Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
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著者たちは、スコット・R・ハットン博士とメーガン・S・ブラックレッジ博士に原稿の批判的なレビューに感謝しています。この研究は、ハイポイント大学の研究とスポンサープログラム(MCS)とノースカロライナ州立大学のバイオテクノロジープログラム(MCS)によって資金提供されました。

1. 準備
注:以下に説明するプロトコルは、REF52細胞およびATM+/+またはATM-/----ヒト線維芽細胞での使用のために最適化されています。その他のセルの種類については、以下の「ノートおよびトラブルシューティング」のセクションで説明されているように、さらに最適化が必要になる場合があります。
<ol><li>REF52細胞に対する完全な細胞培養培地の500mLを作?...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、細胞拡散中の動的細胞骨格リモデリングのための多数のアンカレッジ依存性細胞型を迅速にスクリーニングする汎用性と経済的な方法である。特に、この方法は、細胞がFNに付着した場合の酸化ストレス時の応力繊維および焦点接着形成を定量的に調べる(図1A)。さらに、これらの細胞型は、細胞の付着および15、16、22の間に役割を文書化?...

細胞マトリックス接着(すなわち、焦点接着)は、細胞の接着および広がりを媒通する大きく、動的な多分子タンパク質複合体である。これらのプロセスは、組織の発達、維持、および生理機能に不可欠です。焦点接着は、インテグリンなどの膜結合受容体と、細胞骨格アクチンを細胞外マトリックス(ECM)1にリンクする足場タンパク質で構成される。これらの複合体は、様々なシグナル伝達伝達経路の活性化を通じて細胞外環境に存在する生理学的手がかりに応答することができる。したがって、焦点接着は、指向性移行、細胞周期調節、分化、および生存1、2を含む多くの細胞プロセスに細胞外機械的手掛かりを伝播するシグナル伝達センターとして機能する。焦点接着を調節し、相互作用するシグナル伝達分子の1つのグループは、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーを含みます。Rho GTPasesは、その特定の時空間活性化3を介して細胞移動および接着力力学を調節する主要なタンパク質である。当然のことながら、Rhoタンパク質機能の調節不全は、転移、血管新生、および他の人の病理学の数に関与している。特に興味深いのは、細胞還元状態が細胞移動および接着の調節において主な役割を果たす。活性酸素種(ROS)の増加などの酸化還元恒常性の変化は、Rhoタンパク質活性、ならびに接着性を調節することが実証されており、多くの細胞型およびヒト疾患4、5、6 、7、8.例えば、DNA損傷修復セリン/スレオニンキナーゼA-T変異(ATM)の変異によって引き起こされる神経障害運動失調性毛症-毛器形成症(A-T)に苦しむ個人は、転移性癌9のリスクが高い。 10.これらの患者および細胞株におけるATMキナーゼ活性の喪失は、遺伝的変異または化学阻害のいずれかを通じて、ペントースリン酸経路の機能不全による高レベルの酸化ストレスをもたらす7,11、 12.さらに、研究室からの最近の研究は、細胞骨格ダイナミクス(すなわち接着および広がり)をインビトロ5で活性化した直接的な結果として、A-TにおけるROSの病態生理学的役割を強調している。最終的に、Rhoファミリー活性化によって引き起こされる細胞骨格ダイナミクスのこれらの変化は、A-T患者5、13に記載された転移癌のリスクの増加につながる可能性がある。したがって、酸化ストレス中の細胞マトリックス相互作用の相互作用を理解することは、接着と広がりの調節に関する洞察を提供することができる。これらの研究はまた、これらのシグナル伝達プロセスにおけるRhoファミリーGTPasesの可能な役割に関するさらなる調査の段階を設定することができます。
ここに記載されているのは、ATMキナーゼ活性の阻害によって引き起こされる酸化ストレス中の接着アセンブリおよび広がりの初期細胞ダイナミクスを研究するためのプロトコルである。このアッセイは、ECMタンパク質フィブロネクチン(FN)へのアンカレッジ依存性細胞の接着の十分に特徴付けられたメカニズムに基づいている。懸濁液中で維持された細胞がFN上にメッキされると、いくつかのRho GTPasesは、アクチン細胞骨格リモデリング3、14の制御を調整する。形態学的変化は、細胞が円形と円形から平坦化および膨張にシフトするにつれて観察される。これらの観察と一致することは、ECMとの多数のマトリックス接着の開発である。これらの変化は、細胞が付着して15、16に広がるにつれて、最初の1時間の間にRac1を用いたRhoAの二葉性活性化に起因する。
細胞の拡散と同様に接着形態やダイナミクスを調べるために、様々な方法が利用されている。しかし、これらの方法は、高度な長期ライブイメージング全内部反射蛍光(TIRF)または共焦点顕微鏡システムに依存しています。したがって、ユーザーは、特殊な機器やソフトウェアへのアクセス権を持っている必要があります。さらに、これらのバイオイメージングシステムに必要なセットアップ時間は、特に複数の阻害剤または治療条件を同時にテストする場合に、早期接着イベントの捕捉を困難にします。
本明細通り、詳細な方法は、接着アセンブリおよびインビトロで広がるパラメータを評価する、簡単で経済的でありながら定量的な方法を提供する。このプロトコルは、エピ蛍光顕微鏡やCCDカメラなどの一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。このアッセイは、以前に実証されたATMキナーゼ活性の化学阻害によって引き起こされる酸化ストレスの期間後にFN被覆表面にアンカレッジ依存細胞を適用することを含む5。メッキに続いて、細胞は、指定された時間の長さのために付着し、付着することが可能です。未接続の細胞は洗い流され、付着した細胞は固定され、接着のマーカー(例えば、パクシリン)および広がる(例えば、F-アクチン)2、5に蛍光ベースの抗体で標識される。これらのタンパク質を視覚化し、エピ蛍光顕微鏡を使用して記録します。その後のデータ分析は、自由に利用可能なフィジーソフトウェアを使用して実行されます。さらに、この方法は、異なるECMタンパク質、様々な酸化剤/細胞培養条件による治療、または様々なアンカレッジ依存性細胞株を含む幅広い条件下で接着力を調べ、幅広い範囲に対応することができます。生物学的な質問。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

細胞外マトリックス(ECM)への細胞の接着と広がりは、組織の発達および成人組織の恒常性のために不可欠な細胞プロセスである。興味深いことに、酸化ストレスはこれらのプロセスを変え、転移性癌などの疾患の病態生理学に寄与する。したがって、レドックス状態の摂動中に細胞がECM上でどのように付着し、広がるかを理解することは、正常および疾患状態に関する洞察を提供することができる。以下に説明するステップワイズプロトコルは、免疫蛍光ベースのアッセイを利用して、インビトロでのフィブロネクチン(FN)上の不死化線維芽細胞の細胞接着および広がりを特異的に定量する。簡単に言えば、アンカレッジ依存細胞は懸濁液中に保持され、酸化ストレスを誘発するためにATMキナーゼ阻害剤Ku55933に曝露される。その後、細胞をFNコーティング面にめっきし、所定の期間付着させた。付着したままの細胞は、接着の蛍光ベースの抗体マーカー(例えば、パクシリン)および広がり(例えば、F-アクチン)で固定され、標識される。データの取得と分析は、エピ蛍光顕微鏡や自由に入手可能なフィジーソフトウェアを含む一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。この手順は非常に汎用性が高く、様々な細胞株、ECMタンパク質、または阻害剤に対して改変して、幅広い生物学的疑問を調べることができます。

実験セットアップの一般的なスキーマ
図1は、REF52細胞の血清飢餓から始まり、後天蛍光画像の計算解析で終わる細胞接着および拡散プロトコルの一般的なスキーマを表す。プロトコルの主要な手順は、タイムラインに示されています。なお、プロトコルのステップ2は、FNコーティングされたカバーリップの調製について説明し、これはステップ3と同...

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

この方法により、研究者は、酸化ストレス時に細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチンへの細胞接着および細胞外マトリックスタンパク質への広がりの初期のダイナミクスを定量化することができます。この技術は多目的であり、広範囲の条件下で細胞骨格動態を調べるために適合させることができる。また、データ取得と解析は、一般的な実験機器や自由に利用できるソフトウェアを使用して行われます。レドックス状態の変化の間に細胞がECMに付着し、広がるメカニズムを理解することは、転移癌のような正常および疾患状態に関する貴重な洞察を提供することができる。この方法は、さまざまな細胞培養条件下での細胞の広がりと接着、アンカレッジ依存性細胞株、および/酸化剤を調べて、幅広い生物学的問題に答えるために使用できます。この技術を実行するために必要な試薬は数多くあります。したがって、すべてのソリューションは、開始する前に事前に行われていることが不可欠です。BSL-II認定層流フードでは、組織培養認定の24ウェルプレートをセットしました。各ウェルに1つのガラスカバースリップを入れます。テキストプロトコルの図1Bに従ってプレートにラベルを付けます。次に、フィブロネクチン溶液のピペット500マイクロリットルを各ウェルに入れ。各カバースリップの上に溶液を数回ピペットし、均一なコーティングと完全な水没を保証します。蓋でプレートを覆います。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。次に、インキュベーターからプレートを取り出し、フィブロネクチン溶液をウェルから吸引する。1回の1X PBSの500マイクロリットルを使用してウェルを3回洗浄します。1X PBSの最終洗浄を吸引し、5%の炭酸ガスを最低15分間、摂氏37度で500マイクロリットルの0.5%脱脂BSA溶液でブロックします。まず、摂氏37度の水浴で必要な溶液を事前に温めます。BSL-II認定層流フードでは、10平方センチメートルの皿のREF52細胞のコンフルエント単層から始め、暖かい1X PBSの6ミリリットルで細胞を2回洗います。血清は、6ミリリットルの温かい脱脂BSA溶液中で少なくとも1時間細胞を飢えさせる。次に、温めた1X PBSの6ミリリットルで細胞を洗います。PBSを吸引し、1.5ミリリットルの温かい0.5%トリプシン-EDTA溶液を加えます。約2分間、5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。取り外しが完了したことを確認するために、軽い顕微鏡の下で細胞を観察してください。ベンチ上部のプレートをタップした後も細胞が接着している場合は、さらに2分間インキュベーターに戻します。ピペット1.5ミリリットルの温かいトリプシン中和溶液、TNSは、トリプシン化を停止し、切り離された細胞を収集する皿に。溶液をプレートの底面を何度も上下にピペットし、残りの接着細胞をすべて除去する。細胞が塊状に見える場合は、皿の背面を上下に軽くピペット化して細胞懸濁液をさらにトリチュレートします。次に、自動化されたセルカウンターでトリパンブルーの除外を使用してセルを数えます。適切な量の細胞を除去し、15ミリリットルの円錐チューブ中の脱脂BSA中で1ミリリットル当たり10,000個および30,000個の細胞密度の細胞懸濁液を作成します。卓上遠心分離機に固定角度ローターを使用して、細胞を300倍gで5分間遠心します。上清を吸引し、細胞ペレットを7ミリリットルの温められた脱脂BSA溶液で再懸濁する。その後、セルサスペンションを2つの15ミリリットルの円錐管(車両単独制御用、Ku55933用)に均等に分割します。チューブローテーターを使用して、37°Cの細胞培養インキュベーターで90〜120分間チューブを回転させます。めっきの30分前に、各チューブにKu55933とDMSOを加え、最終濃度の10マイクロモルにします。残りの時間、セルのサスペンションをローテーターに戻します。細胞をめっきする直前に、インキュベーターからプレートを回収し、脱脂したBSA溶液を吸引する。この後、各処理群から細胞懸濁液の500マイクロリットルを取り除き、24ウェルプレートのフィブロネクチンコーティングカバースリップの1つにそれぞれを加えます。プレートと細胞懸濁液を前の条件でインキュベートし続けます。次に、細胞が所望の時間の間カバースリップに付着するようにします。接着のための所望の時間が経過した後、プレート内の各カバースリップから細胞溶液を吸引する。ウェルの側面をピペットダウンして、3.7%パラホルムアルデヒド溶液の500マイクロリットルを各カバースリップにそっと分配し、10〜15分待ちます。次に、パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、1回の洗浄につき500マイクロリットルのPBSを使用して1X PBSで各カバースリップを2回洗浄します。PBSを吸引し、各カバースリップに0.2%トリトンX-100と1X PBSの500マイクロリットルを室温で10〜15分間吸引します。その後、各カバースリップを1回のPBSを1回500マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。各カバースリップの細胞を、500マイクロリットルの免疫蛍光遮断バッファーで30〜60分間ブロックします。ブロッキングバッファー内の一次抗パキシリン抗体を1対250の比率で希釈します。よく混合し、各カバースリップに抗体溶液の200マイクロリットルを追加します。室温で少なくとも1時間インキュベートする。この後、抗体溶液を吸引し、1XPBSの500マイクロリットルで各カバースリップを10分間洗浄します。この時点から前方の光からサンプルを保護します。同じブロッキングバッファー溶液中の赤蛍光アレクサ 594 色素とヤギ抗マウス 488 蛍光二次抗体に結合したファロイジン F-アクチン プローブを希釈します。よく混ぜ、各カバースリップに200マイクロリットルの抗体溶液を30分間加えます。抗体溶液を吸引し、1X PBSの500マイクロリットルで各カバースリップを10分間洗浄します。PBSを吸引し、カバースリップを500マイクロリットルの脱イオン水で一度すすいだ。次に、DAPIを含むアンチフェード実装媒体を使用して、カバースリップを顕微鏡スライドに固定します。抗パキシリン抗体による固定および染色後、REF52細胞の蛍光8ビットグレースケール画像が取得されます。すべての画像処理ステップが完了すると、個々の焦点接着が目立ち、焦点を合わせ、容易に区別できる必要があります。抗パキシリンおよびファロイジンF-アクチンプローブ染色された細胞のグレースケール蛍光画像は、フィブロネクチンにメッキされた後に撮影される。顕著な焦点接着およびストレス繊維は、20〜30分間フィブロネクチンに付着させた後、REF52細胞で容易に見えるべきである。細胞膜の先端にあるF-アクチン濃縮フリルは、矢印で示される。ファロイジンF-アクチンプローブと抗パキシリン染色の同様の蛍光画像を、細胞拡散中のストレス繊維の割合について分析する。特に、酸化剤処理は、検討したすべての接着時点でのストレス線維形成の有意な増加を引き起こし、かつ15分間の細胞接着後のフィブロネクチンへの細胞接着の減少を引き起こす。高い細胞密度でめっきは、過剰なコンフルエンシーのために細胞が完全に広がることを禁止する細胞の混雑につながります。セルの端は隣接するセルと区別できないことに注意してください。その結果、個々の細胞の定量が排除され、周囲の広がりが正確に決定できない。マウス胚性線維芽細胞の別の細胞株を懸濁液に保持し、その後、フィブロネクチンに30分間メッキする。次いで細胞を固定し、抗パキシリン抗体で染色した。フォーカスが合っていないセルに注意してください。さらに、細胞デブリを有する抗パキシリン抗体の交差反応性は、定量的画像分析中に閾値を変化させ、分析に含めるべきではない。画像処理中に、フィジーの検索ツールを使用して画像ヒストグラムを調べながら、明るさ/コントラストを調整して、信号の飽和に関連する落とし穴を避けます。接着および拡散の変化は、細胞の移動に影響を与える可能性があります。単一細胞の移動、創傷治癒、または化学運動法の浸潤アッセイを追跡する方法は、移動中に変化が起こっているかどうかを判断することができる。RhoファミリーGTPEsは、特定の空間的時間的活性化を通じて細胞接着ダイナミクスを調節します。酸化ストレス時の接着および広がりにおける表現性変化は、これらのタンパク質の下流調節の役割を示唆している可能性があります。この方法では、BSL-II細胞株および有害な化学試薬を使用する必要があります。研究者は、施設の環境安全衛生事務所によって決定された化学的および生物学的安全訓練を必要とします。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

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ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

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Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...