Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Os autores agradecem aos Drs. Scott R. Hutton e Meghan S. Blackledge pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela High Point University ' s Research and patrocinado Programs (MCS) e o programa de biotecnologia da North Carolina State University (MCS).

1. os preparativos
Nota: o protocolo descrito abaixo foi otimizado para o uso com células REF52 e ATM+/+ ou ATM-/- fibroblastos humanos. Outros tipos de célula podem exigir mais otimização conforme descrito nas seções de anotações e solução de problemas abaixo.
<ol><li>Faça 500 mL de meio de cultura celular completo para células REF52. Para 500 mL de alta-glicose contendo Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) adicionar 10% FBS, 2 mM L-glutamina, e ...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

O protocolo descrito aqui é uma maneira versátil e econômica de tela ràpida uma série de tipos ancoragem-dependentes da pilha para o citoesqueleto dinâmico que remodela durante espalhar da pilha. Em particular, este método examina quantitativamente a fibra de estresse e a formação de adesão focal durante o estresse oxidativo quando as células aderem à FN (Figura 1a). Além disso, estes fenótipos celulares podem sugerir um papel regulamentar para membros da família de Rho de GTP...

Aderências de matriz celular (ou seja, aderências focais) são grandes e dinâmicos complexos proteicos multimoleculares que mediam a adesão e disseminação celular. Estes processos são críticos para o desenvolvimento do tecido, a manutenção, e a função physiological. As aderências focais são compostas de receptores ligados à membrana, como as integrinas, bem como as proteínas de andaimes que ligam a actina citoesquelética à matriz extracelular (ECM)1. Esses complexos são capazes de responder a pistas fisioquímicas presentes no ambiente extracelular através da ativação de várias vias de transdução de sinalização. Como tal, as aderências focais servem como centros de sinalização para propagar pistas mecânicas extracelulares em vários processos celulares, incluindo migraçãodirecionada, regulaçãodo ciclo celular, diferenciação e sobrevida1,2. Um grupo de moléculas de sinalização que regulam e interagem com aderências focais inclui membros da família Rho de pequenos GTPases. As GTPases Rho são proteínas-chave que regulam a migração celular e a dinâmica de aderência através de sua ativação espaciotemporal específica3. Não surpreendentemente, a desregulação da função da proteína Rho tem sido implicada em um número de patologias humanas, tais como metástases, angiogênese, e outros. De particular interesse, o status redox celular desempenha um papel predominante na modulação da migração celular e adesão. Alterações na homeostase redox, como aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS), têm sido demonstradas para regular a atividade protéica de Rho, bem como adesão, em um número de tipos de células e doenças humanas4,5,6 ,7,8. Por exemplo, indivíduos que sofrem da desordem neurológica ataxia-Telangiectasia (A-T), que é causada por uma mutação no reparo de danos de DNA serina/treonina quinase A-T-Mutated (ATM), têm um risco aumentado de câncer metastático9, a 10. A perda da atividade da quinase ATM nesses pacientes e linhagens celulares, seja por meio da mutação genética ou da inibição química, resulta em altos níveis de estresse oxidativo devido à disfunção da via de fosfato pentose7,11, doze anos. Além disso, os estudos recentes do laboratório destacaram um papel patofisiológico para ROS em A-T alterando a dinâmica do cytoesquelético (isto é. adesão e espalhar) como um resultado direto de ativar GTPases da família de Rho in vitro5. Em última análise, essas alterações na dinâmica citoesquelética causadas pela ativação da família Rho podem levar ao aumento do risco de câncer metastático observado em pacientes com A-T5,13. Portanto, compreender a interação entre as interações célula-matriz durante o estresse oxidativo pode fornecer insights sobre a regulação da adesão e disseminação. Estes estudos podem igualmente ajustar o estágio para umas investigações mais adicionais em um papel possível para GTPases da família de Rho nestes processos de sinalização.
Descrito aqui é um protocolo para estudar a dinâmica celular precoce do conjunto de aderência e disseminação durante o estresse oxidativo causado pela inibição da atividade da quinase ATM. Este ensaio baseia-se no mecanismo bem caracterizado de adesão de células dependentes de ancoragem à fibronectina de proteína ECM (FN). Quando as células mantidas em suspensão são chapeadas na FN, vários Rho GTPases coordenam o controledo remodelamentocitoesquelético de actina14,15. Alterações morfológicas são observadas à medida que as células mudam de volta e circulares na aparência para achatado e expandido. Concomitante com estas observações é o desenvolvimento de aderências numerosas da matriz com o ECM. Essas alterações são atribuídas à ativação bifásica de Rhoa com Rac1 durante a primeira hora em que as células aderem e se espalham 15,16.
Uma variedade de métodos tem sido utilizada para examinar a morfologia da adesão e dinâmica, bem como a propagação celular. No entanto, esses métodos dependem de sistemas sofisticados de fluorescência de reflexão interna (TIRF) ou de microscopia confocal de longo prazo e de imagem viva. Assim, os usuários devem ter acesso a equipamentos e softwares especializados. Além disso, o tempo de set-up exigido por esses sistemas de bioimagem torna a captura de eventos de adesão precoce desafiador, especialmente quando o teste de múltiplos inibidores ou condições de tratamento simultaneamente.
Os métodos detalhados, aqui, fornecem uma maneira direta, econômica, contudo quantitativa de avaliar os parâmetros que governam o conjunto da adesão e que espalham in vitro. O protocolo é realizado usando equipamentos laboratoriais comumente disponíveis, como um microscópio de epifluorescência e câmera CCD. Este ensaio envolve a aplicação de células dependentes de ancoragem a uma superfície revestida com FN após um período de estresse oxidativo causado pela inibição química da atividade da quinase ATM, que tem sido demonstrada anteriormente5. Após o chapeamento, as células são permitidas para anexar e aderir para comprimentos especificados de tempo. As células não anexadas são lavadas, enquanto as células anexadas são fixas e marcadas com anticorpos à base de fluorescência para marcadores de aderência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina)2,5. Essas proteínas são então visualizadas e gravadas usando um microscópio de epifluorescência. A análise de dados subseqüente é executada usando o software livremente disponível de Fiji. Além disso, este método pode ser adaptado para examinar a dinâmica de adesão uma ampla gama de condições, incluindo diferentes proteínas de ECM, tratamento com vários oxidantes/condições de cultura celular ou uma variedade de linhas celulares dependentes de ancoragem para abordar uma ampla gama de questões biológicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

A adesão e disseminação de células para a matriz extracelular (ECM) são processos celulares essenciais durante o desenvolvimento organizador e para a homeostase de tecidos adultos. Curiosamente, o estresse oxidativo pode alterar esses processos, contribuindo assim para a fisiopatologia de doenças como o câncer metastático. Conseqüentemente, compreender o mecanismo (s) de como as pilhas anexam e espalham no ECM durante as perturbações no status redox pode fornecer a introspecção em Estados normais e da doença. É descrito abaixo um protocolo passo-sábio que utilize um ensaio immunofluorescence-baseado para quantificar especificamente a adesão e a propagação da pilha de pilhas imortalizado do fibroblasto no fibronectina (FN) in vitro. Brevemente, as células dependentes de ancoragem são mantidas em suspensão e expostas ao inibidor da quinase ATM Ku55933 para induzir o estresse oxidativo. As pilhas são chapeadas então na superfície FN-revestida e permitidas anexar por períodos de tempo predeterminados. As células que permanecem ligadas são fixas e rotuladas com marcadores de anticorpos de adesão à base de fluorescência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina). A aquisição e a análise dos dados são executadas usando o equipamento de laboratório geralmente disponível, incluindo um microscópio da epifluorescência e software livremente disponível de Fiji. Este procedimento é altamente versátil e pode ser modificado para uma variedade de linhas celulares, proteínas de ECM, ou nervos inibidores a fim examinar uma escala larga de perguntas biológicas.

Um esquema geral da set-up experimental
A Figura 1 representa o esquema geral para a adesão da célula e o protocolo de espalhamento começando com a inanição sérica de células REF52 e terminando com a análise computacional de imagens de fluorescência adquiridas. As etapas principais no protocolo são ilustradas na linha do tempo. Da nota, a etapa 2 do protocolo descreve a preparação dos COVERSLIP FN-revestidos, que devem ser executados simultaneamente com ...

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Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Este método permitirá aos pesquisadores quantificar a dinâmica inicial da adesão celular e a disseminação de células dependentes de ancoragem na fibronectina de proteínas da matriz extracelular durante o estresse oxidativo. Esta técnica é versátil e pode ser adaptada para examinar a dinâmica citoesquelletal sob uma ampla gama de condições. Além disso, a aquisição e análise de dados são realizadas utilizando equipamentos de laboratório comuns e softwares disponíveis livremente.Compreender os mecanismos de como as células se conectam e se espalham no ECM durante alterações no estado redox pode fornecer uma visão valiosa sobre estados normais e de doenças, como o câncer metastático. Este método pode ser usado para examinar a disseminação e a adesão celular em diferentes condições de cultura celular, linhas celulares dependentes de ancoragem e/oxidantes para responder a uma ampla gama de questões biológicas. Há inúmeros reagentes necessários para executar esta técnica.Portanto, é essencial que todas as soluções sejam feitas com antecedência antes do início. Em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-II, estabeleceu uma placa de 24 poços certificada pela cultura tecidual. Coloque uma tampa de vidro em cada poço.Rotule a placa de acordo com a figura 1B do protocolo de texto. Em seguida, pipeta 500 microliters da solução de fibronectina em cada poço. Pipeta a solução sobre cada tampalip algumas vezes para garantir um revestimento uniforme e submersão completa.Cubra a placa com a tampa. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, remova a placa da incubadora e aspire a solução de fibronectina dos poços.Lave os poços três vezes usando 500 microliters de 1X PBS por lavagem. Aspire a lavagem final de 1X PBS, e bloqueie poços com 500 microliters de uma solução BSA delipidada de 0,5% a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por um mínimo de 15 minutos. Primeiro, pré-aqueça as soluções necessárias em um banho de água a 37 graus Celsius.Em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-II, comece com uma monocamada confluente de células REF52 em um prato de 10 centímetros quadrados e lave as células duas vezes com seis mililitros de PBS 1X quente. O soro esflou as células por pelo menos uma hora em seis mililitros de solução BSA deslipidada quente. Em seguida, lave as células com seis mililitros de PBS 1X aquecidos.Aspire o PBS e adicione 1,5 mililitros de solução 0,5% de trypsin-EDTA. Incubar as células a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente dois minutos. Observe as células sob um microscópio leve para garantir que o destacamento esteja completo.Se as células ainda estiverem aderentes depois de tocar a placa na parte superior do banco, devolva-as à incubadora por mais dois minutos. Pipeta 1,5 mililitros de solução de neutralização de trippsina quente, TNS, para o prato para parar a experimentação e coletar células separadas. Pipeta a solução para cima e para baixo sobre a parte inferior da placa inúmeras vezes para remover todas as células aderentes restantes.Se as células parecerem desajeitadas, triturar ainda mais a suspensão da célula, estotinando suavemente para cima e para baixo sobre a parte de trás do prato. Em seguida, conte as células usando a exclusão azul trypan em um contador de células automatizada. Remova uma quantidade apropriada de células para criar uma suspensão celular com a densidade celular entre 10.000 e 30.000 células por mililitro em BSA delipidado em um tubo cônico de 15 mililitros.Use um rotor de ângulo fixo em uma centrífuga de mesa para centrifugar as células a 300 vezes g durante cinco minutos. Aspire o supernasal e suspenda a pelota de célula em sete mililitros de solução BSA deslipidada quente. Em seguida, divida uniformemente a suspensão celular em dois tubos cônicos de 15 mililitros, um para controle sozinho do veículo e outro para Ku55933.Usando um rotador de tubos, gire os tubos por 90 a 120 minutos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius. 30 minutos antes de emplacamento, adicione Ku55933 e DMSO a cada tubo a uma concentração final de 10 micromolar. Devolva a suspensão do celular ao rotador pelo tempo restante.Imediatamente antes de emplacar as células, recupere a placa da incubadora e aspire a solução BSA delipidada. Depois disso, remova 500 microliters da suspensão celular de cada grupo de tratamento e adicione cada um a um dos deslizamentos de cobertura revestidos de fibronectina na placa de 24 poços. Continue incubando a placa e a suspensão celular nas condições anteriores.Em seguida, permita que as células aderam ao deslizamento de cobertura pelo tempo desejado. Após o tempo desejado para adesão ter passado, aspire a solução celular de cada deslizamento de cobertura na placa. Distribua suavemente 500 microliters de solução de 3,7% de paraformaldeído em cada deslizamento de cobertura, pipetando pelos lados dos poços, e espere de 10 a 15 minutos.Em seguida, remova a solução de paraformaldeído e lave cada tampa duas vezes com 1X PBS usando 500 microliters de PBS por lavagem. Aspire o PBS e as células permeabilizadas em cada fenda com 500 microliters de 0,2%Triton X-100 e 1X PBS por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave cada tampa três vezes com 1X PBS usando 500 microliters de PBS por lavagem.Bloqueie as células em cada tampa com 500 microliters de tampão de bloqueio de imunofluorescência por 30 a 60 minutos. Diluir o anticorpo anti-paxillin primário no buffer de bloqueio em uma proporção de 1 a 250. Misture bem e adicione 200 microliters da solução de anticorpos a cada deslizamento de cobertura.Incubar em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Depois disso, aspire a solução de anticorpos e lave cada tampa com 500 microliters de 1X PBS por 10 minutos. Proteja as amostras da luz deste ponto em diante.Diluir a sonda F-actin de fhalloidina conjugada ao corante alexa 594 fluorescente vermelho e ao anticorpo secundário fluorescente de cabra 488 na mesma solução tampão de bloqueio. Misture bem e adicione 200 microliters da solução de anticorpos a cada tampa por 30 minutos. Aspire a solução de anticorpos e lave cada tampa com 500 microliters de 1X PBS por 10 minutos.Aspire o PBS e enxágue as tampas uma vez com 500 microliters de água deionizada. Em seguida, fixe os deslizamentos de cobertura em slides de microscópio usando meio de montagem anti-fade contendo DAPI. Após fixação e coloração com um anticorpo anti-paxillin, imagens fluorescentes de 8 bits em escala de cinza das células REF52 são adquiridas.Após a conclusão de todas as etapas de processamento de imagem, as aderências focais individuais devem ser proeminentes, em foco e facilmente distinguíveis umas das outras. Imagens de fluorescência em escala de cinza de células manchadas de sonda f-actin anti-paxillin e fhalloidina f-actin são então tiradas após serem banhadas em fibronectina. Aderências focais proeminentes e fibras de estresse devem ser facilmente visíveis nas células REF52 depois de serem autorizadas a aderir à fibronectina por 20 a 30 minutos.Babados enriquecidos com f-actina na borda principal das membranas celulares são indicados com uma seta. Imagens fluorescentes similares da sonda F-actin de fhalloidina e da coloração anti-paxillin são analisadas para a porcentagem de fibras de estresse na propagação celular. Notavelmente, o tratamento oxidante causa um aumento significativo na formação de fibras de estresse em todos os pontos de tempo de adesão examinados, e uma diminuição na propagação celular após 15 minutos de adesão celular à fibronectina.O revestimento em densidades celulares mais altas leva à aglomeração celular que proíbe que as células se espalhem completamente devido à superconfluência. Observe que as bordas das células são indistinguíveis das células adjacentes. Como resultado, a quantificação de células individuais é impedida e a circunferência disseminada não pode ser determinada com precisão.Uma linha celular separada de fibroblastos embrionários de camundongos são mantidos em suspensão e, em seguida, banhados em fibronectina por 30 minutos. As células foram então fixadas e manchadas com um anticorpo anti-paxillin. Note as células fora de foco.Além disso, a reatividade cruzada do anticorpo anti-paxillin com detritos celulares alterará o limiar durante a análise quantitativa da imagem e não deve ser incluída na análise. Durante o processamento da imagem, use a ferramenta de procuração em Fiji para examinar o histograma da imagem enquanto ajusta o brilho/contraste para evitar armadilhas relacionadas à saturação do sinal. Mudanças na adesão e disseminação podem influenciar a migração celular.Métodos para rastrear a migração de células únicas, a cicatrização de feridas ou os ensaios de invasão de quimiotaxis podem determinar se alterações na migração estão ocorrendo. GtPases da família Rho regulam a dinâmica de adesão celular através de sua ativação temporal espacial específica. Mudanças fenotípicas na adesão e disseminação durante o estresse oxidativo podem ser sugestivas de papéis regulatórios a jusante para essas proteínas.Este método requer o uso de linhas celulares BSL-II e reagentes químicos perigosos. Os pesquisadores necessitam de treinamento em segurança química e biológica, conforme determinado pelo escritório de saúde e segurança ambiental de sua instituição.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulando células vivas para construir estável montagem celular 3D sem andaime Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...