Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

저자들은 스콧 R. 허튼 박사와 메건 S. 블랙레지 박사가 원고에 대한 비판적 검토에 감사를 표한다. 이 작품은 하이 포인트 대학의 연구 및 후원 프로그램에 의해 투자되었다 (MCS) 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 생명 공학 프로그램 (MCS).

1. 준비
참고: 아래에 설명된 프로토콜은 REF52 세포 및 ATM+/+ 또는ATM-/- 인간 섬유아세포와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 다른 세포 유형은 아래 노트 및 문제 해결 섹션에 설명된 대로 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
<ol><li>REF52 세포에 대한 완전한 세포 배양 배지의 500 mL를 만드십시오. Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)를 포함하는 고혈당 500 mL?...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

여기서 설명된 프로토콜은 세포 확산 동안 동적 세포골격 리모델링을 위한 다수의 앵커리지 의존성 세포 유형을 신속하게 스크리닝하는 다목적및 경제적인 방법입니다. 특히, 이 방법은 세포가 FN에 부착될 때 산화 스트레스 동안 응력 섬유 및 국소 접착 형성을 정량적으로 검사한다(도1A). 더욱이, 이들 세포 표현형은 세포 부착 및 확산15,<sup class="x...

세포 매트릭스 접착 (즉, 초점 접착)은 세포 접착 및 확산을 중재하는 크고 역동적 인 다분자 단백질 복합체입니다. 이러한 프로세스는 조직 개발에 대 한 중요 한, 유지 보수, 그리고 생리 기능. 국소 유착은 세포외 기질 (ECM)에 세포골격 액틴을 연결하는 스캐폴딩 단백질뿐만 아니라 인테그린과 같은 막 결합 수용체로 구성된다1. 이러한 복합체는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 통해 세포 외 환경에 존재하는 물리 화학 적 단서에 반응 할 수있다. 이와 같이, 초점 유착은 지시된 이동, 세포 주기 규칙, 분화 및생존을포함하는 다수의 세포 과정으로 세포 외 기계적 단서를 전파하는 신호 센터로서 역할을 한다1,2. 초점 유착을 조절하고 상호 작용하는 신호 분자의 한 그룹은 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원을 포함합니다. Rho GTPases는 그들의 특정 spatiotemporal 활성화3를 통해 세포 이동 및접착 역학을 통제하는 중요한 단백질입니다. 당연히, Rho 단백질 기능의 dysregulation는 전이, 혈관 신생 및 그 외와 같은 인간적인 병리의 수에서 연루되었습니다. 특히, 세포 산화 상태는 세포 이동 및 접착의 변조에 지배적 인 역할을한다. 반응성 산소 종(ROS)의 증가와 같은 레독스 항상성의 변화는 다수의 세포 유형 및 인간 질병에서 로단백질 활성뿐만 아니라 유착을 조절하는 것으로 입증되었다4,5,6 ,7,8. 예를 들어, DNA 손상 수리 세린/트레오닌 키나아제 A-T 돌연변이(ATM)의 돌연변이에 의해 야기되는 신경장애 운동실조-말실증(A-T)을 앓고 있는 개인은 전이성 암의 위험이 증가합니다9. 10. 이러한 환자와 세포주에서 ATM 키나아제 활성의 손실은 유전적 돌연변이 또는 화학적 억제를 통해, 펜토스 인산통로의 기능 장애로 인한 높은 수준의 산화 스트레스를 초래한다7,11, 12. 더욱이, 실험실에서 최근 연구는 시험관에서 Rho 가족 GTPases를 활성화의 직접적인 결과로 세포골격 역학 (즉, 접착 및 확산)을 변경하여 A-T에서 ROS에 대한 병리생리학적 역할을 강조했다5. 궁극적으로, 로가족 활성화에 의한 세포골격역학의 이러한 변화는 A-T 환자5,13에서언급한 전이성 암의 위험 증가로 이어질 수 있다. 따라서 산화 스트레스 동안 세포 매트릭스 상호 작용 간의 상호 작용을 이해하면 접착 및 확산 의 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 이러한 신호 프로세스에서 Rho 가족 GTPases에 대 한 가능한 역할에 대 한 추가 조사를 위한 무대를 설정할 수 있습니다.
본원에 기재된 프로토콜은 ATM 키나아제 활성의 억제에 의해 야기된 산화 스트레스 동안 유착 어셈블리 및 확산의 초기 세포 역학을 연구하는 프로토콜이다. 이러한 분석은 ECM 단백질 피브로넥틴(FN)에 대한 앵커리지 의존성 세포의 잘 특성화된 기전을 기반으로 한다. 현탁액에서 유지되는 세포가 FN 상에 도금되면, 몇몇 Rho GTPases는 액틴 시토스켈레탈 리모델링3,14의제어를 조정한다. 형태학적 변화는 세포가 원형과 원형의 원형에서 평평해지고 팽창하는 것으로 이동함에 따라 관찰됩니다. 이러한 관찰과 수반되는 것은 ECM과 수많은 매트릭스 유착의 개발이다. 이러한 변화는 세포가 15,16을부착하고 확산함에 따라 첫 번째 시간 동안 Rac1을 가진 RhoA의 양면 활성화에 기인합니다.
세포 확산뿐만 아니라 접착 형태및 역학을 검사하기 위해 다양한 방법이 활용되었습니다. 그러나, 이 방법은 정교한 장기, 살아있는 화상 진찰 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공초점 현미경 검사법에 의존합니다. 따라서 사용자는 특수 장비 및 소프트웨어에 액세스할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 바이오 이미징 시스템에 필요한 설정 시간은 특히 여러 억제제 또는 치료 조건을 동시에 테스트할 때 초기 접착 이벤트를 포착하는 데 어려움을 겪고 있습니다.
본 명세서에서 상세한 방법은, 접착 어셈블리및 시험관 내 확산을 제어하는 파라미터를 평가하는 간단하고 경제적이면서도 정량적인 방법을 제공한다. 프로토콜은 상피 현미경 및 CCD 카메라와 같은 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 분석법은 ATM 키나아제 활성의 화학적 억제에 의한 산화 스트레스의 기간 후에 FN 코팅 된 표면에 앵커리지 의존 세포를 적용하는 것을 포함하며, 이는 이전에 입증된5. 도금 후, 셀은 지정된 시간 동안 부착및 부착할 수 있습니다. 부착되지 않은 세포는 부착된 세포가 부착의 마커(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)에 형광계 항체로 고정및 표지되는 동안2,5. 이 단백질은 그 때 epifluorescence 현미경을 사용하여 구상되고 기록됩니다. 후속 데이터 분석은 자유롭게 사용할 수있는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 ECM 단백질, 다양한 산화제/세포 배양 조건 또는 다양한 앵커리지 의존성 세포주를 포함하는 광범위한 조건 하에서 접착 역학을 검사하는 데 적용될 수 있다. 생물학적 질문.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

세포 외 매트릭스 (ECM)에 세포의 접착 그리고 퍼짐은 유기체 발달 도중 및 성인 조직의 항상성에 대한 필수적인 세포 과정입니다. 흥미롭게도, 산화 스트레스는 이러한 과정을 변경할 수 있습니다., 따라서 전이성 암 같은 질병의 병 리 생리학에 기여. 따라서, 세포가 산화되는 동안 ECM에 부착되고 퍼지는 방법의 메커니즘을 이해하면 정상 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아래에 기재된 단계별 프로토콜은 면역형광계 분석기를 사용하여 시험관내 섬유넥틴(FN)에 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 정량화하는 것이다. 간략하게, 앵커리지 의존성 세포는 산성 스트레스를 유도하기 위해 ATM 키나제 억제제 Ku55933에 노출되고 현탁액에 보유된다. 세포는 FN 코팅 된 표면에 도금되고 소정의 기간 동안 부착 할 수 있습니다. 부착된 상태로 남아 있는 세포는 부착(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)의 형광 계 항체 마커로 고정및 표지된다. 데이터 수집 및 분석은 epifluorescence 현미경 및 자유롭게 사용할 수 있는 피지 소프트웨어를 포함하여 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 매우 다재다능하고 다양한 세포주, ECM 단백질, 또는 억제제에 대해 광범위한 생물학적 질문을 검사하기 위해 변형될 수 있다.

실험 설정의 일반적인 스키마
도 1은 REF52 세포의 혈청 결치로 시작하여 후천형광이미지의 전산분석으로 끝나는 세포 부착 및 확산 프로토콜에 대한 일반적인 스키마를 나타낸다. 프로토콜의 주요 단계는 타임라인에 나와 있습니다. 참고로, 프로토콜의 2단계는 FN 코팅 커버슬립의 제조를 기술하며, 이는 3단계와 동시에 수행되어야 한다: 혈청 을 분주하게...

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

이 방법은 연구원이 산화 스트레스 도중 세포 외 매트릭스 단백질 섬유네신에 세포 접착 및 앵커리지 의존성 세포의 초기 역학을 정량화할 수 있게 합니다. 이 기술은 다재다능하며 광범위한 조건에서 사이토스켈레탈 역학을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 또한 공통 실험실 장비와 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.세포가 백변성 상태의 변경 중에 ECM에 부착하고 퍼지는 방법에 대한 메커니즘을 이해하면 전이성 암과 같은 정상 및 질병 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 상이한 세포 배양 조건, 앵커리지 의존세포주 및/산화제 하에서 세포 확산 및 접착력을 검사하여 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 사용할 수 있다. 이 기술을 수행하는 데 필요한 수많은 시약이 있습니다.따라서 모든 솔루션이 시작하기 전에 사전에 만들어지는 것이 필수적입니다. BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 조직 배양 인증 24웰 플레이트를 설정. 유리 커버슬립 1개를 각 웰에 넣습니다.텍스트 프로토콜의 그림 1B에 따라 플레이트에 레이블을 지정합니다. 다음으로, 각 우물에 섬유네틴 용액의 파이펫 500 마이크로리터. 각 커버 위에 용액을 피펫하면 균일한 코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 몇 번 미끄러짐.뚜껑으로 접시를 덮습니다. 1시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 섬유네틴 용액을 흡인시합니다.세척당 1X PBS 500 마이크로리터를 사용하여 우물을 세 번 씻으시면 됩니다. 1X PBS의 최종 세척을 흡수하고, 최소 15분 동안 5%의 이산화탄소를 37도에서 0.5%의 BSA 용액500마이크로리터로 차단합니다. 먼저, 섭씨 37도에서 수조에 필요한 솔루션을 미리 데워보겠습니다.BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 REF52 세포의 컨물루블 한 단층으로 시작하여 10 평방 센티미터 의 접시에 담아 따뜻한 1X PBS6 밀리리터로 셀을 두 번 씻으시다. 세럼은 따뜻한 디리피들 BSA 용액의 6 밀리리터에서 적어도 한 시간 동안 세포를 굶어 버티고 있습니다. 다음으로, 따뜻하게 1X PBS의 6 밀리리터로 세포를 씻는다.PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 솔루션의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 약 2 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 세포를 배양. 분리가 완료되었는지 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 세포를 관찰하십시오.벤치 상단의 플레이트를 탭한 후에도 셀이 여전히 부착되어 있는 경우 추가로 2분 동안 인큐베이터로 되돌보아 보입니다. 피펫 1.5 밀리리터의 따뜻한 트립신 중화 용액, TNS, 접시에 트립시화를 중지하고 분리 된 세포를 수집합니다. 파이펫은 나머지 부착 셀을 모두 제거하기 위해 플레이트 의 바닥을 위아래로 여러 번 피펫합니다.세포가 덩어리로 나타나면 접시 뒤쪽을 위아래로 부드럽게 피펫하여 셀 현탁액을 세타게 합니다. 다음으로, 자동화된 셀 카운터에서 trypan 파란색 제외를 사용하여 셀을 계산합니다. 15밀리리터 원칼 튜브에서 10, 000 및 30, 밀리리터 당 000 세포 사이의 세포 밀도를 가진 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 양의 세포를 제거합니다.탁상 원심분리기의 고정 각도 로터를 사용하여 5분 동안 300배 g의 원심분리기를 사용합니다. 슈퍼나탈아를 흡인시키고 따뜻한 BSA 용액의 7밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 셀 서스펜션을 차량 단독 제어를 위한 15밀리리터 원뿔튜브 2개와 Ku55933용 튜브로 균등하게 분할합니다.튜브 회전기를 사용하여 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 90~120분 동안 튜브를 회전합니다. 도금 30분 전에 각 튜브에 Ku55933 및 DMSO를 추가하여 10 마이크로몰러의 최종 농도를 유지합니다. 남은 시간 동안 셀 서스펜션을 회전기로 반환합니다.세포를 도금하기 직전에 인큐베이터에서 플레이트를 회수하고 탈면된 BSA 용액을 흡인시합니다. 그 후, 각 치료군으로부터 세포 현탁액의 500마이크로리터를 제거하고 24웰 플레이트내의 섬유네틴 코팅 커버 슬립 중 하나에 각각을 추가한다. 이전 조건에서 플레이트및 셀 서스펜션을 계속 배양합니다.그런 다음 셀이 원하는 시간 동안 커버 슬립을 부착할 수 있도록 합니다. 접착에 대한 원하는 시간이 경과한 후, 플레이트내의 각 커버슬립으로부터 셀 용액을 흡인한다. 웰의 측면을 피펫하여 각 커버슬립에 3.7%의 파라포름알데히드 용액500마이크로리터를 부드럽게 분배하고 10~15분 간 기다립니다.다음으로, 파라포름알데히드 용액을 제거하고 세척당 PBS 500 마이크로리터를 사용하여 1X PBS로 각 커버슬립을 두 번 세척합니다. 실온에서 10~15분 동안 0.2%트리톤 X-100 및 1X PBS의 500마이크로리터로 각 커버슬립에 PBS 및 투과셀을 흡인한다. 그런 다음 세척당 PBS 500 마이크로리터를 사용하여 1X PBS로 각 커버슬립을 세 번 세척합니다.면역 형광 차단 버퍼의 500 마이크로 리터와 각 커버 슬립에 세포를 차단 30 받는 일 60 분. 1-250의 비율로 차단 완충제에서 1차 항 팍실린 항체를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 항체 용액의 200 마이크로리터를 추가합니다.실온에서 적어도 한 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 항체 용액을 흡인시키고 각 커버슬립을 1X PBS 500 마이크로리터로 10분 동안 세척한다. 이 시점부터 앞으로 샘플을 보호합니다.동일한 차단 버퍼 용액에서 적색 형광 알렉사 594 염료 및 염소 항마우스 488 형광 이차 항체에 컨쥬게이징된 phalloidin F-actin 프로브를 희석시. 잘 섞고 항체 용액200마이크로리터를 각 커버슬립에 30분간 추가합니다. 항체 용액을 흡인시키고 각 커버슬립을 1X PBS 500마이크로리터로 10분간 세척합니다.PBS를 흡인하고 500 마이크로리터의 산화된 물로 커버 슬립을 헹구세요. 그런 다음 DAPI를 함유한 페이드 장착 방지 배지를 사용하여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 고정합니다. 항 팍실린 항체로 고정 및 염색 후, REF52 세포의 형광 8 비트 그레이스케일 이미지가 획득된다.모든 이미지 처리 단계가 완료되면 개별 초점 접착력이 두드러지고 초점이 맞추어져 서로 쉽게 구별되어야 합니다. 항 팍실린과 프할로이진 F-액틴 프로브 스테인드 셀의 그레이스케일 형광 이미지는 섬유네틴에 도금된 후 촬영됩니다. 눈에 띄는 초점 접착및 응력 섬유는 20-30 분 동안 섬유 네틴을 부착 할 수 있게 된 후 REF52 세포에서 쉽게 볼 수 있어야합니다.세포막의 앞가장자리에서 F-actin 농축 주름은 화살표로 표시됩니다. phalloidin F-actin 프로브 및 안티 팍실린 염색의 유사한 형광 심상은 세포 확산에 있는 응력 섬유의 백분율을 위해 분석됩니다. 특히, 산화 치료는 검사된 모든 접착 시간 지점에서 스트레스 섬유 형성이 현저히 증가하고, 섬유네틴에 대한 세포 접착15분 이후에 세포 확산이 감소합니다.더 높은 세포 밀도에서 도금은 과응성 때문에 완전히 퍼지는 세포를 금지하는 세포 혼잡으로 이끌어 냅니다. 셀 모서리는 인접한 셀과 구별할 수 없습니다. 그 결과, 개별 세포의 정량화가 배제되고 둘레확산을 정확하게 결정할 수 없다.마우스 배아 섬유아세포의 별도의 세포주현탁액은 현탁액으로 유지된 다음 30분 동안 섬유네틴에 도금된다. 세포는 그 때 항 paxillin 항체로 고정되고 얼룩졌습니다. 초점이 맞고 셀에 유의하십시오.더욱이, 세포이파편을 가진 항팍실린 항체의 상호 반응성은 정량적 이미지 분석 중에 임계값을 변경하고 분석에 포함되어서는 안 된다. 이미지 처리 중에 피지의 조회 도구를 사용하여 이미지 히스토그램을 검사하면서 신호 포화와 관련된 함정을 피하기 위해 밝기 /대비를 조정합니다. 접착 및 확산의 변화는 세포 이동에 영향을 미칠 수 있습니다.단일 세포 마이그레이션, 상처 치유 또는 화학 요법 침입 검사를 추적하는 방법은 마이그레이션의 변경이 발생하는지 확인할 수 있습니다. Rho 제품군 GTPases는 특정 공간 측두활성화를 통해 세포 접착 역학을 조절합니다. 산화 스트레스 중 접착 및 확산에 있는 Phenotypic 변경은 이 단백질을 위한 다운스트림 규제 역할의 암시일 수 있습니다.이 방법은 BSL-II 세포주 및 유해 화학 시약의 사용을 필요로한다. 연구원은 그들의 기관의 환경 건강 및 안전 사무실에 의해 결정된 화학 및 생물학 안전 훈련을 요구합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스 정자 주입 중 글리코용해 및 산화 인산화의 변화를 측정합니다.

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...