microliters של ההשעיה התא מכל קבוצת טיפול ולהוסיף כל אחד לאחד החלקות כיסוי מצופה פיברונאטין בצלחת 24 היטב. המשך הדגירה של הצלחת והתלייה של התא בתנאים הקודמים.לאחר מכן אפשר לתאים לדבוק בכיסוי למשך הזמן הרצוי. לאחר שהזמן הרצוי להיתוך חלף, שאפו את תסמת התא מכל כיסוי בצלחת. מחלקים בעדינות 500 מיקרוליטרים של תותב 3.7% paraformaldehyde על כל כיסוי על ידי צינורות לאורך דפנות בארות, ולחכות 10 עד 15 דקות.לאחר מכן, להסיר את פתרון paraformaldehyde ולשטוף כל כיסוי פעמיים עם PBS 1X באמצעות 500 microliters של PBS לכל לשטוף. שאף את ה-PBS ואת התאים המחלחלים בכל מכסה עם 500 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100 ו-1X PBS למשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף כל כיסוי שלוש פעמים עם PBS 1X באמצעות 500 microliters של PBS לכל לשטוף.לחסום את התאים על כל coverslip עם 500 microliters של חיץ חסימת immunofluorescence במשך 30 עד 60 דקות. מדללים את הנוגדן העיקרי נגד פקסילין במאגר החסימה ביחס של 1 ל-250. מערבבים היטב ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים לכל כיסוי.דגירה בטמפרטורת החדר לפחות שעה אחת. לאחר מכן, שאפו את פתרון הנוגדנים ושטפו כל כיסוי עם 500 מיקרוליטרים של 1X PBS למשך 10 דקות. הגן על הדגימות מפני אור מנקודה זו ואילך.לדלל את החללית פאלודין F-actin משותף צבע פלואורסצנטי אדום Alexa 594 ואת העז נגד עכבר 488 נוגדן משני פלואורסצנטי באותו פתרון חיץ חסימה. מערבבים היטב ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים לכל כיסוי במשך 30 דקות. שאפו את פתרון הנוגדנים ושטפו כל אחד מהם ב-500 מיקרוליטרים של פיב"ס 1X למשך 10 דקות.שאפו את ה-PBS ושטוף את החלקות הכיסוי פעם אחת עם 500 מיקרוליטרים של מים לא מיומנים. לאחר מכן תקן את החלקות המכסה על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות מדיום הרכבה נגד עמעום המכיל DAPI. לאחר קיבעון וכתמים בנוגדן אנטי-פקסילין, נרכשות תמונות פלואורסצנטיות בגווני אפור של 8 סיביות של תאי REF52.עם השלמת כל שלבי עיבוד התמונה, הידבקויות מוקד בודדות צריכות להיות בולטות, ממוקדות, וניתן להבחין ביניהן בקלות. תמונות פלואורסצנטיות בגווני אפור של תאים מוכתמים נגד פקסילין ופאלואדין F-actin נלקחים לאחר צפי על פיברונקטין. דבקים מוקד בולטים וסיבי מתח צריך להיות גלוי בקלות בתאי REF52 לאחר שהורשה לדבוק פיברונאקין במשך 20 עד 30 דקות.קפלים מועשרים F-actin בקצה המוביל של קרום התא מסומנים עם חץ. תמונות פלואורסצנטיות דומות של בדיקה פאלודין F-actin וכתמים אנטי פקסילין מנותחים עבור אחוז סיבי הלחץ בהתפשטות התא. יש לציין כי טיפול מחומצן גורם לעלייה משמעותית בהיווצרות סיבי הלחץ בכל נקודות זמן ההיתוך שנבדקו, וירידה בהתפשטות התאים לאחר 15 דקות של הידבקות בתאים לפיברונאקטין.ציפוי בצפיפות תאים גבוהה יותר מוביל לצפיפות תאית האוסרת על התאים להתפשט באופן מלא עקב שפעת יתר. שים לב שקצוות התא אינם ניתנים להבחנה מתאים סמוכים. כתוצאה מכך, כימות של תאים בודדים מונע ולא ניתן לקבוע במדויק את היקף ההתפשטות.קו תא נפרד של פיברובלסטים עובריים של העכבר מוחזקים בהשעיה ולאחר מכן מצופים על פיברונקטין במשך 30 דקות. התאים תוקנו והוכתמים בנוגדן אנטי-פקסילין. שים לב לתאים שאינם ממוקדים.יתר על כן, תגובתיות צולבת של נוגדן אנטי פקסילין עם פסולת הסלולר ישנה סף במהלך ניתוח תמונה כמותית ולא צריך להיכלל בניתוח. במהלך עיבוד תמונה, השתמש בכלי בדיקת מידע בפיג'י כדי לבחון את היסטוגרמת התמונה תוך התאמת הבהירות/הניגודיות כדי למנוע מכשולים הקשורים לרווית אותות. שינויים בהיתוך ובהתפשטות עשויים להשפיע על נדידת תאים.שיטות למעקב אחר נדידת תאים בודדים, ריפוי פצעים או בדיקה של פלישת צ'מוטקסיס יכולות לקבוע אם מתרחשים שינויים בהגירה. משפחת Rho GTPases לווסת את דינמיקת הידבקות התא באמצעות הפעלת הזמן המרחבי הספציפי שלהם. שינויים פנוטיפיים בהיתוך והתפשטות במהלך סטרס חמצוני עשויים לרמוז על תפקידים רגולטוריים במורד הזרם עבור חלבונים אלה.שיטה זו דורשת שימוש בקווי תא BSL-II ובריגנסים כימיים מסוכנים. החוקרים דורשים הכשרה כימית וביולוגית בטיחות כפי שנקבע על ידי משרד הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד שלהם.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

באמצעות מנתח השטף של מסחטות כדי למדוד שינויים גליקוליזה ו זירחון חמצוני במהלך הזרע העכבר מדרכיכים

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...