Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Forfatterne takker DRS. Scott R. Hutton og Meghan S. Blackledge for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av high point University ' s Research and sponsede programmer (MCS) og bioteknologi program ved North Carolina State University (MCS).

1. forberedelser
Merk: protokollen som er beskrevet nedenfor er optimalisert for bruk med REF52 celler og ATM+/+ eller ATM-/- humant fibroblaster. Andre celletyper kan kreve ytterligere optimalisering som beskrevet i notatene og feilsøkings delene nedenfor.
<ol><li>Lag 500 mL komplett cellekultur medium for REF52 celler. Til 500 mL med høy glukose som inneholder Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) tilsett 10% FBS, 2 mM L-glutamin, og 100 enheter/mL penicill...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Protokollen er beskrevet her er en allsidig og økonomisk måte å raskt skjermen en rekke forankring-avhengige celletyper for dynamisk cytoskeleton remodeling under celle spredning. Spesielt undersøker denne metoden kvantitativt stress fiber og fokal vedheft dannelse under oksidativt stress når cellene holder seg til FN (figur 1a). Videre kan disse cellulære fenotyper foreslå en regulerende rolle for medlemmer av Rho-familien av små GTPases siden de har dokumentert roller under celle v...

Cell-Matrix adhesjon (dvs. fokal adhesjon) er store og dynamiske multimolecular protein komplekser som megle celle vedheft og spredning. Disse prosessene er avgjørende for vevs utvikling, vedlikehold og fysiologisk funksjon. Fokal adhesjon er sammensatt av membran-bundet reseptorer, slik som integrins, samt stillas proteiner som knytter cytoskjelettkomponenter utgangen til ekstracellulære matrise (ECM)1. Disse komplekser er i stand til å reagere på fysiokjemiske stikkordene til stede i ekstracellulære miljøet gjennom aktivering av ulike signalering Transduction trasé. Som sådan, fokal adhesjon tjene som signalering sentre å spre ekstracellulære mekaniske stikkordene inn i en rekke cellulære prosesser inkludert styrt migrasjon, celle syklus regulering, differensiering, og overlevelse1,2. En gruppe av signalering molekyler som regulerer og samhandler med fokal adhesjon inkluderer medlemmer av Rho familien av små GTPases. Rho GTPases er viktige proteiner som regulerer celle migrasjon og vedheft dynamikk gjennom deres spesifikke spatiotemporal aktivering3. Ikke overraskende har feilregulering av Rho protein funksjon vært innblandet i en rekke menneskelige patologi som metastasering, angiogenese og andre. Av spesiell interesse, spiller mobilnettet Redox status en dominerende rolle i modulering av celle migrasjon og vedheft. Endringer i Redox homeostase, slik som økninger i reaktive oksygen arter (ros), har vist å regulere Rho protein aktivitet, samt vedheft, i en rekke celletyper og menneskelige sykdommer4,5,6 ,7,8. For eksempel, personer som lider av nevrologisk lidelse ataksi-telangiectasia (A-T), som er forårsaket av en mutasjon i DNA skade reparasjon Serine/threonin kinase A-T-mutert (ATM), har en økt risiko for metastatisk kreft9, 10i. Tap av ATM kinase aktivitet hos disse pasientene og cellelinjer, enten gjennom genetisk mutasjon eller kjemisk hemming, resulterer i høye nivåer av oksidativt stress på grunn av dysfunksjon av pentose fosfat sti7,11, det er 12. Videre har nyere studier fra laboratoriet fremhevet en patofysiologiske rolle for ROS i A-T ved å endre cytoskjelettkomponenter dynamikk (dvs. vedheft og spredning) som et direkte resultat av aktivering av Rho-familien GTPases in vitro5. Til syvendeog sist, disse endringene i cytoskjelettkomponenter dynamikk forårsaket av Rho familie aktivering kan føre til økt risiko for metastatisk kreft bemerket i A-T pasienter5,13. Derfor kan det å forstå samspillet mellom celle-matrise interaksjoner under oksidativt stress gi innsikt i regulering av vedheft og spredning. Disse studiene kan også sette scenen for videre undersøkelser i en mulig rolle for Rho familien GTPases i disse signalering prosesser.
Beskrevet her er en protokoll for å studere tidlig Cellular dynamikk av vedheft montering og spredning under oksidativt stress forårsaket av hemming av ATM kinase aktivitet. Denne analysen er basert på den godt preget mekanisme av forankring-avhengige celler vedheft til ECM protein fibronektin (FN). Når cellene opprettholdt i suspensjon er belagt på FN, flere Rho GTPases koordinere kontroll av utgangen cytoskjelettkomponenter remodeling3,14. Morfologiske endringer er observert som celler Skift fra runde og sirkulære i utseende til flatet og utvides. Samtidig med disse observasjonene er utviklingen av en rekke Matrix adhesjon med ECM. Disse endringene tilskrives bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 i løpet av den første timen når cellene overholder og sprer 15,16.
En rekke metoder har blitt benyttet for å undersøke vedheft morfologi og dynamikk, samt celle spredning. Men disse metodene er avhengige av sofistikerte langsiktige, Live-Imaging totale interne refleksjon fluorescens (TIRF) eller konfokalmikroskopi mikroskopi systemer. Dermed må brukerne ha tilgang til spesialisert utstyr og programvare. Videre er den innstilte tiden som kreves av disse bio-Imaging systemer gjør fange tidlig vedheft hendelser utfordrende, spesielt når du tester flere hemmere eller behandling forhold samtidig.
Metodene detaljert, her, gir en grei, økonomisk, men likevel kvantitativ måte å vurdere parametre som regulerer vedheft forsamlingen og sprer in vitro. Protokollen utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, for eksempel et epifluorescence mikroskop og CCD-kamera. Denne analysen innebærer å anvende anker avhengige celler til en FN-belagt overflate etter en periode med oksidativt stress forårsaket av kjemisk hemming av ATM kinase aktivitet, som har blitt demonstrert tidligere5. Etter plating, har celler lov til å feste og overholde for spesifiserte lengder tid. Ledige celler vaskes bort, mens vedlagte celler er faste og merket med fluorescens-baserte antistoffer mot markører for vedheft (f. eks paxillin) og sprer seg (f. eksutgangen)2,5. Disse proteinene er så visualisere og tatt opp ved hjelp av et epifluorescence mikroskop. Påfølgende dataanalyse utføres ved hjelp av fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Videre kan denne metoden tilpasses for å undersøke vedheft dynamikk under et bredt spekter av forhold, inkludert ulike ECM-proteiner, behandling med ulike oksidanter/cellekultur forhold eller en rekke forankring-avhengige cellelinjer for å løse et bredt spekter av biologiske spørsmål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

Vedheft og spredning av celler på ekstracellulære matrise (ECM) er essensielle cellulære prosesser under organismal utvikling og for homeostase av voksen vev. Interessant, kan oksidativt stress endre disse prosessene, og dermed bidra til patofysiologi av sykdommer som metastatisk kreft. Derfor forstå mekanismen (e) av hvordan cellene feste og spre på ECM under forstyrrelser i Redox status kan gi innsikt i normal og sykdom tilstander. Beskrevet nedenfor er en trinn-klok protokoll som utnytter en immunofluorescence-basert analysen til spesifikt kvantifisere celle vedheft og spredning av udødeliggjort Fibroblast celler på fibronektin (FN) in vitro. Kort, er anker avhengige celler holdt i suspensjon og eksponert for ATM kinase inhibitor Ku55933 å indusere oksidativt stress. Celler blir deretter belagt på FN-belagt overflate og lov til å feste for forhåndsbestemte perioder av gangen. Celler som forblir vedlagt, er faste og merket med fluorescens antistoff markører for vedheft (f.eks. paxillin) og spredning (F-utgangen). Data innsamling og analyse utføres ved hjelp av allment tilgjengelig laboratorieutstyr, inkludert et epifluorescence mikroskop og fritt tilgjengelig Fiji-programvare. Denne prosedyren er svært allsidig og kan endres for en rekke cellelinjer, ECM proteiner, eller hemmere for å undersøke et bredt spekter av biologiske spørsmål.

Et generelt skjema for det eksperimentelle oppsettet
Figur 1 representerer den generelle skjema for cellen vedheft og spre protokollen begynner med serum SULT av REF52 celler og slutter med beregningsorientert analyse av ervervet fluorescens bilder. Viktige trinn i protokollen illustreres på tidslinjen. Av notatet, trinn 2 av protokollen beskriver utarbeidelse av FN-belagt coverslips, som bør utføres samtidig med trinn 3: serum sultende REF52 celler før du plass...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Denne metoden er nyttig for kvantifisere tidlig dynamikk av cellulær vedheft og spredning av forankring-avhengige celler på fibronektin. Videre kan denne analysen brukes til å undersøke virkningene av endrede Redox homeostase på celle spredning og/eller celle vedheft-relaterte intracellulære signalering trasé.

Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Denne metoden vil gjøre det mulig for forskere å kvantifisere den tidlige dynamikken i cellulær vedheft og spredning av forankringsavhengige celler på det ekstracellulære matriseproteinfibronectin under oksidativt stress. Denne teknikken er allsidig og kan tilpasses for å undersøke cytoskeletal dynamikk under et bredt spekter av forhold. Videre utføres datainnsamling og analyse ved hjelp av vanlig laboratorieutstyr og fritt tilgjengelig programvare.Å forstå mekanismene for hvordan celler fester og sprer seg på ECM under endringer i redoksstatus kan gi verdifull innsikt i normale og sykdomstilstander, for eksempel metastatisk kreft. Denne metoden kan brukes til å undersøke cellespredning og vedheft under ulike cellekulturforhold, forankringsavhengige cellelinjer og/oksidanter for å svare på et bredt spekter av biologiske spørsmål. Det er mange reagenser som kreves for å utføre denne teknikken.Derfor er det viktig at alle løsninger gjøres på forhånd før du begynner. I en BSL-II-sertifisert laminær strømningshette satte du ut en vevskultursertifisert 24-brønnsplate. Legg en glassdeksler i hver brønn.Merk platen i henhold til figur 1B i tekstprotokollen. Deretter pipette 500 mikroliter av fibronectin løsningen i hver brønn. Pipette oppløsningen over hver dekkglass et par ganger for å sikre et jevnt belegg og fullstendig nedsenking.Dekk platen med lokket. Inkuber platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time. Fjern deretter platen fra inkubatoren og aspirer fibronectinløsningen fra brønnene.Vask brønnene tre ganger med 500 mikroliter 1X PBS per vask. Aspirer den endelige vasken av 1X PBS, og blokker brønner med 500 mikroliter av en 0,5% delipidert BSA-løsning ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i minst 15 minutter. Først forvarm de nødvendige løsningene i et vannbad ved 37 grader Celsius.I en BSL-II-sertifisert laminær strømningshette starter du med et sammenføyd monolag av REF52-celler i en 10-kvadratcentimeters tallerken og vask cellene to ganger med seks milliliter varm 1X PBS. Serum sulter cellene i minst en time i seks milliliter varm delipidert BSA-løsning. Deretter vasker du cellene med seks milliliter oppvarmet 1X PBS.Aspirer PBS og tilsett 1,5 milliliter varm 0,5% trypsin-EDTA-løsning. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i ca to minutter. Vær oppmerksom på cellene under et lett mikroskop for å sikre at løsrivelsen er fullført.Hvis cellene fortsatt er tilhengere etter å ha trykket på platen på benketoppen, returnerer du dem til inkubatoren i ytterligere to minutter. Pipette 1,5 milliliter varm trypsin nøytraliserende løsning, TNS, til parabolen for å stoppe trypsinisering og samle løsceller. Pipette oppløsningen opp og ned over bunnen av platen mange ganger for å fjerne alle de gjenværende tilhengerne.Hvis cellene vises klumpete, ytterligere triturate celle suspensjon ved forsiktig pipettering opp og ned over baksiden av parabolen. Deretter teller du cellene ved hjelp av trypan blå ekskludering i en automatisert celleteller. Fjern en passende mengde celler for å lage en cellesuspensjon med celletettheten mellom 10, 000 og 30 000 celler per milliliter i delipidated BSA i et konisk rør på 15 milliliter.Bruk en fastvinkelrotor i en bordplate sentrifuge for å sentrifuge cellene på 300 ganger g i fem minutter. Aspirer den supernatante og re-suspendere cellepellet i syv milliliter varm delipidated BSA løsning. Deretter jevnt dele celle suspensjon i to 15-milliliter koniske rør, en for kjøretøy-alene kontroll, og en for Ku55933.Ved hjelp av en rørrotator dreier rørene i 90 til 120 minutter i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius. 30 minutter før plating, tilsett Ku55933 og DMSO til hvert rør til en endelig konsentrasjon på 10 mikromos. Returner cellesuspensjonen til rotatoren for gjenværende tid.Umiddelbart før de fletter cellene, hent platen fra inkubatoren og aspirer den deliperte BSA-oppløsningen. Etter dette fjerner du 500 mikroliter av cellesuspensjonen fra hver behandlingsgruppe og legger hver til en av de fibronectinbelagte dekselslippene i 24-brønnplaten. Fortsett å inkubere platen og cellefjæringen under tidligere forhold.La deretter cellene holde seg til dekkslippen i ønsket tidsperiode. Etter ønsket tid for vedheft har gått, aspirer celleløsningen fra hver dekkslipp i platen. Dispenser forsiktig 500 mikroliter med 3,7 % paraformaldehydoppløsning på hver dekkslipp ved å pipe ned sidene av brønnene, og vent 10 til 15 minutter.Deretter fjerner du paraformaldehydoppløsningen og vasker hver dekkslip to ganger med 1X PBS ved hjelp av 500 mikroliter PBS per vask. Aspirer PBS- og permeabiliserte celler på hver dekkslipp med 500 mikroliter på 0,2% Triton X-100 og 1X PBS i 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Vask deretter hver dekkslips tre ganger med 1X PBS ved hjelp av 500 mikroliter PBS per vask.Blokker cellene på hver dekkslips med 500 mikroliter immunofluorescence blokkerer buffer i 30 til 60 minutter. Fortynn det primære anti-paxillin antistoffet i blokkeringsbufferen i forholdet mellom en til 250. Bland godt og tilsett 200 mikroliter av antistoffløsningen til hver dekkslip.Inkuber ved romtemperatur i minst en time. Etter dette aspirerer antistoffoppløsningen og vasker hver dekkslipp med 500 mikroliter 1X PBS i 10 minutter. Beskytt prøvene mot lys fra dette punktet fremover.Fortynn falloidin F-actin sonden konjugert til den røde fluorescerende Alexa 594 fargestoff og geit anti-mus 488 fluorescerende sekundær antistoff i samme blokkerende buffer løsning. Bland godt og tilsett 200 mikroliter av antistoffløsningen til hver dekkslipp i 30 minutter. Aspirer antistoffoppløsningen og vask hver dekkslipp med 500 mikroliter 1X PBS i 10 minutter.Aspirer PBS og skyll dekselet en gang med 500 mikroliter av deionisert vann. Fest deretter dekselet glir på mikroskop lysbilder ved hjelp av anti-fade monteringsmedium som inneholder DAPI. Etter fiksering og farging med et anti-paxillin antistoff, er fluorescerende 8-bits gråtonebilder av REF52-cellene anskaffet.Ved fullføring av alle bildebehandlingstrinn, bør individuelle fokaladhesjoner være fremtredende, i fokus og lett skilles fra hverandre. Gråtoner fluorescens bilder av anti-paxillin og falloidin F-actin sonde farget celler blir deretter tatt etter å ha blitt belagt på fibronectin. Fremtredende fokale adhesjoner og stressfibre bør være lett synlig i REF52-celler etter å ha fått lov til å følge fibronectin i 20 til 30 minutter.F-actin beriket ruffles i forkant av cellemembraner er indikert med en pil. Lignende fluorescerende bilder av falloidin F-actin sonde og anti-paxillin farging analyseres for prosentandelen av stressfibre i cellespredning. Spesielt forårsaker oksidant behandling en betydelig økning i stressfiberdannelse ved alle vedheftstidspunkter undersøkt, og en reduksjon i cellespredning etter 15 minutter med celleadhesjon til fibronectin.Plating ved høyere celle tettheter fører til cellulær trengsel som forbyr celler fra å fullstendig spre seg på grunn av overkonfluens. Legg merke til at cellekantene ikke kan skilles fra tilstøtende celler. Som et resultat er kvantifisering av individuelle celler utelukket, og spredning av omkrets kan ikke nøyaktig bestemmes.En egen cellelinje av mus embryonale fibroblaster holdes i suspensjon og deretter belagt på fibronectin i 30 minutter. Cellene ble deretter fikset og farget med et anti-paxillin antistoff. Legg merke til de ut-av-fokus-cellene.Videre vil kryssreaktiviteten til anti-paxillinantistoffet med cellulært avfall endre terskelen under kvantitativ bildeanalyse og bør ikke inkluderes i analysen. Under bildebehandling bruker du oppslagsverktøyet på Fiji til å undersøke bildets histogrammet mens du justerer lysstyrken/kontrasten for å unngå fallgruver knyttet til signalmetning. Endringer i vedheft og spredning kan påvirke cellemigrasjon.Metoder for å spore encellemigrasjon, sårheling eller chemotaxis invasjonsanalyser kan avgjøre om endringer i migrasjon oppstår. Rho familie GTPases regulere celle vedheft dynamikk gjennom deres spesifikke romlig temporal aktivering. Fenotypiske endringer i vedheft og spredning under oksidativt stress kan være noe som tyder på nedstrøms regulatoriske roller for disse proteinene.Denne metoden krever bruk av BSL-II cellelinjer og farlige kjemiske reagenser. Forskere krever kjemisk og biologisk sikkerhetsopplæring som bestemmes av institusjonens miljøhelse- og sikkerhetskontor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epiteliale gutceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Evaluering av virkningen av Protein Oppsamling på mobilnettet oksidativt Stress i gjær

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulere levende celler å konstruere stabil 3D Cellular samling uten kunstige stillas

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Bruke en ekstracellulære Flux Analyzer til å måle endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under Mouse sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...