Name: examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress
Uploaded: 2019-10-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Yazarlar dr Scott R. Hutton ve Meghan S. Blackledge el yazması eleştirel inceleme için teşekkür ederiz. Bu çalışma High Point Üniversitesi Araştırma ve Sponsor programları (MCS) ve North Carolina State University (MCS) Biyoteknoloji Programı tarafından finanse edilmiştir.

1. Hazırlıklar
NOT: Aşağıda açıklanan protokol REF52 hücreleri ve ATM+/+ veya ATM-/- insan fibroblastları ile kullanım için optimize edilmiştir. Diğer hücre türleri, aşağıdaki notlar ve sorun giderme bölümlerinde açıklandığı gibi daha fazla optimizasyon gerektirebilir.
<ol><li>REF52 hücreleri için 500 mL tam hücre kültürü ortamı yapın. 500 mL yüksek glikoz dulbecco modifiye Eagle's orta içeren (DMEM) eklemek 10% FBS, 2 mM L-glutamin, v...

<ol>
	<li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix--cytoskeleton+crosstalk.">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix--cytoskeleton crosstalk.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 2 (11), 793-805 (2001).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), (2011).</li><li>Lawson, C. D., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+on-off+relationship+of+Rho+and+Rac+during+integrin-mediated+adhesion+and+cell+migration.">The on-off relationship of Rho and Rac during integrin-mediated adhesion and cell migration.</a> Small GTPases. 5, e27958 (2014).</li><li>Heo, J., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+redox-mediated+guanine+nucleotide+exchange+on+redox-active+Rho+GTPases.">Mechanism of redox-mediated guanine nucleotide exchange on redox-active Rho GTPases.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31003-31010 (2005).</li><li>Tolbert, C. E., Beck, M. V., Kilmer, C. E., Srougi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+ATM+positively+regulates+Rac1+activity+and+cellular+migration+through+oxidative+stress.">Loss of ATM positively regulates Rac1 activity and cellular migration through oxidative stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (4), 1155-1161 (2019).</li><li>Hobbs, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+Rac1+by+thiol+oxidation.">Redox regulation of Rac1 by thiol oxidation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 237-250 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+redox+sensing+by+the+kinase+ATM+maintains+cellular+antioxidant+capacity.">Mitochondrial redox sensing by the kinase ATM maintains cellular antioxidant capacity.</a> Science Signaling. 11 (538), (2018).</li><li>Hobbs, G. A., Zhou, B., Cox, A. D., Campbell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases,+oxidation,+and+cell+redox+control.">Rho GTPases, oxidation, and cell redox control.</a> Small GTPases. 5, e28579 (2014).</li><li>Shiloh, Y., Ziv, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATM+protein+kinase:+regulating+the+cellular+response+to+genotoxic+stress,+and+more.">The ATM protein kinase: regulating the cellular response to genotoxic stress, and more.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 14 (4), 197-210 (2013).</li><li>Lang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM-Mediated+Phosphorylation+of+Cortactin+Involved+in+Actin+Polymerization+Promotes+Breast+Cancer+Cells+Migration+and+Invasion.">ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (6), 2972-2988 (2018).</li><li>Peter, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cu/Zn-SOD+exacerbates+radiation+sensitivity+and+hematopoietic+abnormalities+of+Atm-deficient+mice.">Elevated Cu/Zn-SOD exacerbates radiation sensitivity and hematopoietic abnormalities of Atm-deficient mice.</a> European Molecular Biology Organization Journal. 20 (7), 1538-1546 (2001).</li><li>Takao, N., Li, Y., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+roles+for+ATM+in+cellular+response+to+oxidative+stress.">Protective roles for ATM in cellular response to oxidative stress.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 472 (1), 133-136 (2000).</li><li>Jansen, S., Gosens, R., Wieland, T., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+Rho+in+cancer+metastasis:+Rho+GTPases+and+beyond.">Paving the Rho in cancer metastasis: Rho GTPases and beyond.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 183, 1-21 (2018).</li><li>Berrier, A. L., Martinez, R., Bokoch, G. M., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrin+beta+tail+is+required+and+sufficient+to+regulate+adhesion+signaling+to+Rac1.">The integrin beta tail is required and sufficient to regulate adhesion signaling to Rac1.</a> Journal of Cell Science. 115 (Pt 22), 4285-4291 (2002).</li><li>Arthur, W. T., Petch, L. A., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+engagement+suppresses+RhoA+activity+via+a+c-Src-dependent+mechanism.">Integrin engagement suppresses RhoA activity via a c-Src-dependent mechanism.</a> Current Biology. 10 (12), 719-722 (2000).</li><li>Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+inactivation+by+p190RhoGAP+regulates+cell+spreading+and+migration+by+promoting+membrane+protrusion+and+polarity.">RhoA inactivation by p190RhoGAP regulates cell spreading and migration by promoting membrane protrusion and polarity.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2711-2720 (2001).</li><li>Chandra, S., Kalaivani, R., Kumar, M., Srinivasan, N., Sarkar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sendai+virus+recruits+cellular+villin+to+remodel+actin+cytoskeleton+during+fusion+with+hepatocytes.">Sendai virus recruits cellular villin to remodel actin cytoskeleton during fusion with hepatocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3801-3814 (2017).</li><li>Fitzpatrick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measuring Cell Fluorescence Using ImageJ. , (2014).</li><li>Berginski, M. E., Vitriol, E. A., Hahn, K. M., Gomez, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantification+of+focal+adhesion+spatiotemporal+dynamics+in+living+cells.">High-resolution quantification of focal adhesion spatiotemporal dynamics in living cells.</a> PLoS One. 6 (7), e22025 (2011).</li><li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions.">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li><li>Elosegui-Artola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+for+the+quantitative+comparison+of+stress+fibers+and+focal+adhesions.">Image analysis for the quantitative comparison of stress fibers and focal adhesions.</a> PLoS One. 9 (9), e107393 (2014).</li><li>Meller, J., Vidali, L., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RhoG+is+dispensable+for+integrin-mediated+cell+spreading+but+contributes+to+Rac-independent+migration.">Endogenous RhoG is dispensable for integrin-mediated cell spreading but contributes to Rac-independent migration.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 12), 1981-1989 (2008).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Staining.">Immunofluorescence Staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (43), 1-7 (2015).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics.">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction:+Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Correction: Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 214 (2), 231 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+tension+sensor+reveals+novel+features+of+focal+adhesion+force+transmission+and+mechanosensitivity.">Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity.</a> Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).</li><li>Friedrichs, J., Helenius, J., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cellular+adhesion+to+extracellular+matrix+components+by+single-cell+force+spectroscopy.">Quantifying cellular adhesion to extracellular matrix components by single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 5 (7), 1353-1361 (2010).</li><li>Brown, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+mild+trypsinization+conditions+in+the+detachment+of+endothelial+cells+to+promote+subsequent+endothelialization+on+synthetic+surfaces.">The use of mild trypsinization conditions in the detachment of endothelial cells to promote subsequent endothelialization on synthetic surfaces.</a> Biomaterials. 28 (27), 3928-3935 (2007).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, hücre yayılımı sırasında dinamik sitoiskelet remodeling için anakağa bağlı hücre türlerini hızla taramak için çok yönlü ve ekonomik bir yoldur. Özellikle bu yöntem, hücreler FN'ye yapıştığında oksidatif stres sırasında stres lifi ve fokal yapışma oluşumunu nicel olarak inceler (Şekil 1A). Ayrıca, bu hücresel fenotipler onlar hücre eki sırasında rolleri belgelenmiş ve15,16,</...

Hücre-matriks yapışıklıkları (yani fokal yapışıklıklar) hücre yapışıklığı ve yayılmasına aracılık eden büyük ve dinamik multimoleküler protein kompleksleridir. Bu süreçler doku gelişimi, bakımı ve fizyolojik fonksiyonu için çok önemlidir. Fokal yapışıklıklar integrinler gibi membrana bağlı reseptörlerin yanı sıra sitoskeletal aktini hücre dışı matrikse (ECM)1'ebağlayan iskele proteinlerinden oluşur. Bu kompleksler çeşitli sinyal iletim yollarının aktivasyonu yoluyla hücre dışı ortamda mevcut fizyokimyasal ipuçlarına yanıt verme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, odak yapışıklıkları yönlendirilmiş göç, hücre döngüsü düzenleme, farklılaşma ve sağkalım1dahil olmak üzere hücresel süreçlerin bir dizi içine hücre dışı mekanik ipuçları yaymak için sinyal merkezleri olarak hizmet vermektedir ,2. Odak yapışıklıklarını düzenleyen ve onlarla etkileşime girerek sinyal moleküllerinin bir grup küçük GTPases Rho ailesinin üyeleri içerir. Rho GTPases kendi özel spatiotemporal aktivasyon yoluyla hücre göçü ve yapışma dinamikleri düzenleyen anahtar proteinler3. Beklendiği gibi, Rho protein fonksiyonunun disregülasyonu metastaz, anjiyogenez ve diğerleri gibi insan patolojileri bir dizi karıştığı olmuştur. Özellikle ilgi, hücresel redoks durumu hücre göçü ve yapışma modülasyonu nda baskın bir rol oynar. Reaktif oksijen türlerindeki artışlar (ROS) gibi redoks homeostazındaki değişiklikler, bir dizi hücre tipinde ve insan hastalıklarında Rho protein aktivitesini ve adezyonu düzenleyen gösterilmiştir4,5,6 ,7,8. Örneğin, dna hasar onarım serine / threonin kizaz A-T-mutasyona uğramış bir mutasyon neden olduğu nörolojik bozukluk ataksi-telanjiektazi (A-T), muzdarip bireyler, metastatik kanser riski var9, 10. Bu hastalarda ve hücre hatlarında ATM kiazaz aktivitesinin kaybı, genetik mutasyon veya kimyasal inhibisyon yoluyla, pentoz fosfat yolunun disfonksiyonu nedeniyle oksidatif stres yüksek düzeyde sonuçları7,11, 12. Yıl. Ayrıca, laboratuvardan yapılan son çalışmalar, Rho ailesi GTPases in vitro5'inaktive edilmesinin doğrudan bir sonucu olarak sitoskeletal dinamikleri (yani yapışma ve yayılma) değiştirerek A-T'de ROS için patofizyolojik bir rolvurgulamıştır. Sonuçta, Rho aile aktivasyonu neden sitoskelet dinamikleri bu değişiklikler A-T hastalarında belirtilen metastatik kanser riskinin artmasına yol açabilir5,13. Bu nedenle, oksidatif stres sırasında hücre-matris etkileşimleri arasındaki etkileşimi anlamak yapışma ve yayılma nın düzenlenmesi hakkında öngörüler sağlayabilir. Bu çalışmalar aynı zamanda rho ailesi GTPases için bu sinyal süreçlerinde olası bir rol içine daha fazla araştırma için zemin hazırlayabilir.
Burada açıklanan adezyon montaj erken hücresel dinamikleri incelemek için bir protokol ve ATM kinaaz aktivitesiin inhibisyonu nedeniyle oksidatif stres sırasında yayılan. Bu test, ECM proteini fibronektin (FN) ankraja bağlı hücrelerin iyi karakterize mekanizmasına dayanmaktadır. Süspansiyon tutulan hücreler FN üzerine kaplanmış olduğunda, birkaç Rho GTPases aktin sitoskelet aliyi kontrol koordine3,14. Hücrelerin yuvarlak ve dairesel görünümden düzleştirilmiş ve genişlemiş olması yla morfolojik değişiklikler gözlenir. Bu gözlemler ile birlikte ECM ile çok sayıda matris yapışıklıkların geliştirilmesidir. Bu değişiklikler, hücreler yapışır ve yayıldı gibi ilk saat boyunca Rac1 ile RhoA biphasik aktivasyonu atfedilir 15,16.
Adezyon morfolojisi ve dinamiğinin yanı sıra hücre yayılımını incelemek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ancak, bu yöntemler sofistike uzun vadeli, canlı görüntüleme toplam iç yansıma floresans (TIRF) veya konfokal mikroskopi sistemlerine dayanır. Bu nedenle, kullanıcıların özel ekipman ve yazılımerişimi olmalıdır. Ayrıca, bu biyo-görüntüleme sistemlerinin gerektirdiği kurulum süresi, özellikle birden fazla inhibitörü veya tedavi koşullarını aynı anda test ederken erken yapışma olaylarını yakalamayı zorlaştırmaktadır.
Burada ayrıntılı olarak kullanılan yöntemler, yapışma montajını yöneten ve in vitro olarak yayılan parametreleri değerlendirmek için basit, ekonomik, ancak nicel bir yol sağlar. Protokol, epifloresan mikroskobu ve CCD kamera gibi yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu titre, daha önce 5 kez gösterilmiştir ATM kiazaz aktivitesikimyasal inhibisyonu nedeniyle oksidatif stres bir süre sonra bir FN kaplı yüzeye ankraj bağımlı hücrelerin uygulanması içerir. Kaplamayı takiben, hücrelerin belirli süreler boyunca takmasına ve yapışmasına izin verilir. Eklenmemiş hücreler yıkanırken, bağlı hücreler sabitlenir ve yapışma belirteçlerine (örneğin, paxillin) ve yayılma (örneğin, F-aktin)2,5floresan bazlı antikorlarla etiketlenir. Bu proteinler daha sonra görselleştirilir ve epifloresan mikroskobu kullanılarak kaydedilir. Sonraki veri analizi serbestçe kullanılabilir Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Ayrıca, bu yöntem farklı ECM proteinleri, çeşitli oksidanlar/hücre kültürü koşulları veya çeşitli ankraja bağlı hücre hatları ile tedavi dahil olmak üzere çok çeşitli koşullar altında yapışma dinamiklerini incelemek için uyarlanabilir. biyolojik sorular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm2 dishes</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229620</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-5</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture treated plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#176;C refrigerator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165)</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610620</td>
			<td>marker of focal adhesions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Argos</td>
			<td>EV310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Nuair</td>
			<td>NU-477-400</td>
			<td>Class II, Type A, series 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td>dlBSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>organic solvent to dissolve Ku55933</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Media, High Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>REF52 base cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>certified, cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>http://fiji.sc/</td>
			<td>image analysis program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6900-2502</td>
			<td>0.2 &#181;M, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips (12-Cir-1.5)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td>autoclave in foil to sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>fluorescent secondary antibody, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td>component of blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>FN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Fluorescence Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ku55933</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1109-25MG</td>
			<td>ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>cell culture medium supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochrome CMOS 16 bit camera</td>
			<td>Optimos</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>PFA, fixative for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>P/S, antibiotic solution for culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>marker of F-actin, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36941</td>
			<td>cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REF52 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate with heat control</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>PC-420D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309653</td>
			<td>60 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator</td>
			<td>Nuair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent used to permeabilize cell membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution (1x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>R-002-100</td>
			<td>TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining the dynamics of cellular adhesion and spreading of epithelial cells on fibronectin during oxidative stress

Hücrelerin hücre dışı matrikse (ECM) yapışması ve yayılması, organizma gelişimi ve erişkin dokuların homeostazisi sırasında ki temel hücresel süreçlerdir. İlginçtir, oksidatif stres bu süreçleri değiştirebilir, böylece metastatik kanser gibi hastalıkların patofizyolojisine katkıda. Bu nedenle, redoks durumundaki tedirginlikler sırasında hücrelerin ECM'ye nasıl bağlanıp yayıldığı mekanizmasını anlamak normal ve hastalık durumlarına ışık verebilir. Aşağıda açıklanan bir immünofloresan tabanlı test özellikle hücre adezyonu ölçmek ve fibronektin üzerinde ölümsüzleştirilmiş fibroblast hücrelerinin yayılmasını kullanan bir adım-bilge protokoldür (FN) in vitro. Kısaca, ankraja bağımlı hücreler süspansiyon da tutulur ve oksidatif strese neden olmak için ATM kinaaz inhibitörü Ku55933 maruz kalır. Hücreler daha sonra FN kaplı yüzeye kaplanır ve önceden belirlenmiş süreler için bağlanmasına izin verilir. Bağlı kalan hücreler sabit ve yapışma esaslı antikor belirteçleri ile etiketlenir (örneğin, paxillin) ve yayılan (örneğin, F-aktin). Veri toplama ve analiz, epifloresan mikroskobu ve serbestçe kullanılabilen Fiji yazılımı da dahil olmak üzere yaygın olarak bulunan laboratuvar ekipmanları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu prosedür çok yönlüdür ve çok çeşitli biyolojik soruları incelemek için çeşitli hücre hatları, ECM proteinleri veya inhibitörleri için değiştirilebilir.

Deneysel kurulumun genel bir şeması
Şekil 1, REF52 hücrelerinin serum açlığı ile başlayan ve edinsel floresan görüntülerin inhesaplamalı analizi ile biten hücre yapışması ve yayma protokolü için genel şemaları temsil eder. Protokoldeki önemli adımlar zaman çizelgesinde gösterilmiştir. Not, protokolün adım 2 FN kaplı kapakların hazırlanması açıklar, hangi adım 3 ile eş zamanlı olarak yapılmalıdır: serum açlıktan REF52 hücrel...

Watch this Scientific Journal Video about Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress at JoVE.com

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Bu yöntem, araştırmacıların oksidatif stres sırasında hücreli adezyon ve ankraja bağımlı hücrelerin ekstrasellüler matriks proteini fibronektin üzerine yayılmasının erken dinamiklerini ölçmelerini sağlayacaktır. Bu teknik çok yönlüdür ve sitoskelet dinamiklerini çok çeşitli koşullar altında incelemek için uyarlanabilir. Ayrıca, veri toplama ve analiz ortak laboratuvar ekipmanları ve serbest çesitli yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir.Redoks durumundaki değişiklikler sırasında hücrelerin ECM'ye nasıl bağlanıp yayıldığına ilişkin mekanizmaların anlaşılması, metastatik kanser gibi normal ve hastalık durumlarına dair değerli bilgiler sağlayabilir. Bu yöntem, hücre yayılma ve yapışmafarklı hücre kültürü koşulları altında incelemek için kullanılabilir, ankraj bağımlı hücre hatları, ve / oksidanlar biyolojik soruların geniş bir yelpazede cevaplamak için. Bu tekniği gerçekleştirmek için gerekli çok sayıda reaktif vardır.Bu nedenle, tüm çözümler başlamadan önce önceden yapılır esastır. Bir BSL-II sertifikalı laminar akış başlık bir doku kültürü sertifikalı 24-well plaka ortaya çıkardı. Her kuyuya bir cam kapak yerleştirin.Plakayı metin protokolünün şekil 1B'sine göre etiketleyin. Sonra, pipet 500 mikrolitre fibronektin çözeltisi her kuyuya. Pipet, eşit bir kaplama ve tam bir daldırma sağlamak için her coverslip üzerinde çözelti birkaç kez.Tabağı kapakla kapatın. Plakayı 37 derecede bir saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Daha sonra tabağı kuvözden çıkarın ve fibronektin çözeltisini kuyulardan aspire edin.Kuyuları yıkama başına 500 mikrolitre 1X PBS kullanarak üç kez yıkayın. 1X PBS'nin son yıkamasını aspire edin ve %0,5'lik delipidated BSA çözeltisinin 500 mikrolitresini 37 santigrat derecede ve en az %5 karbondioksitle 15 dakika boyunca bloke edin. İlk olarak, 37 santigrat derecede bir su banyosunda gerekli çözümleri önceden ısıtın.BSL-II sertifikalı laminar akış kaputunda, 10 santimetre karelik bir kapta REF52 hücrelerinin bir parçası olan bir monotabakası ile başlayın ve hücreleri altı mililitre sıcak 1X PBS ile iki kez yıkayın. Serum, altı mililitre sıcak delipidated BSA çözeltisinde hücreleri en az bir saat aç eder. Daha sonra, altı mililitre ısıtılmış 1X PBS ile hücreleri yıkayın.PBS aspire ve sıcak 1.5 mililitre ekleyin 0.5%tripsin-EDTA çözeltisi. Hücreleri 37 derecede yaklaşık iki dakika boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Müfreze tamamlandığından emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.Hücreler tezgahın üstündeki tabağa dokunduktan sonra hala yapışıksa, iki dakika daha kuvöze geri verin. Pipet 1.5 mililitre sıcak tripsin nötralize çözeltisi, TNS, tripsinizasyon durdurmak ve müstakil hücreleri toplamak için çanak için. Pipet solüsyon yukarı ve aşağı plaka nın alt üzerinde birçok kez kalan yapışık hücrelerin tüm kaldırmak için.Hücreler kümeli görünürse, yavaşça çanak arka üzerinde yukarı ve aşağı boru lama tarafından hücre süspansiyon üçe triturate. Ardından, otomatik bir hücre sayacında trypan mavisi hariç tutma kullanarak hücreleri sayın. 15 mililitrelik konik tüpte delipidate BSA mililitre başına 10, 000 ve 30, 000 hücre yoğunluğu ile bir hücre süspansiyon oluşturmak için hücrelerin uygun miktarda çıkarın.Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj etmek için masa üstü santrifüjünde sabit açılı bir rotor kullanın. Supernatant aspire ve sıcak delipidated BSA çözeltisi yedi mililitre hücre pelet yeniden askıya. Sonra eşit iki 15 mililitrelik konik tüpler, araç tek başına kontrol için bir ve Ku55933 için bir hücre süspansiyon bölün.Bir tüp rotator kullanarak, 37 santigrat derece bir hücre kültürü kuluçka tüpleri 90 ila 120 dakika tüpler döndürün. Kaplamadan 30 dakika önce, her tüpe 10 mikromolar son konsantrasyonuna Ku55933 ve DMSO ekleyin. Kalan süre boyunca hücre süspansiyonuna rotator'a geri dönün.Hücreleri kaplamadan hemen önce, tabağı kuvözden alın ve delipidate BSA çözeltisine aspire edin. Bundan sonra, her tedavi grubundan hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini çıkarın ve her birini 24 kuyudaki fibronektin kaplı kapak fişlerine ekleyin. Önceki koşullarda plakayı ve hücre süspansiyonuna kuluçkaya yatın.Daha sonra hücrelerin istenilen süre boyunca kapak kaymasına yapışmasını bekleyin. Yapışma için istenilen süre geçtikten sonra, plakadaki her kapak kaymasından hücre çözeltisini aspire edin. Kuyuların kenarlarını borulayarak her coverslip üzerine %3,7 paraformaldehit çözeltisi 500 mikrolitre verin ve 10 ila 15 dakika bekleyin.Daha sonra, paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve her coverslip'i yıkama başına 500 mikrolitre PBS kullanarak 1X PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca %0,2 Triton X-100 ve 1X PBS olmak üzere 500 mikrolitre ile her örtüdeki PBS ve permeabilize hücreleri aspire edin. Daha sonra her coverslip'i yıkama başına 500 mikrolitre PBS kullanarak 1X PBS ile üç kez yıkayın.Her kapaktaki hücreleri 500 mikrolitre immünoresans bloke edici tampon ile 30 ila 60 dakika boyunca bloke edin. Bir-250 oranında bloke tampon birincil anti-paxillin antikor seyreltin. İyice karıştırın ve her coverslip antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin.En az bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra antikor çözeltisini aspire edin ve her coverslip'i 10 dakika boyunca 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın. Örnekleri ışıktan bu noktadan koruyun.Aynı engelleme tampon çözeltisi kırmızı floresan Alexa 594 boya ve keçi anti-fare 488 floresan ikincil antikor konjuge phalloidin F-actin probu seyreltin. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca her coverslip antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Antikor çözeltisini aspire edin ve her coverslip'i 10 dakika boyunca 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın.PBS aspire ve deiyonize su 500 mikrolitre ile bir kez kapak fişleri durulayın. Daha sonra kapak kaymalarını DAPI içeren anti-fade montaj ortamını kullanarak mikroskop slaytlarına sabitle. Bir anti-paxillin antikor ile fiksasyon ve boyama sonra, REF52 hücrelerinin floresan 8-bit gri tonlama görüntüleri elde edilir.Tüm görüntü işleme adımlarının tamamlanmasından sonra, tek tek odak yapışıklığı belirgin, odakta ve birbirinden kolayca ayırt edilebilir olmalıdır. Anti-paxillin ve phalloidin F-aktin boyalı hücrelerin gri tonlama floresan görüntüleri daha sonra fibronektin üzerine kaplandıktan sonra alınır. Belirgin fokal yapışıklıklar ve stres lifleri 20-30 dakika fibronektin yapışmasına izin verildikten sonra REF52 hücrelerinde kolayca görülmelidir.Hücre zarlarının ön kenarında f-aktin zenginleştirilmiş fırfırlar bir ok ile gösterilir. Phalloidin F-aktin probu ve anti-paxillin boyama benzer floresan görüntüleri hücre yayılımı stres liflerinin yüzdesi için analiz edilir. Özellikle oksidan tedavi, incelenen tüm yapışma zaman noktalarında stres lifi oluşumunda önemli bir artışa ve fibronektin'e 15 dakikalık hücre adezyonu sonrasında hücre yayılımında azalmaya neden olur.Yüksek hücre yoğunluklarında kaplama, hücrelerin aşırı çakışma nedeniyle tam olarak yayılmasını yasaklayan hücresel kalabalığa yol açar. Hücre kenarlarının bitişik hücrelerden ayırt edilemez olduğuna dikkat edin. Sonuç olarak, tek tek hücrelerin sayısallaştırılması engellenir ve yayılan çevre doğru olarak belirlenemez.Fare embriyonik fibroblastlar ayrı bir hücre hattı süspansiyon tutulur ve daha sonra fibronectin üzerinde 30 dakika kaplama. Hücreler daha sonra sabit ve bir anti-paxillin antikor ile lekeli edildi. Odak dışı hücrelere dikkat edin.Ayrıca, anti-paxillin antikor hücresel enkaz ile çapraz reaktivitesi kantitatif görüntü analizi sırasında eşik değişecek ve analizdahil edilmemelidir. Görüntü işleme sırasında, sinyal doygunluğuyla ilgili tuzakları önlemek için parlaklığı/kontrastı ayarlarken görüntü histogramını incelemek için Fiji'deki arama aracını kullanın. Yapışma ve yayılmadaki değişiklikler hücre geçişini etkileyebilir.Tek hücre göçlerini, yara iyileşmesini veya kemotaksit invazyonunu izleme yöntemleri göçte değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Rho ailesi GTPases, hücre yapışma dinamiklerini spesifik mekansal zamansal aktivasyonları ile düzenler. Oksidatif stres sırasında yapveyon ve yayılmada fenotik değişiklikler bu proteinler için aşağı düzenleyici rolleri düşündürebilir.Bu yöntem BSL-II hücre hatları nın ve tehlikeli kimyasal reaktiflerin kullanılmasını gerektirir. Araştırmacılar, kurumlarının çevre sağlığı ve güvenliği ofisi tarafından belirlenen kimyasal ve biyolojik güvenlik eğitimine ihtiyaç duyarlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...