Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

ونحن نعترف بامتنان الدكتور روبن بيترز (جامعه ولاية أيوا ، الولايات الامريكيه) لتوفير الإنشاءات pIRS و pGGxZmAN2. الدعم المالي لهذا العمل من قبل برنامج التفاعلات النباتية الحيوية NSF (منحه # 1758976 إلى P.Z.) ، والكيان التشغيلي القديم برنامج البحوث المهنية (منحه # DE-SC0019178 إلى P.Z.) ، ومعهد الجينوم المشترك للمعهد برنامج العلوم المجتمعية (منحه # CSP2568 إلى P.Z.) ، NSF برنامج زمالات البحوث العليا (إلى K.M.M.) ، وزمالة جامعه كاليفورنيا ديفيس عميد جائزه الإرشاد (إلى K.M.M.) ومن المسلم به بامتنان.

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

توسيع نطاق التحقيق وتطبيق المنتجات الطبيعية diterpenoid يتطلب بروتوكولات بسيطه وغير مكلفه لتوليف وتنقيه كميات كافيه من المركبات المطلوبة. الزيادة السريعة في عدد من الانزيمات الايضيه diterpenoid المتاحة من مجموعه واسعه من الأنواع الآن يوفر مخزون توسعيه للإنتاج الانزيمي من diterpenoid باستخدام الميكروبية والنباتية القائمة علي أنظمه المضيف. الاضافه إلى ذلك ، فان الهندسة المعمارية وحدات من العديد من مسارات diterpenoid تمكن من استخدام الانزيمات من نفس الأنواع أو مختلفه في ' التوصيل & اللعب ' نهج الهندسة التوافقية لتوليد مجموعه من الطبيعة الطبيعية والجديدة مثل diterpenoid الطبيعية المنتجات2،14،26،35.
E. كولاي هو المضيف الميكروبي المفضل لتخليق المنتجات الطبيعية بسبب قوتها ، وسهوله التحجيم ، والتعقيد الكيميائي محدوده لانخفاض التلوث الثانوي ، وثروة من الاداات المتاحة لتجميع الحمض النووي والتعبير الامثل. في تجربتنا ، المنصة الموصوفة هنا هي مناسبه تماما لإنتاج غله المنتج تصل إلى عده مئات من الملغ من اوليفينات ديتيربين والكحول ، والتي هي مناسبه للعديد من التطبيقات المصب بما في ذلك تلك المقترحة هنا. في حين لا يجتمع النطاق الصناعي ، ومنصة الإنتاج الموصوفة هنا يمكن ان تكون أساسا لمزيد من المسار ، والمضيف ، والتخمير الأمثل كما ثبت بنجاح ل diterpenoids ذات الصلة مثل تاكساديني والصلبة33 ,34. وقد تم بنجاح إنشاء التعبير المفرط عن الجينات التي تحد من المعدلات المضافة للصناعة التحويلية أو المسالك المتوسطة للتغلب علي العوامل التي تحد من الغلة بالنسبة لتخليق المركبات الحيوية ، مثل عدم كفاية إمدادات السلائف وتدفق السلائف إلى المساراتالمتنافسة 13 ، 32،33،39. علي الرغم من ان ثبت نجاحه في العديد من الدراسات ، وضعف التعبير والنشاط الحفاز من تربين-الأيض P450s النواة وغيرها من الانزيمات الغشائية في القولونية هو عامل الحد من المرجح33،39 ،48،49،50،51،52. وقد ثبت استخدام متواليات codon الأمثل والتعديلات البروتين ، مثل أزاله الببتيد اشاره الشبكية إندوبلازمي أو إدخال الببتيد اشاره plastidial ، مفيده لزيادة ذوبان P450 التعبير14،38 ،49،50،53. واستخدمت هذه التعديلات أيضا للتعبير الميكروبي المشترك للذرة CYP71Z1839 المستخدم كمثال للمسار في هذه الدراسة. وتستند البروتوكولات الموصوفة علي استخدام البلازميدات الذي يحمل واحدا أو اثنين من الجينات لكل بناء ، وجميعها تحت نفس المروج المحرض. وفي الحالات التي تكون فيها التركيبات الجينية الأوسع نطاقا مرغوبة ، فانه من المستصوب استخدام مختلف الشرائط الجينية المتعددة المتاحة أو نظم التراص الجينية للتخفيف من كفاءه التحول المنخفض ونمو الثقافة بسبب استخدام البلازميدات ومضادات حيوية متعددة13 .
ومع توافر الموارد الوراثية والجينوم علي نطاق أوسع ، أصبحت النظم المضيفة للنباتات أيضا مناسبه بشكل متزايد لتصنيع المنتجات الطبيعية. وتشمل المزايا قدره النباتات علي إنتاج السلائف الطبيعية المطلوبة مدعومة بالتمثيل الضوئي ، التالي تمكين تكوين المنتجات دون الحاجة إلى تكمله السلائف جزيئات54،55. N. benthamiana يستخدم بالفعل علي نطاق واسع لفي الجسم الطبيعي توصيف وظيفية والتعبير التوافقي من تربين وغيرها من مسارات المنتجات الطبيعة14,35,36,40 . وتشمل المزايا الملحوظة لاستخدام n. benthamiana كنظام مضيف الإنتاج الذاتية من السلائف diterpenoid ، واستخدام متواليات الجينات الاصليه ، والتعبير المبسط لP450s حقيقية النواة ، وسهوله التحول الجينات التوافقية (كما المضادات الحيوية منفصلة غير مطلوبه للتحول المشترك عابره) ، واستخراج بسيطه من المنتجات المستهدفة من المواد ورقه. عند الحاجة ، ويمكن تعزيز إنتاج diterpenoid من خلال التعبير المشترك من الجينات المسار الأساسي لزيادة السلائف العرض36،41. القيود المفروضة علي إنتاج diterpenoid قابله للتطوير في n. benthamiana هي أكثر تعقيدا بالمقارنة مع الثقافات الميكروبية السائلة بسبب الحاجة إلى توليد الكتلة الحيوية النباتية كافيه ، وأكثر كثافة العمالة الكثيفة تنقيه المنتجات من مركب كيميائيا الانسجه النباتية ، وامكانيه الأيض غير المرغوب فيها من المنتجات المستهدفة من خلال ، علي سبيل المثال ، الاكسده ، glycosylation أو ديفوسفورويليشن من قبل الانزيمات الذاتية36،43،44،45 ,46,47. ومع ذلك ، يمكن توسيع هذا الاجراء إلى كميات المنتج مغ عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة للتسلل الزراعي56.
بروتوكولات استخراج وتنقيه المنتجات الموصوفة هنا متوافقة مع e. كولاي و n. benthamiana، وكذلك s. سيريفيسياي وغيرها من النظم المضيفة النباتية أو الميكروبية ، وتوفير نهج فعاله من حيث التكلفة التي من السهل ان أنشئت في كل من مختبرات البيولوجيا والكيمياء ولا تتطلب معدات تنقيه باهظه الثمن. استخراج المستقلب باستخدام قمع منفصلة مناسبه تماما لاستخراج كفاءه وفصل المرحلة قبل تنقيه الكروماتوغرافي. ويمكن تعديل احجام القمع بسهوله للسماح بحجم أكبر للثقافة وتقليل الوقت التجريبي اللازم لاستخراجها من الثقافات الكبيرة. وجدنا استخدام التدرج خلات الهكسان/ايثيل لتكون مثاليه لاستخراج ديتيربنيدس من قطبيه مختلفه كما هو موضح هنا لمجموعه من dolabralexins التي تضم كلا من الهيدروكربونات والأوكسيجين المركبات (الشكل 3). اعتمادا علي خصائص المنتجات المستهدفة ، قد تكون الخلائط المذيبات الأخرى مفيده. ومع ذلك ، يجب الا تكون المذيبات بالماء لضمان الاستخراج الناجح وفصل المرحلة باستخدام تقنيه القمع المنفصلة. الاضافه إلى ذلك ، فان فقدان المنتج من خلال التبخر يجب ان يؤخذ في الاعتبار عند استخدام هذا النهج لإنتاج المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) ، مثل الوزن الجزيئي المنخفض أحاديه-و sesqui-تربين وغيرها من VOCs. فصل الكروماتوغرافي من ديتيربينيادس من مستويات مختلفه من الأوكسجين باستخدام أكبر مقياس (~ 2 L) عمود السيليكا كان مفيدا في تجربتنا ، لأنه يوفر فصل المنتجات المحسنة ويقلل من الحاجة إلى تنقيه تكراريه خطوات عند استخدام وحدات تخزين أصغر في العمود. يمكن تعديل وحدات تخزين الاعمده والمصفوفات حسب الحاجة لحجم الثقافة المطلوب ونوع المنتج الطبيعي. نقاء المنتجات المستهدفة التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول هو مناسبه للعديد من التطبيقات المصب ، مثل اختبارات النشاط الحيوي أو لاستخدامها في تحليلات نشاط الانزيم. ومع ذلك ، حيث مستويات نقاء اعلي مطلوبه ، مثل التحليلات الهيكلية عن طريق NMR ، ويمكن تعزيز نقاء المنتج بكفاءة عن طريق تنقيه اضافيه باستخدام (شبه)-الاعداديه HPLC.
هذا البروتوكول الموصوف هنا قد تم الأمثل لإنتاج المنتجات الطبيعية diterpenoid ، ولكن يمكن أيضا ان تكون مخصصه بسهوله إلى أحاديه ذات الصلة ، sesqui-وثلاثي التربين ، فضلا عن غيرها من فئات المنتجات الطبيعية ببساطه عن طريق توليد الانزيم المطلوب وحدات للتعبير التوافقي14،57. ومع ذلك ، يجب ان تؤخذ التعديلات علي إجراءات استخراج المنتج وتنقيه في الاعتبار للمركبات ذات التقلبات العالية ، مثل أحاديه و sesqui-تربين ، أو اعلي القطبية والتعديل الوظيفي علي النحو الذي يجسده الغليكولات من العديد من triterpenoids ، فينيلبروبانيدس ، وغيرها من فئات المنتجات الطبيعية.
وعلي الرغم من ان المنصات الصناعية لتصنيع المنتجات الطبيعية متاحه ، فان البروتوكولات الموصوفة هنا توفر أداه غير مكلفه وقابله للتخصيص يمكن اعدادها بسهوله في معظم المختبرات. كما يتضح من إنتاج dolabralexins الذرة هنا وأماكن أخرى39، وكميات المنتجات والنقاء التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا النهج هي عاده ما تكون كافيه لتسهيل التحليل المصب المختلفة والاستخدامات ، بما في ذلك ، ولكن ليس تقتصر علي ، والدراسات الحيوية المختلفة ، وتحليل التفاعلات بين الكائنات الحية ، وكذلك لاستخدامها كركائز الانزيم أو كماده البداية للنهج شبه التوليف.

[دتيربنيدس] يتالف مجموعه كيميائيا متنوعة من أكثر من 12,000 غالبا [بولدوري] [20-كربون] منتوجات طبيعيه ان يلعب ادوار حرجه في كثير كائن حي1. الفطريات والنباتات تنتج أكبر تنوع diterpenoids ، ولكن كما تبين البكتيريا لتشكيل diterpenoids النشطة بيولوجيا (انظر التعليقات2،3،4،5). الجذور في تنوعها الهيكلي الواسع ، وخدمه diterpenoids العديد من الوظائف البيولوجية. وهناك عدد قليل من diterpenoids ، مثل هرمونات النمو الجبريلين ، لديها وظائف أساسيه في العمليات التنموية5. ومع ذلك ، فان الغالبية العظمي من diterpenoids بمثابه وسطاء من الدفاع الكيميائي والتفاعلات إينتيرورجانيسمال. ومن بين هذه الأحماض الراتنج ديتيربيني في آلافات والممرض الدفاع من الأشجار الصنوبرية ويمزج الأنواع المحددة من ديتيربينييدات المضادة للميكروبات في المحاصيل الغذائية الرئيسية مثل الذرة (زيميس) والأرز (اوريزا ساتيفا) وقد تم علي نطاق واسع درست6,7. هذه الانشطه الحيوية توفير مستودع الكيميائية الغنية للتطبيقات التجارية ، واختيار diterpenoids تستخدم الادويه الهامه ، والمضافات الغذائية ، والمواد اللاصقة ، وغيرها من المنتجات الحيوية من الحياة اليومية الحديثة8،9 ،10. وللمضي قدما في البحوث المتعلقة بالتنوع الطبيعي والوظائف البيولوجية للدوريبينييدات ، وفي نهاية المطاف الترويج للتطبيقات التجارية الأوسع نطاقا ، يلزم توفير أدوات لاعداد المركبات النقية بكفاءة من حيث التكلفة. وقد وضعت العزلة علي نطاق واسع من المواد النباتية لعدد قليل من المنتجات الحيوية diterpenoid ، مثل الأحماض الراتنج diterpenoid التي يتم إنتاجها كمنتج ثانوي من صناعه اللب والورق8. ومع ذلك ، تراكم diterpenoids في انسجه محدده فقط وتحت التنظيم المحكم من قبل المحفزات البيئية في كثير من الأحيان يحد من العزلة من كميات المنتجات الكافية من المنتج الطبيعي2. الاضافه إلى ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للديتيربنيدات يعوق إنتاجها من خلال التوليف الكيميائي ، علي الرغم من ان هذه النهج قد نجحت في العديد من الحالات11و12. مع توافر تقنيات الجينوم والكيمياء الحيوية المتقدمة ، وقد اكتسبت منصات الإنتاج الانزيميه اهتماما متزايدا لإنتاج مجموعه من المركبات diterpenoid (انظر التعليقات13،14، 15و16و17و18).
وتستمد جميع التربينات ، بما في ذلك الدتيربينييدات ، من اثنين من السلائف ايزوبرينواد الايزوميريه ، إيسوبينتينيل ثنائي فسفات (IPP) وديميثيلاليل ثنائي الفوسفات (dmapp)19 التي ، بدورها ، تتشكل من خلال الميلنات (المضافة) أو مسار ميثيل اريثريتول-5-الفوسفات. التخليق الحيوي تيرنويد العائدات من خلال مسار الطريق السريع في البكتيريا والطريق السريع للصناعة التحويلية في الفطريات ، في حين ان النباتات تمتلك المضافات الصحية السيتووليك ومسار البلازما ، مع ان الأخير هو الطريق الرئيسي نحو تشكيل diterpenoid20. التكثيف من IPP و dmapp من قبل الناقلات قبل الميلاد غله المركزية 20-الكربون السلائف لجميع دتيربينيدس ، جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات (ggpp)20. المصب من تشكيل ggpp ، واثنين من الأسر انزيم ، تربين synthases (tpss) و سيتوكروم P450 مونوكسيجيناسيس (P450s) السيطرة إلى حد كبير علي تشكيل التنوع الكيميائي واسعه من الأيض تربين21،22. ديتيربيني synthases (ditpss) تحفيز التزام القائم علي الكارميه المدفوعة وأعاده ترتيب ggpp لتشكيل مختلف المجسمات ثنائي ، بولي ، أو ماكرو دوري ديتيربيني السقالات1،3،23، 24-الآن ثم يتم تسهيل الأوكسجين والزخرفة الوظيفية الاضافيه لهذه السقالات بواسطة انزيمات P450 واختيار عائلات انزيم أخرى22،25. TPSs و P450s موجودة عاده الأنواع المحددة ، والأسر متعددة الجينات التي يمكن ان تشكل وحدات الشبكات الحيوية الاصطناعية ، حيث الجمع بين وحدات انزيم مختلفه علي طول مخطط مشترك يتيح تشكيل مجموعه واسعه من المركبات2، 26. الاكتشاف السريع من الانزيمات وظيفيا متميزة تعمل في مسارات تربين وحدات في السنوات الاخيره قد وفرت فرصا متزايدة لاستخدامها كقائمه أجزاء متعددة للهندسة الايضيه من مسارات جزئيه أو كامله في منصات الإنتاج الجرثومية والنباتية علي حد سواء. علي سبيل المثال ، تم تطبيق الخميرة (ساكاروميسز سيريفيسياي) بنجاح لمهندس مسارات متعددة الانزيمات لتصنيع المنتجات الحيوية تربين ، مثل ماده الارتيميسينين المخدرات المضادة للملاريا27، و سيسكويتيربينويد الوقود الإحيائي bisابولي و farnesene28، ولكن أيضا اختيار ديتيربينيادس29،30،31. المثل ، تم إنشاء منصات القولونية الهندسية للصناعة علي نطاق صناعي لعدد قليل من الأيض diterpenoid ، بما في ذلك تاكساديني السلائف taxol المستخدمة كدواء مضاد للسرطان والكحول diterpenoid ، الصلبة ، وتستخدم في صناعه العطور13،32،33،34. كما ان التقدم في الهندسة الوراثية وتكنولوجيات التحول جعلت النظم المضيفة للنباتات قابله للاستمرار علي نحو متزايد لإنتاج المنتجات الطبيعية النباتية9و14و35و36. علي وجه الخصوص ، أصبح القريب التبغ وثيق ، نيكوتيانا benthamiana، هيكل المستخدمة علي نطاق واسع لتحليل المسار تربين والهندسة ، ويرجع ذلك إلى سهوله التحول بوساطة agrobacteriumمن مجموعات الجينات متعددة ، التخليق الحيوي الفعال للسلائف الذاتية ، والكتلة الاحيائيه العالية14،35،36.
الرسم علي هذه المنصات التي أنشئت لتخليق الحيوي تربين ، ونحن وصفها هنا سهله الاستخدام وأساليب فعاله من حيث التكلفة للإنتاج الانزيمي من ديتيربينييدس وتنقيه المركبات واحد. البروتوكولات المقدمة توضح كيف يمكن استخدام المنصات e. القولونية و n. benthamiana المهندسة لتعزيز التخليق الحيوي السلائف diterpenoid للتعبير التوافقي لمختلف ditpss و P450 الانزيمات لتوليد المطلوب المركبات diterpenoid. ويظهر تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج وتنقيه ديتيربينييدات المختلفة من الناحية الهيكلية علي سبيل المثال من الديتيربينييدات المتخصصة من الذرة (زيميس) ، وتسمي dolabralexins ، التخليق الحيوي الذاتية التي تجند اثنين من ditps واحد P450 انزيم. ومن ثم يتحقق تنقيه dolabralexins مختلفه تتراوح من اوليفينات إلى مشتقات الأوكسيجين عن طريق الجمع بين استخراج القمع المنفصلة مع الفصل اللوني السيليكا علي نطاق واسع والفصل اللوني السائل عالي الضغط المعد (HPLC). البروتوكولات الموصوفة هي الأمثل لإنتاج الدتيربينييدات ، ولكن يمكن أيضا ان تتكيف بسهوله لفئات تربين ذات الصلة ، فضلا عن المنتجات الطبيعية الأخرى التي موارد الانزيم المتاحة. المركبات المنتجة باستخدام هذا النهج هي مناسبه لمختلف التطبيقات المصب, بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي, توصيف الهيكلية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحليل, استخدام ركائز للدراسات الوظيفية الانزيم, ومجموعه من اختبارات النشاط الحيوي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoids تشكل فئة متنوعة من المنتجات الطبيعية جزيء صغير التي يتم توزيعها علي نطاق واسع في جميع انحاء ممالك الحياة ولها وظائف بيولوجية حرجه في العمليات التنموية ، والتفاعلات إينتيرورجانيسمال ، والتكيف البيئي. نظرا لهذه الانشطه الحيوية المختلفة ، والعديد من diterpenoids هي أيضا ذات اهميه اقتصاديه مثل الادويه والمضافات الغذائية والوقود الإحيائي ، وغيرها من المنتجات الحيوية. وقد مكنت النهج المتقدمة علم الجينوم والبيوكيميائية زيادة سريعة في معرفه الجينات diterpenoid-الأيض ، والانزيمات ، والمسارات. ومع ذلك ، فان التعقيد الهيكلي للدوتيريا والتوزيع التصنيفي الضيق للمركبات الفردية في كثير من الأحيان لا يبقي الا نوعا واحدا من العوامل المقيدة لإنتاجها بكفاءة. توفر مجموعه واسعه من الانزيمات الايضيه الآن توفير الموارد لإنتاج الدتيربينييدات في الكميات الكافية والنقاء لتسهيل تحقيق أعمق لهذه المجموعة المستقلب الهامه. الاعتماد علي الاداات التي أنشئت لانزيم الميكروبية والنباتية التي تعتمد علي التعبير المشترك ، ونحن نقدم بروتوكول تعمل بسهوله وقابله للتخصيص للإنتاج الانزيمي من الدتيربينييدات في اما القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، و تنقيه المنتجات المطلوبة عن طريق اللوني السيليكا وشبه الاعداديه HPLC. باستخدام مجموعه من الذرة (زيميس) dolabralexin diterpenoids كمثال ، ونحن تسليط الضوء علي كيفيه تركيبات وحدات من synthase diterpenoids (ditps) و سيتوكروم P450 اكسيجيناز أحاديه (P450) يمكن استخدام الانزيمات لتوليد السقالات diterpenoids مختلفه. ويمكن استخدام المركبات المنقية في مختلف التطبيقات المصب ، مثل التحليلات الهيكلية المستقلب ، والدراسات وظيفة هيكل الانزيم ، وفي المختبر وفي التجارب الحيوية النباتات.

سير عمل تخطيطي للإنتاج diterpenoid باستخدام e. كولاي يوضح الشكل 1 سير العمل الموصوف لإنتاج diterpenoid. تم تكييف البروتوكول الموضح هنا من منصة كولاي الموصوفة سابقا لتخليق الحيوي diterpenoid13،32 لاستخدام الثقافات أكبر حجما وتنقيه المنتجات المطلوبة من diterpenoid عن طريق السيليكا اللوني. لإثبات استخدام هذا البروتوكول ، استخدمنا المسار dolabralexin التي تم تحديدها مؤخرا من الذرة التي تضم اثنين من diTPSs ، ZmAN2 (Zm00001d029648) و ZmKSL4 (Zm00001d032858) ، P450 متعدد الوظائف (CYP71Z18 ، Zm00001d014134) ، والكروم الخلوي P450 ريدكتيز (ZmCPR2 ، Zm00001d026483) (الشكل 2). باختصار ، e. القولونية BL21DE3-C41 الخلايا المختصة تم تحويلها مسبقا مع pcdfduet: IRS و pacyc-duet: ggpps/ZmAN2 البلازميدات13،32. و pcdfduet: IRS البلازميد يحتوي علي الانزيمات الرئيسية لإنتاج السلائف diterpenoid ، بما في ذلك 1-ديكسي-د-اكسيليولوسي-5-فوسفات synthase (dxs) ، 1-ديكسي-د-اكسيليولوسي-5-فوسفات ريدكتيز (dxr) ، و إيسوبينتينيل ثنائي فوسفات ايسوميمسح (idi) ، وكان يظهر لزيادة تشكيل diterpenoid في e. القولونية13. و pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 البلازميد يحتوي علي الذرة الأنف-copalyl ثنائي فوسفات synthase ZmAN2 و synthase ggpps من شوح جرانديز. الانزيمات المحفزة لردود الفعل الملتزمة في dolabralexin التخليق الحيوي كانت ثم المشاركة في تحويل كما البلازميدات pET28b: ZmKSL4 و pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. للحصول علي تفاصيل حول التسلسلات والثوابت البلازميد انظر mafu et al. 201839.
يتم عرض كروماتوجرام GC-MS من منتجات الانزيمات المستخرجة في الشكل 3A، مما يدل علي تشكيل ثلاثه مركبات dolabralexin ، وهي dolabralexin (1.2 ± 0.25 Mg/l الثقافة) ، ابيكسيدولابريني (0.65 ± 0.2 Mg/l الثقافة) ، وابيكسيدولابرانول (11.4 ± 1.1 mg/L الثقافة) كما كميا استنادا إلى منحني قياسي باستخدام الصلبة diterpenoid. واستخدمت المادة الصلبة كمعيار مرجعي ، بسبب بنيتها المماثلة وخواصها الكيميائية بالمقارنة مع dolabralexins. وتشمل المنتجات الثانوية التي لوحظت عاده الكلورامفينيكول ، ومشتقات الانول اوكسيندول و اندول-5-الديهيد ، والسلائف جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات (ggpp) (الشكل 3). يمثل indole عاده المنتج الثانوي الأساسي ، ولكن لا يظهر هنا ، نظرا للوقت الاحتفاظ به أقصر من تاخير المذيبات المجموعة من 7 دقائق للحفاظ علي سلامه الصك GC-MS.
سير العمل التخطيطي للإنتاج diterpenoid باستخدام n. benthamiana ويصور الشكل 4 لمحه عامه عن التعبير عن مسار dolabralexin في n. benthamiana. بالنسبة للمنتجات الموصوفة هنا ، تم تحويل الثوابت التالية بشكل منفصل إلى ا. توميفاسينس سلاله GV3101: pLife33: p19 (التعبير عن p19 الجينات إسكات البروتين المثبط) ، pLife33: ZmCYP71Z18 ، PLife33: ZmAN2 ، PLife33: ZmKSL4. واستخدمت متواليات كامله الأصلي من الجينات dolabralexin مسار الذرة في ثنائي T-الحمض النووي ناقلات pLife3341 مع المقاومة كاناميسين للانتشار في كولاي و ا. توميفاسينس. التعبير المشارك من الجينات المسار تربين المنبع هو اختياري ، لان السلائف جيرانيلجيرانيل ثنائي فسفات هو اندوجينوسلي تتشكل في n. benthamiana. ومع ذلك, وقد استخدمت عده دراسات بنجاح مثل هذه النهج لزيادة تشكيل diterpenoid في n. benthamiana14,36,41. كما هو موضح في الشكل 3، التعبير المشترك أنتجت بنجاح dolabradiene و 15 ، 16-ابكسيدولابيريني. وخلافا لانزيم التعبير المشترك في كولاي, 15, 16-ايبوكدولابرانول لم يتم الكشف عنها في مقتطفات المستقلب.
وجود 15 ، 16-ابكسيدولابهين في مقتطفات ورقه أظهرت نشاط CYP71Z18 في n. benthamiana. كما 15, 16-ابكسيدوليابرانول ثبت ان تكون مستقره بعد استخراج من الثقافات الميكروبية (الشكل 3) وكذلك بعد العزلة عن الذرة الجذر الانسجه في الدراسات السابقة39, يبدو من المعقول ان المنتج هيدروكسيلاتيد هو الغليكوزيلاتي الذاتية غليكوسسيلترانسفيراسيس والمعزولة في وقت لاحق في فجوه ، مما يجعلها غير قابله للوصول إلى استخراج مع مخاليط المذيبات العضوية المستخدمة هنا لاستخراج36،43،44،45 ,46. وقد تم الإبلاغ عن تعديلات مماثله في المنتجات غير المرغوب فيها في سياق هندسه المسارات في n. benthamiana في الدراسات السابقة47. كما هو مبين للتعبير المشترك في e. كولاي، التعبير عابر في n. benthamiana النتائج في استخراج العديد من المنتجات الثانوية ، بما في ذلك الخطية من طول سلسله مختلفه استنادا إلى مقارنه إلى قواعد البيانات الأطياف الجماعية المرجعية. تم العثور علي فكسانال مركب المستخرجة من المواد ورقه لتكون في المتوسط 2.4 +/-0.5 ملغ dolabradiene و 0.9 +/-0.3 ملغ 15 ، 16-ابكسيدولابهريني في الانسجه ورقه الجافة g. لا يمكن مقارنه هذه الفكسانال مباشره إلى نظام التعبير المشترك e. كولاي نظرا لمجموعه مختلفه ups التجريبية.
تنقيه ديتيربينيد تم تحقيق تنقيه diterpenoid باستخدام اللوني عمود السيليكا واللاحقة HPLC شبه معدي. مستخلصات المستقلب من 12 لتر من الثقافات القولونية المجمعة تم تنقيتها باستخدام اللوني العمود السيليكا لفصل المركبات dolabralexin البؤري الثلاثة (الشكل 3a). اللوني السيليكا مثاليه لتحقيق نقاء عاليه من المركبات المستهدفة ، لأنه يتيح فصل بسيط من اوليفينات ديتيربين ومشتقات الأوكسيجين ، ويزيل بسهوله الملوثات الرئيسية ، oxindole ، والتي يتم الاحتفاظ بها علي مصفوفة السيليكا ( الشكل 3 (ا).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> الشكل 1: سير العمل لإنتاج الدتيربينيد في e. كولاي وتنقيه المستقلب من الثقافات البكتيرية السائلة. تصور المربعات المتقطعة الخطوات الاختيارية التي تتطلب تنقيه اضافيه. (ا) صوره تمثيليه للثقافة القولونية المستخرجة باستخدام قمع منفصل. (ب) صوره تمثيليه لتنقيه المستقلب استخراج باستخدام اللوني السيليكا.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> الشكل 2: المسار البيولوجي الاصطناعي Dolabralexin والتركيبات الجينية المستخدمة في هذه الدراسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> الشكل 3: نتائج GC-MS. المعروضة هي تمثيليه الكروم GC-MS من المنتجات diterpenoid المنقي التي تم الحصول عليها باستخدام انزيم التعبير المشترك المقايسات في (ا) e. كولاي و (ب) n. benthamiana. وتستند تعاريف المنتجات إلى مقارنات مع المعايير الاصليه والأطياف الجماعية المرجعية للمكتبة الطيفية الشاملة للمعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا. 1, oxindole; 2 ، اندول-5-الديهيد. 3 ، بيرولو [1 ، 2-ا] pyrazine-1 ، 4-dione ، هيكسيهيدرو-3-(2-ميثيلبروبيل)-؛ 4, 6-O-اسيتيل-1-[[4-بروموفينيل] thio]-a-د-غلوكوزيد S, S-ثاني أكسيد; 5 ، dolabradiene ؛ 6, 15, 16-[ابكسيدولبرين]; 7 ، بيرولو [1 ، 2-ا] pyrazine-1 ، 4-dione ، هيكسيهيدرو-3-(فينيلالميثيل)-؛ 8, 15, 16-ابوكسيدولابرانول; 9 و 12 ، غير معروف ؛ 10 ، الكلورامفينيكول ؛ 11 ، 3 ، 7 ، 11 ، 15-تيتراميثيل-2-هيكساديسين-1-را ؛ 13-16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> الشكل 4: إنتاج الدتيربينيد في n. benthamiana. (ا) سير العمل في إنتاج الدتيربنيد في n. benthamiana وتنقيه المستقلب من الموادالورقية. (ب) صوره تمثيليه لنباتات n. benthamiana جاهزه لتجارب التسلل ، قبل التشذيب. (ج) الصور التمثيلية لنباتات n. benthamiana بعد التشذيب. (د) صوره المحقنة-الأوراق المخترقة. وقد تسللت المناطق المظلمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

هنا نقدم سهله الاستخدام بروتوكولات لإنتاج وتنقيه الأيض diterpenoid من خلال التعبير التوافقي من الانزيمات الاصطناعية في القولونية أو نيكوتيانا benthamiana، تليها المنتج الكروماتوغرافي تنقيه. نواتج الأيض الناتجة هي مناسبه للدراسات المختلفة بما في ذلك توصيف الهيكل الجزيئي ، والدراسات الوظيفية الانزيم ، واختبارات النشاط الحيوي.

نهج للتخصيص للإنتاج الانزيمي وتنقيه المنتجات الطبيعية ديتيربينيد

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

هذا البروتوكول هو مناسبة لإنتاج diterpenoids النقية التي يمكن استخدامها لتحليل المصب مختلفة ويمكن تخصيص لمجموعة من الأهداف الأيض مختلفة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو انها طريقة بسيطة وغير مكلفة لإنتاج كميات مليغرام من المستقلبات المتخصصة. من خلال تبادل الجينات والإنزيمات المستخدمة للتعبير المشترك ، يمكن تعديل هذه الطريقة لإنتاج تيربينويدات أخرى ، بما في ذلك monoterpenoids وsesquiterpenoids ، وكذلك فئات المستقلب الأخرى مثل الفلافونويدات.لإنتاج الأيض diterpenoid والتحول، تبدأ من قبل ارتفاع درجة حرارة الخلايا القولونية المختصة كيميائيا على الجليد. عندما تذوب الثقافة، إضافة 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة لكل بناء إلى 1.5 ملليلتر المبردة microtube وإضافة 1 ميكرولتر من 100 نانوغرام في حل ميكرولتر كل بناء المستخدمة للتعبير المشترك. احتضان الخلائط على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط لطيف كل 10 دقائق عن طريق كشط الأنابيب عبر رف microtube.في نهاية الحضانة، والحرارة صدمة خلائط الخلية في 42 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة قبل وضع الخلايا مرة أخرى على الجليد لمدة دقيقتين على الأقل. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية SOC المتوسطة إلى الأنابيب. واحتضان الثقافات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 200 التناوب في الدقيقة الواحدة.في نهاية الحضانة، إضافة ما يقرب من 10 حبات الزجاج autoclaved و 100 ميكرولتر من الخلايا إلى واحد 37 درجة مئوية حرارة حساء lysogeny لوحة أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. وهز لوحة أفقيا مع الغطاء في مكان لتوزيع الخلايا بالتساوي. ثم، اضغط بلطف على الخرز الزجاجي في حاوية النفايات واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، سطح المغلفة الجانب إلى أسفل.في اليوم التالي، قم بإزالة الطبق من الحاضنة. إضافة 5 ملليلتر من مرق lysogeny إعدادها حديثا المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة إلى واحد 15 ملليلتر أنبوب زجاجي معقمة مع غطاء بلاستيكية تنفس لكل ثقافة 1 لتر المخطط لها، واستخدام تلميح الأنابيب لاختيار الفردية المتحولة E.Coli المستعمرات من لوحة أجار. إضافة مستعمرة واحدة التقطت إلى كل من إعداد 15 ملليلتر أنابيب وقبعة كل أنبوب مع غطاء البلاستيك تنفس المصاحبة.ثم ضع الثقافات الصغيرة الإشريكية القولونية المغطاة في حاضنة تهتز 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي إضافة 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 10x إلى 900 ملليلتر من مرق رائع في قارورة 1 لتر لكل ثقافة صغيرة مع المضادات الحيوية المناسبة. ووضع القارورة في 37 درجة مئوية و 140 دوران في الدقيقة لمدة 30 دقيقة تقريبا.عندما يكون مرق رائع دافئ, إضافة كامل 5 ملليلتر حجم كل ثقافة التطعيم إلى 1 لتر قارورة ثقافة لكل ثقافة. ووضع القارورة في حاضنة اهتزاز في تناوب 140 في الدقيقة لمدة 3 ساعات تقريبا. عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر 0.6، وخفض درجة حرارة الحاضنة إلى 16 درجة مئوية.مرة واحدة وقد تبريد الحاضنة, إضافة 1 ملليلتر من IPTG مول واحد, 1 ملليلتر من إعداد طازجة 4 غرام لكل لتر الريبوفلافين و 1 ملليلتر من الطازجة 150 أعدت غراما لكل لتر aminolevulinic حمض لكل ثقافة. لإنتاج diterpenoid، إضافة 25 ملليلتر من بيروفات الصوديوم الضرس واحد إلى كل ثقافة لضمان تكوين السلائف كافية. ثم، احتضان الثقافات في 16 درجة مئوية و 140 التناوب في الدقيقة لمدة 72 ساعة، مضيفا 25 ملليلتر من بيروفات الصوديوم يوميا إلى الثقافات المناسبة.لفصل المستقلب وتنقيته، قم بتأمين قمع فاصل على حامل حلقة في غطاء أبخرة. ووضع حاوية النفايات تحت القمع. صب 500 ملليلتر من محلول 50/50 من خلات الإيثيل وسداسيات في القمع الفاصل.وإضافة 500 ملليلتر من تحويل E.coli ثقافة التعبير المشترك من الاهتمام في القمع. ضع سدادة الزجاج على القمع وهز القمع 5 إلى 10 مرات لخلط الثقافة مع المذيبات استخراج، وفتح في كثير من الأحيان حنفية في حين القمع هو رأسا على عقب ونقطة في غطاء محرك الدخان إلى degas القمع. بعد جولة ثانية من الهز وفك الغاز كما أظهرت للتو، وضع القمع تستقيم في موقف الحلبة لمدة دقيقة واحدة تقريبا.عندما تنفصل طبقة المذيبات العلوية عن طبقة الثقافة مائي، إزالة سدادة واستنزاف طبقة القولونية في كوب النفايات، مع الاحتفاظ طبقة المذيبات داخل القمع. ثم، كرر الاستخراج مع 500 ملليلتر المتبقية من الثقافة باستخدام نفس 500 ملليلتر من المذيبات المستخدمة لاستخراج الأول، قبل استنزاف المذيبات التي تحتوي على المستقلبات المستخرجة في قارورة نظيفة. هنا، لدينا ممثل الكروماتوغرافيا الغاز-الطيف الكتل الكروماتوغرام من منتجات الإنزيم المستخرجة نموذجية هو مبين.وتشمل المنتجات الثانوية الثانوية التي لوحظت عادة الكلورافينيكول ومشتقات الإندول أوكسيدوندول والإندول بيفالالدهيد. بعد تنقية الديتربينويد عن طريق الكروماتوغرافيا عمود السيليكا، يمكن الحصول على ثلاثة مركبات دولابراليكسين، كما كميا استنادا إلى منحنى قياسي باستخدام sclareol diterpenoid. الكروماتوغرافيا السيليكا مثالية لتحقيق نقاء عالية من المركبات المستهدفة.لأنه يتيح إعداد بسيط من أوليفينات الديتربين والمشتقات المؤكسج وإزالة بسهولة اوكسيندل الملوثة الرئيسية، التي يتم الاحتفاظ بها على مصفوفة السيليكا. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام التعبير المشترك لجينات مسار التربينويد لإنتاج ديتربينويد في N.Benthamiana ، مما يؤدي إلى إنتاج دولارادين و 15 ، 16 إيبوكسيدولابرين. ينبغي أن تكون الأمثل المذيبات المستخدمة أثناء الاستخراج للخصائص الكيميائية الفيزيائية من المستقلبات ذات الفائدة ويجب أن لا تكون قابلة للخلط مع الماء للحفاظ على طبقتين متميزتين.بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام المستقلبات النقية لتحليل المصب، بما في ذلك التحليل الهيكلي وأحماض المضادات الحيوية. وقد مكّنت هذه التقنية اكتشاف الـ diterpenoids الجديدة، بما في ذلك تلك المعروضة هنا، مما سمح بتحليل هذه الأيضات من أجل تركيبها الكيميائي وثنائية الأنشطة الجديدة. اتخاذ الاحتياطات عند استخدام المذيبات العضوية في مسار فصلي.تأكد دائمًا من التخلص من النفايات البيولوجية وفقًا لمعايير السلامة في المختبر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

السريع خطوة واحدة الأنزيمية توليف وجميع المائيه تنقية طرهالوز النظائر

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

إعداد العملاق الحويصلات تغليف المجهرية بواسطة الطرد المركزي من مستحلب الماء في الزيت

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...