Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Författarna tackar DRS. Scott R. Hutton och Meghan S. Blackledge för den kritiska granskningen av manuskriptet. Detta arbete finansierades av High Point University ' s Research and sponsrade program (MCS) och bioteknikprogrammet vid North Carolina State University (MCS).

1. förberedelser
Anmärkning: det protokoll som beskrivs nedan har optimerats för användning med REF52 celler och ATM+/+ eller ATM-/- Human fibroblaster. Andra celltyper kan kräva ytterligare optimering som beskrivs i avsnitten anteckningar och felsökning nedan.
<ol><li>Gör 500 mL komplett cell odlingssubstrat för REF52 celler. Till 500 mL av hög glukosinnehållande Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) tillsätt 10% FBS, 2 mM L-glutamin, och 100 enheter/...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs här är ett mångsidigt och ekonomiskt sätt att snabbt skärmen ett antal förankrings beroende celltyper för dynamisk cytoskelettet remodeling under cell spridning. I synnerhet, denna metod undersöker kvantitativt stress fiber och fokal vidhäftnings bildning under oxidativ stress när cellerna följer FN (figur 1a). Dessutom kan dessa cellulära fenotyper föreslå en reglerande roll för medlemmar i Rho familj av små gtpases eftersom de har dokumenterade ro...

Cell-Matrix adhesioner (dvs. fokala sammanväxningar) är stora och dynamiska multimolekyl ära proteinkomplex som förmedlar cellernas vidhäftning och spridning. Dessa processer är avgörande för vävnads utveckling, underhåll, och fysiologiska funktion. Focal sammanväxningar består av membran-bundna receptorer, såsom integriner, samt byggnadsställningar proteiner som länkar cytoskeletala aktin till extracellulära matrix (ECM)1. Dessa komplex är kapabla att reagera på fysiokemiska ledtrådar som finns i den extracellulära miljön genom aktivering av olika signaltransduktionvägar. Som sådan, Focal sammanväxningar fungera som signalering centra för att propagera extracellulära mekaniska ledtrådar i ett antal cellulära processer inklusive riktad migration, Cellcykelreglering, differentiering, och överlevnad1,2. En grupp av signalmolekyler som reglerar och interagerar med fokala sammanväxningar inkluderar medlemmar i Rho-familjen av små GTPases. Rho GTPases är viktiga proteiner som reglerar cell migration och vidhäftnings dynamik genom deras specifika spatiotemporal aktivering3. Inte överraskande, dysreglering av Rho proteinfunktion har varit inblandad i ett antal mänskliga patologier såsom metastaser, angiogenes, och andra. Av särskilt intresse, cellulära redox status spelar en dominerande roll i modulering av cell migration och vidhäftning. Förändringar i redox homeostas, såsom ökningar av reaktiva syreradikaler (ros), har visat sig reglera Rho protein aktivitet, samt vidhäftning, i ett antal celltyper och mänskliga sjukdomar4,5,6 ,7,8. Till exempel, individer som lider av den neurologiska sjukdomen ataxi-telangiectasia (A-T), som orsakas av en mutation i DNA-skadan reparation serin/Threonine Kinas A-T-muterade (ATM), har en ökad risk för metastaserad cancer9, 10. Förlust av ATM Kinas aktivitet hos dessa patienter och cellinjer, antingen genom genetisk mutation eller kemisk hämning, resulterar i höga nivåer av oxidativ stress på grund av dysfunktion av pentofosfatvägen7,11, 12. Dessutom, nyare studier från laboratoriet har belyst en patofysiologisk roll för ROS i A-T genom att förändra cytoskelettets dynamik (dvs. adhesion och spridning) som en direkt följd av aktivering av Rho familjen GTPases in vitro-5. Islutändan kan dessa förändringar i cytoskeletala dynamik orsakade av Rho familj aktivering leda till den ökade risken för metastaserad cancer noteras i A-T patienter5,13. Därför, förstå samspelet mellan cell-matris interaktioner under oxidativ stress kan ge insikter i regleringen av adhesion och spridning. Dessa studier kan också sätta scenen för ytterligare utredningar av en möjlig roll för Rho-familjen GTPases i dessa signaleringsprocesser.
Beskrivs häri är ett protokoll för att studera den tidiga cellulära dynamiken i adhesion församling och sprider sig under oxidativ stress orsakad av hämning av ATM Kinas aktivitet. Denna analys är baserad på den väl karakteriserade mekanismen för Anchorage-beroende celler vidhäftning till ECM-proteinet Fibronektin (FN). När celler som upprätthålls i suspensionen är pläterade på FN, flera Rho gtpases samordna kontrollen av aktin cytoskeletala remodeling3,14. Morfologiska förändringar observeras som celler skiftar från runda och cirkulära utseende till tillplattad och expanderad. Samtidig med dessa observationer är utvecklingen av många Matrix sammanväxningar med ECM. Dessa förändringar tillskrivs bifasisk aktivering av RhoA med Rac1 under den första timmen som celler fäster och sprider 15,16.
En mängd olika metoder har utnyttjats för att undersöka vidhäftnings morfologi och dynamik samt cell spridning. Men dessa metoder förlitar sig på sofistikerade långsiktig, Live-avbildning totalt inre reflektion fluorescens (TIRF) eller konfokala mikroskopi system. Därför måste användarna ha tillgång till specialiserad utrustning och programvara. Dessutom gör den inställda tid som krävs av dessa bio-Imaging system fånga tidiga vidhäftnings händelser utmanande, särskilt när man testar flera inhibitorer eller behandlings villkor samtidigt.
Metoderna detaljerade, häri, ger ett enkelt, ekonomiskt, men ändå kvantitativt sätt att bedöma parametrar som styr vidhäftning församlingen och sprider in vitro-. Protokollet utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, såsom ett epifluorescensmikroskop och CCD-kamera. Denna analys innebär att tillämpa Anchorage-beroende celler till en FN-belagd yta efter en period av oxidativ stress orsakad av kemisk hämning av ATM Kinas aktivitet, som har visats tidigare5. Efter plätering, celler får fästa och fästa för specificerade längder av tid. Okopplade celler tvättas bort, medan bifogade celler är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikroppar mot markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin)2,5. Dessa proteiner visualiseras och registreras med hjälp av ett epifluorescensmikroskop. Efterföljande dataanalys utförs med hjälp av fritt tillgängliga Fiji programvara. Dessutom kan denna metod anpassas för att undersöka vidhäftnings dynamik under ett brett spektrum av förhållanden, inklusive olika ECM-proteiner, behandling med olika oxidanter/cell odlingsförhållanden eller en mängd olika förankrings beroende cellinjer för att ta itu med ett brett spektrum av biologiska frågor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

Vidhäftning och spridning av celler på den extracellulära matrisen (ECM) är viktiga cellulära processer under organismers utveckling och för homeostas av vuxna vävnader. Intressant, oxidativ stress kan förändra dessa processer, vilket bidrar till patofysiologin av sjukdomar som metastaserande cancer. Därför förstå mekanismen (er) av hur celler fäster och sprids på ECM under störningar i redox status kan ge insikt i normala och sjukdomstillstånd. Beskrivs nedan är ett stegvist protokoll som utnyttjar en immunofluorescensbaserad analys för att specifikt kvantifiera cellernas vidhäftning och spridning av förevigade fibroblastceller på Fibronektin (FN) in vitro-. Kortfattat, Anchorage-beroende celler hålls i suspension och utsätts för ATM kinashämmare Ku55933 att inducera oxidativ stress. Cellerna är sedan pläterade på FN-belagda ytan och får fästa för förutbestämda tidsperioder. Celler som förblir fästa är fasta och märkta med fluorescensbaserade antikropps markörer för vidhäftning (t. ex. paxillin) och spridning (t. ex., F-Actin). Data insamling och analys utförs med hjälp av allmänt tillgänglig laboratorieutrustning, inklusive ett epifluorescensmikroskop och fritt tillgänglig Fiji-programvara. Detta förfarande är mycket mångsidig och kan ändras för en mängd olika cellinjer, ECM proteiner, eller inhibitorer för att undersöka ett brett spektrum av biologiska frågor.

Ett allmänt schema för den experimentella uppsättningen
Figur 1 representerar det generella schemat för cellernas vidhäftning och spridnings protokoll som börjar med serum SVÄLT av REF52 celler och slutar med beräknings analys av förvärvade fluorescensbilder. Viktiga steg i protokollet illustreras i tidslinjen. Av anmärkning, steg 2 i protokollet beskriver beredningen av FN-belagda täckglas, som bör utföras samtidigt med steg 3: serum svältande REF52 ...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Denna metod är användbar för att kvantifiera den tidiga dynamiken i cellulär vidhäftning och spridning av förankrings beroende celler på fibronectin. Vidare, denna analys kan användas för att undersöka effekterna av förändrade redox homeostas på cell spridning och/eller cell adhesion-relaterade intracellulära signalering vägar.

Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att kvantifiera den tidiga dynamiken i cellulär vidhäftning och spridning av förankringsberoende celler på den extracellulära matrisen protein fibronectin under oxidativ stress. Denna teknik är mångsidig och kan anpassas för att undersöka cytoskeletal dynamik under ett brett spektrum av villkor. Vidare utförs datainhämtning och analys med hjälp av gemensam laboratorieutrustning och fritt tillgänglig programvara.Att förstå mekanismerna för hur celler fäster och sprids på ECM under förändringar i redox status kan ge värdefull insikt i normala och sjukdomstillstånd, såsom metastaserande cancer. Denna metod kan användas för att undersöka cellspridning och vidhäftning under olika cellodlingsförhållanden, förankringsberoende cellinjer, och/oxidanter för att besvara ett brett spektrum av biologiska frågor. Det finns många reagenser som krävs för att utföra denna teknik.Därför är det väsentligt att alla lösningar görs i förväg innan de börjar. I en BSL-II certifierad laminär flödeshuva anges en vävnad kultur-certifierad 24-brunnsplatta. Placera ett glas coverslip i varje brunn.Märk plattan enligt textprotokollets bild 1B. Därefter pipettera 500 mikroliter av fibronectinlösningen i varje brunn. Pipettera lösningen över varje coverslip några gånger för att säkerställa en jämn beläggning och fullständig nedsänkning.Täck plattan med locket. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i en timme. Ta sedan bort plattan från inkubatorn och aspirera fibronectinlösningen från brunnarna.Tvätta brunnarna tre gånger med hjälp av 500 mikroliter av 1X PBS per tvätt. Aspirera den sista tvätten av 1X PBS, och blockera brunnar med 500 mikroliter av en 0,5%delipidated BSA-lösning vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i minst 15 minuter. Först för varm de nödvändiga lösningarna i ett vattenbad vid 37 grader Celsius.I en BSL-II-certifierad laminär flödeshuva, börja med en konfluent monolayer av REF52-celler i en 10-kvadratcentimeters skål och tvätta cellerna två gånger med sex milliliter varm 1X PBS. Serum svälta cellerna i minst en timme i sex milliliter varm delipiderad BSA-lösning. Därefter tvättar du cellerna med sex milliliter uppvärmd 1X PBS.Aspirera PBS och tillsätt 1,5 milliliter varm 0,5%trypsin-EDTA lösning. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%koldioxid i cirka två minuter. Observera cellerna under ett ljusmikroskop för att säkerställa att lossläggningen är fullständig.Om cellerna fortfarande är vidhäftande efter att ha knackat på plattan på bänkskivan, returnera dem till inkubatorn i ytterligare två minuter. Pipett 1,5 milliliter varm trypsin neutraliserande lösning, TNS, till skålen för att stoppa trypsinization och samla loss celler. Pipettera lösningen upp och ner över botten av plattan flera gånger för att ta bort alla de återstående anhängare celler.Om cellerna verkar klumpiga, ytterligare triturate cellen suspensionen genom att försiktigt pipettering upp och ner över baksidan av skålen. Därefter räknar du cellerna med trypan blå uteslutning i en automatiserad cellräknare. Avlägsna en lämplig mängd celler för att skapa en cellupphängning med celltätheten mellan 10, 000 och 30, 000 celler per milliliter i delipiderad BSA i ett koniskt rör på 15 milliliter.Använd en rotor med fast vinkel i en bordsskiva centrifug för att centrifugera cellerna vid 300 gånger g i fem minuter. Aspirera supernatanten och återuppstäng cellpelletsen i sju milliliter varm delipiderad BSA-lösning. Sedan jämnt dela cellupphängningen i två 15-milliliter koniska rör, en för fordons-ensam kontroll, och en för Ku55933.Med hjälp av ett rör rotator, rotera rören i 90 till 120 minuter i en cellkultur inkubator vid 37 grader Celsius. 30 minuter före bordläggning, tillsätt Ku55933 och DMSO till varje rör till en slutlig koncentration av 10 mikromolar. Returnera cellupphängningen till rotatorn under den återstående tiden.Omedelbart före plätering av cellerna, hämta plattan från inkubatorn och aspirera den delipiderade BSA-lösningen. Efter detta, ta bort 500 mikroliter av cellen suspension från varje behandlingsgrupp och lägga var och en till en av de fibronectin-belagda täck glider i 24-brunnsplattan. Fortsätt inkubera plattan och cellupphängningen vid de tidigare förhållandena.Låt sedan cellerna att hålla sig till täcket för önskad tidslängd. Efter den önskade tiden för vidhäftning har passerat, aspirera celllösningen från varje täckplatta. Dispensera försiktigt 500 mikroliter av 3,7%paraformaldehyd lösning på varje täckblad genom pipettering ner sidorna av brunnarna, och vänta 10 till 15 minuter.Därefter tar du bort paraformaldehydlösningen och tvättar varje täckblad två gånger med 1X PBS med hjälp av 500 mikroliter PBS per tvätt. Aspirera PBS och permeabiliserade celler på varje täckkolla med 500 mikroliter på 0,2%Triton X-100 och 1X PBS i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan varje täckplatta tre gånger med 1X PBS med hjälp av 500 mikroliter PBS per tvätt.Blockera cellerna på varje täckkol med 500 mikroliter av immunofluorescensblockeringsbuffert i 30 till 60 minuter. Späd den primära anti-paxillinantikroppen i blockeringsbufferten vid ett förhållande av ett-till-250. Blanda väl och tillsätt 200 mikroliter av antikroppslösningen till varje täckplatta.Inkubera i rumstemperatur i minst en timme. Efter detta aspirera antikroppslösningen och tvätta varje täckslip med 500 mikroliter på 1X PBS i 10 minuter. Skydda proverna från ljus från denna punkt framåt.Späd phalloidin F-aktin-sonden konjugerat till det röda fluorescerande färgämnet Alexa 594 och geten antimus 488 fluorescerande sekundär antikropp i samma blockerande buffertlösning. Blanda väl och tillsätt 200 mikroliter av antikroppslösningen till varje täckplatta i 30 minuter. Aspirera antikroppslösningen och tvätta varje täckskydd med 500 mikroliter på 1X PBS i 10 minuter.Aspirera PBS och skölj locket glider en gång med 500 mikroliter av avjoniserat vatten. Fixera sedan täckslilen på mikroskopglas med anti-fade monteringsmedium som innehåller DAPI. Efter fixering och färgning med en anti-paxillin antikropp förvärvas fluorescerande 8-bitars gråskalebilder av REF52-cellerna.Efter avslutad alla bildbehandling steg, bör enskilda fokal sammanväxningar vara framträdande, i fokus, och lätt skiljas från varandra. Gråskala fluorescens bilder av anti-paxillin och phalloidin F-aktin sond färgade celler sedan tas efter att ha plated på fibronectin. Framstående fokal sammanväxningar och stress fibrer bör vara lätt synlig i REF52 celler efter att ha fått hålla på fibronectin i 20 till 30 minuter.F-aktinberikade volanger i framkanten av cellmembranen är indicerade med en pil. Liknande fluorescerande bilder av phalloidin F-aktinsond och anti-paxillin färgning analyseras för andelen stress fibrer i cell spridning. Noterbart, oxidant behandling orsakar en betydande ökning av stress fiberbildning vid alla vidhäftning tidpunkter undersökts, och en minskning av cell spridning efter 15 minuter av celladhesion till fibronectin.Plätering vid högre celltäthet leder till cellulär trängsel som förbjuder celler från att fullt ut sprida sig på grund av överkonfluensi. Lägg märke till att cellkanterna är omöjliga att skilja från intilliggande celler. Som ett resultat, är kvantifiering av enskilda celler utesluten och sprida omkrets kan inte exakt fastställas.En separat cellinje av mus embryonala fibroblaster hålls i suspension och sedan pläteras på fibronectin i 30 minuter. Celler var sedan fast och färgas med en anti-paxillin antikropp. Observera cellerna utanför fokus.Vidare kommer anti-paxillinantikroppens korsreaktivitet med cellulärt skräp att förändra tröskelvärdet under kvantitativ bildanalys och bör inte ingå i analysen. Under bildbehandling, använd look-up verktyget i Fiji för att undersöka bilden histogram medan justera ljusstyrka / kontrast för att undvika fallgropar relaterade till signalmättnad. Förändringar i vidhäftning och spridning kan påverka cellmigrationen.Metoder för att spåra encellsmigrering, sårläkning eller chemotaxis invasionsanalyser kan avgöra om förändringar i migrationen sker. Rho familj GTPases reglera cell adhesion dynamik genom deras specifika rumsliga tidsmässiga aktivering. Fenotypiska förändringar i vidhäftning och spridning under oxidativ stress kan vara suggestiva av nedströms reglerande roller för dessa proteiner.Denna metod kräver användning av BSL-II-cellinjer och farliga kemiska reagenser. Forskare kräver kemisk och biologisk säkerhetsutbildning enligt institutionens miljökontor för hälsa och säkerhet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Utvärdering av effekten av Protein Aggregation på cellulära oxidativ Stress i jäst

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Manipulera levande celler att bygga stabila 3D cellulära montering utan konstgjorda byggnadsställning

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...