Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Gli autori ringraziano il dottor Scott R. Hutton e Meghan S. Blackledge per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dai programmi di ricerca e sponsorizzazione (MCS) della High Point University e dal Programma biotecnologico presso la North Carolina State University (MCS).

1. Preparativi
NOTA: Il protocollo descritto di seguito è stato ottimizzato per l'uso con le cellule REF52 e ATMo ATM-/-- fibroblasti umani. Altri tipi di celle possono richiedere un'ulteriore ottimizzazione, come descritto nelle note e nelle sezioni di risoluzione dei problemi riportate di seguito.
<ol><li>Crea 500 mL di supporto di coltura cellulare completo per le celle REF52. A 500 mL di alto glucosio contenente il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) ag...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Il protocollo qui descritto è un modo versatile ed economico per vagliare rapidamente una serie di tipi di cellule dipendenti dall'ancoraggio per il rimodellamento dinamico del citoscheletro durante la diffusione delle cellule. In particolare, questo metodo esamina quantitativamente la fibra di stress e la formazione di adesione focale durante lo stress ossidativo quando le cellule aderiscono al FN (Figura 1A). Inoltre, questi fenotipi cellulari possono suggerire un ruolo normativo per i me...

Le adeguarzioni cellula-matrice (ad esempio, le adeguarzioni focali) sono grandi e dinamiche complessi proteici multimolecolari che mediano l'adesione e la diffusione cellulare. Questi processi sono fondamentali per lo sviluppo dei tessuti, la manutenzione e la funzione fisiologica. Le adere focali sono composte da recettori legati alla membrana, come le integrine, così come le proteine dell'impalcatura che collegano l'actina citoscheletrica alla matrice extracellulare (ECM)1. Questi complessi sono in grado di rispondere ai segnali fisiochimici presenti nell'ambiente extracellulare attraverso l'attivazione di varie vie di trasduzione di segnalazione. Come tale, le adesioni focali servono come centri di segnalazione per propagare segnali meccanici extracellulari in una serie di processi cellulari tra cui la migrazione diretta, la regolazione del ciclo cellulare, la differenziazione e la sopravvivenza1,2. Un gruppo di molecole di segnalazione che regolano e interagiscono con le ademioni focali includono membri della famiglia Rho di piccole GTPases. Rho GTPases sono proteine chiave che regolano la migrazione cellulare e la dinamica di adesione attraverso la loro specifica attivazione spatiotemporale3. Non sorprendentemente, la disregolazione della funzione della proteina Rho è stata implicata in una serie di patologie umane come metastasi, angiogenesi e altri. Di particolare interesse, lo stato di redox cellulare svolge un ruolo predominante nella modulazione della migrazione cellulare e dell'adesione. Sono state dimostrate alterazioni nell'omeostasi redox, come l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), per regolare l'attività della proteina Rho, così come l'adesione, in un certo numero di tipi di cellule e malattie umane4,5,6 ,7,8. Ad esempio, gli individui affetti dal disturbo neurologico ataxia-telangiectasia (A-T), che è causato da una mutazione del danno del DNA riparare serina / trenina chinasi A-T-mutato (ATM), hanno un aumentato rischio di cancro metastatico9, 10. La perdita di attività della chinasi ATM in questi pazienti e linee cellulari, sia per mutazione genetica che per inibizione chimica, si traduce in alti livelli di stress ossidativo a causa della disfunzione del percorso del fosfato pentozoico7,11, 12. Inoltre, recenti studi del laboratorio hanno evidenziato un ruolo patofisiologico per ROS in A-T alterando la dinamica citoscheletrica (ad esempio adesione e diffusione) come risultato diretto dell'attivazione di Rho family GTPases in vitro5. In definitiva, queste alterazioni nelle dinamiche citoscheletriche causate dall'attivazione della famiglia Rho possono portare all'aumento del rischio di cancro metastatico osservato nei pazienti A-T5,13. Pertanto, comprendere l'interazione tra le interazioni cellula-matrice durante lo stress ossidativo può fornire informazioni sulla regolazione dell'adesione e della diffusione. Questi studi possono anche mettere in stadio per ulteriori indagini su un possibile ruolo per la famiglia Rho GTPases in questi processi di segnalazione.
Descritto qui è un protocollo per studiare la dinamica cellulare precoce dell'assemblaggio dell'adesione e della diffusione durante lo stress ossidativo causato dall'inibizione dell'attività della chinasi ATM. Questo test si basa sul meccanismo ben caratterizzato dell'adesione delle cellule dipendenti dall'ancoraggio alla fibroctina della proteina ECM (FN). Quando le cellule mantenute in sospensione sono placcate su FN, diversi Rho GTPases coordinano il controllo dell'actin citoskeletal rimodellamento3,14. I cambiamenti morfologici si osservano quando le cellule si spostano da rotonde e circolari nell'aspetto a appiattite ed espanse. Concomitanti con queste osservazioni è lo sviluppo di numerose adeguarsi matrice con l'ECM. Questi cambiamenti sono attribuiti all'attivazione bifasica di RhoA con Rac1 durante la prima ora man mano che le cellule aderiscono e si diffondono 15,16.
Una varietà di metodi sono stati utilizzati per esaminare la morfologia e la dinamica dell'adesione, nonché la diffusione delle cellule. Tuttavia, questi metodi si basano su sofisticati sistemi di microscopia a lunga e lunga durata, a immagine reale di riflessione interna (TIRF) o microscopia confocale. Pertanto, gli utenti devono avere accesso a apparecchiature e software specializzati. Inoltre, il tempo di creazione richiesto da questi sistemi di bio-imaging rende difficile l'acquisizione di eventi di adesione precoce, soprattutto quando si testano più inibitori o condizioni di trattamento contemporaneamente.
I metodi descritti, nel presente documento, forniscono un modo semplice, economico, ma quantitativo per valutare i parametri che regolano l'assemblaggio dell'adesione e la diffusione in vitro. Il protocollo viene eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, come un microscopio a epifluorescenza e una telecamera CCD. Questo saggio prevede l'applicazione di cellule dipendenti dall'ancoraggio a una superficie rivestita con FN dopo un periodo di stress ossidativo causato dall'inibizione chimica dell'attività della chinasi ATM, che è stato dimostrato in precedenza5. Dopo la placcatura, le cellule possono attaccare e aderire per periodi di tempo specificati. Le cellule non attaccate vengono lavate via, mentre le cellule attaccate sono fisse ed etichettate con anticorpi basati sulla fluorescenza ai marcatori di adesione (ad esempio, paxillin) e diffusione (ad esempio, F-actin)2,5. Queste proteine vengono quindi visualizzate e registrate utilizzando un microscopio a epifluorescenza. L'analisi dei dati successiva viene eseguita utilizzando il software Fiji liberamente disponibile. Inoltre, questo metodo può essere adattato per esaminare le dinamiche di adesione in una vasta gamma di condizioni, tra cui diverse proteine ECM, il trattamento con vari ossidanti / condizioni di coltura cellulare o una varietà di linee cellulari dipendenti dall'ancoraggio per affrontare un'ampia gamma di domande biologiche.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

L'adesione e la diffusione delle cellule sulla matrice extracellulare (ECM) sono processi cellulari essenziali durante lo sviluppo dell'organismo e per l'omeostasi dei tessuti adulti. È interessante notare che lo stress ossidativo può alterare questi processi, contribuendo così alla fisiopatologia di malattie come il cancro metastatico. Pertanto, comprendere i meccanismi di come le cellule si attaccano e si diffondono sull'ECM durante le perturbazioni nello stato di redox può fornire informazioni sugli stati normali e della malattia. Descritto di seguito è un protocollo graduale che utilizza un saggio basato sull'immunofluorescenza per quantificare specificamente l'adesione cellulare e la diffusione di cellule fibroblaste immortalate sulla fibronectina (FN) in vitro. In breve, le cellule dipendenti dall'ancoraggio sono tenute in sospensione ed esposte all'inibitore della chinasi ATM Ku55933 per indurre lo stress ossidativo. Le celle vengono quindi placcate su superficie rivestita FN e possono essere attaccate per periodi di tempo predeterminati. Le cellule che rimangono attaccate sono fisse ed etichettate con marcatori anticorpi basati sulla fluorescenza di adesione (ad esempio, paxillin) e diffusione (ad esempio, F-actin). L'acquisizione e l'analisi dei dati vengono eseguite utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, tra cui un microscopio a epifluorescenza e un software Fiji liberamente disponibile. Questa procedura è altamente versatile e può essere modificata per una varietà di linee cellulari, proteine ECM, o inibitori al fine di esaminare una vasta gamma di domande biologiche.

Uno schema generale dell'allestito sperimentale
La figura 1 rappresenta lo schema generale per l'adesione cellulare e il protocollo di diffusione che iniziano con la fame del siero delle cellule REF52 e terminano con l'analisi computazionale delle immagini di fluorescenza acquisite. I passaggi chiave del protocollo sono illustrati nella sequenza temporale. Va notato, il passaggio 2 del protocollo descrive la preparazione dei coprilabbra rivestiti FN, che devono esse...

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Questo metodo è utile per quantificare la dinamica precoce dell'adesione cellulare e la diffusione delle cellule dipendenti dall'ancoraggio sulla fibronectina. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'omeostasi redox alterata sulla diffusione cellulare e/o sulle vie di segnalazione intracellulare correlate all'adesione alle cellule.

Esame della dinamica dell'adesione cellulare e della diffusione delle cellule epiteliali su fibronectina durante lo stress ossidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Questo metodo consentirà ai ricercatori di quantificare la dinamica precoce dell'adesione cellulare e la diffusione di cellule dipendenti dall'ancoraggio sulla fibronectina proteica della matrice extracellulare durante lo stress ossidativo. Questa tecnica è versatile e può essere adattata per esaminare la dinamica citoscheletricha in un'ampia gamma di condizioni. Inoltre, l'acquisizione e l'analisi dei dati vengono eseguite utilizzando attrezzature di laboratorio comuni e software liberamente disponibili.Comprendere i meccanismi per il modo in cui le cellule si attaccano e si diffondono sull'ECM durante le alterazioni dello stato redox può fornire preziose informazioni sugli stati normali e delle malattie, come il cancro metastatico. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare la diffusione e l'adesione cellulare in diverse condizioni di coltura cellulare, linee cellulari dipendenti dall'ancoraggio e / ossidanti per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Ci sono numerosi reagenti necessari per eseguire questa tecnica.Pertanto, è essenziale che tutte le soluzioni siano fatte in anticipo prima dell'inizio. In una cappa di flusso laminare certificata BSL-II è stata impostata una piastra da 24 potarsi certificata in coltura tissutale. Posizionare una coverlip di vetro in ogni pozzo.Etichettare la lastra in base alla figura 1B del protocollo di testo. Successivamente, pipettare 500 microlitri della soluzione di fibronectina in ogni pozzo. Pipettare la soluzione su ogni coverslip alcune volte per garantire un rivestimento uniforme e un'immersione completa.Coprire la piastra con il coperchio. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per un'ora. Quindi rimuovere la piastra dall'incubatore e aspirare la soluzione di fibronectina dai pozzi.Lavare i pozzi tre volte utilizzando 500 microlitri di 1X PBS per lavaggio. Aspirare il lavaggio finale di 1X PBS e bloccare i pozzi con 500 microlitri di una soluzione BSA delipidata allo 0,5% a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per un minimo di 15 minuti. In primo luogo, pre-riscaldare le soluzioni necessarie in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.In una cappa di flusso laminare certificata BSL-II, iniziare con un monostrato confluente di cellule REF52 in un piatto di 10 centimetri quadrati e lavare le celle due volte con sei millilitri di PBS 1X caldo. Il siero muore di fame le cellule per almeno un'ora in sei millilitri di soluzione di BSA calda delipidata. Quindi, lavare le cellule con sei millilitri di 1X PBS riscaldato.Aspirare il PBS e aggiungere 1,5 millilitri di soluzione calda 0,5% di tripside-EDTA. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per circa due minuti. Osservare le cellule al microscopio luminoso per assicurarsi che il distacco sia completo.Se le cellule sono ancora aderenti dopo aver toccato la piastra sul piano del banco, restituirle all'incubatrice per altri due minuti. Pipetta 1,5 millilitri di soluzione neutralizzante di tripsidenza calda, TNS, al piatto per fermare la tripsiinizzazione e raccogliere le cellule staccate. Pipettare la soluzione su e giù sul fondo della piastra numerose volte per rimuovere tutte le restanti cellule aderenti.Se le cellule appaiono goffi, triturare ulteriormente la sospensione cellulare tubazionando delicatamente su e giù sul retro del piatto. Quindi, contare le celle utilizzando l'esclusione blu trypan in un contatore di celle automatizzato. Rimuovere una quantità appropriata di celle per creare una sospensione cellulare con la densità cellulare compresa tra 10.000 e 30.000 celle per millilitro in BSA delipidato in un tubo conico da 15 millilitri.Utilizzare un rotore ad angolo fisso in una centrifuga da tavolo per centrifugare le cellule a 300 volte g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in sette millilitri di soluzione BSA delipidata calda. Quindi dividere uniformemente la sospensione cellulare in due tubi conici da 15 millilitri, uno per il controllo da solo del veicolo e uno per Ku55933.Utilizzando un rotatore a tubo, ruotare i tubi per 90-120 minuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius. 30 minuti prima della placcatura, aggiungere Ku55933 e DMSO ad ogni tubo a una concentrazione finale di 10 micromolari. Restituire la sospensione cellulare al rotatore per il tempo rimanente.Immediatamente prima di placcare le cellule, recuperare la piastra dall'incubatore e aspirare la soluzione BSA delipidata. Successivamente, rimuovere 500 microlitri della sospensione cellulare da ogni gruppo di trattamento e aggiungerli a uno dei coperchi rivestiti di fibronectina nella piastra a 24 porri. Continuare a incubare la piastra e la sospensione cellulare alle condizioni precedenti.Quindi consentire alle celle di aderire al coverslip per il periodo di tempo desiderato. Dopo che il tempo desiderato per l'adesione è passato, aspirare la soluzione cellulare da ogni coverlip nella piastra. Erogare delicatamente 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 3,7% su ogni coverlip pipettando lungo i lati dei pozzi e attendere da 10 a 15 minuti.Successivamente, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare ogni coverlip due volte con 1X PBS utilizzando 500 microlitri di PBS per lavaggio. Aspirare il PBS e le celle permeabili su ogni coverlip con 500 microlitri dello 0,2%Triton X-100 e 1X PBS per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare ogni coverlip tre volte con 1X PBS utilizzando 500 microlitri di PBS per lavaggio.Bloccare le cellule su ogni coverlip con 500 microlitri di buffer di blocco dell'immunofluorescenza per 30-60 minuti. Diluire l'anticorpo anti-paxillina primario nel tampone di blocco con un rapporto tra uno e 250. Mescolare bene e aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale ad ogni coverlip.Incubare a temperatura ambiente per almeno un'ora. Successivamente, aspirare la soluzione anticorpale e lavare ogni coverlip con 500 microlitri di 1X PBS per 10 minuti. Proteggere i campioni dalla luce da questo punto in avanti.Diluire la sonda F-actina della falloidina coniugata al colorante rosso fluorescente Alexa 594 e all'anticorpo secondario fluorescente 488 della capra anti-topo nella stessa soluzione tampone di blocco. Mescolare bene e aggiungere 200 microlitri della soluzione anticorpale ad ogni coverlip per 30 minuti. Aspirare la soluzione anticorpale e lavare ogni coverlip con 500 microlitri di 1X PBS per 10 minuti.Aspirare il PBS e sciacquare il coperchio scivola una volta con 500 microlitri di acqua deionizzata. Quindi fissare il coperchio scivola su vetrini al microscopio utilizzando un supporto di montaggio anti dissolvenza contenente DAPI. Dopo la fissazione e la colorazione con un anticorpo anti-paxillina, vengono acquisite immagini fluorescenti in scala di grigi a 8 bit delle cellule REF52.Al termine di tutte le fasi di elaborazione delle immagini, le singole aderenze focali dovrebbero essere prominenti, a fuoco e facilmente distinguibili l'una dall'altra. Le immagini a fluorescenza in scala di grigi delle cellule macchiate della sonda F-actina anti-paxillina e falloidina vengono quindi prese dopo essere state placcate sulla fibronectina. Le aderenze focali prominenti e le fibre di stress dovrebbero essere facilmente visibili nelle cellule REF52 dopo essere state autorizzate ad aderire alla fibronectina per 20-30 minuti.Le volant arricchite con F-actin sul bordo anteriore delle membrane cellulari sono indicate con una freccia. Immagini fluorescenti simili della sonda F-actina della falloidina e della colorazione anti-paxillina vengono analizzate per la percentuale di fibre di stress nella diffusione cellulare. In particolare, il trattamento ossidante provoca un aumento significativo della formazione di fibre da stress in tutti i punti di tempo di adesione esaminati e una diminuzione della diffusione cellulare dopo 15 minuti di adesione cellulare alla fibronectina.La placcatura a densità cellulari più elevate porta all'affollamento cellulare che proibisce alle cellule di diffondersi completamente a causa della sovraconfluenza. Si noti che i bordi delle celle sono indistinguibili dalle celle adiacenti. Di conseguenza, la quantificazione delle singole cellule è esclusa e la circonferenza di diffusione non può essere determinata con precisione.Una linea cellulare separata di fibroblasti embrionali di topo viene tenuta in sospensione e quindi placcata sulla fibronectina per 30 minuti. Le cellule sono state quindi fissate e macchiate con un anticorpo anti-paxillina. Si notano le celle fuori fuoco.Inoltre, la reattività incrociata dell'anticorpo anti-paxillina con detriti cellulari altererà la soglia durante l'analisi quantitativa dell'immagine e non dovrebbe essere inclusa nell'analisi. Durante l'elaborazione delle immagini, usa lo strumento di ricerca nelle Fiji per esaminare l'istogramma dell'immagine regolando la luminosità / contrasto per evitare insidie legate alla saturazione del segnale. I cambiamenti nell'adesione e nella diffusione possono influenzare la migrazione cellulare.I metodi per tenere traccia della migrazione a singola cellula, della guarigione delle ferite o dei test di invasione della chemiotassi possono determinare se si verificano alterazioni nella migrazione. Le GTPasi della famiglia Rho regolano le dinamiche di adesione cellulare attraverso la loro specifica attivazione temporale spaziale. I cambiamenti fenotipici nell'adesione e nella diffusione durante lo stress ossidativo possono essere indicativi dei ruoli regolatori a valle per queste proteine.Questo metodo richiede l'uso di linee cellulari BSL-II e reagenti chimici pericolosi. I ricercatori richiedono una formazione sulla sicurezza chimica e biologica, come stabilito dall'ufficio per la salute e la sicurezza ambientale del loro istituto.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3D stabile senza impalcatura artificiale

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Utilizzo di un analizzatore di flusso extracellulare per misurare i cambiamenti nella glicolisi e nel fosforo ossidativo durante la capazione dello sperma del mouse

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...