Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
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我们感谢鲁本·彼得斯博士（美国伊奥瓦州立大学）提供pIRS和pGGxZmAN2结构。NSF 植物-生物相互作用计划（授予 1758976 到 P.Z.）、DOE 早期职业研究计划（授予# DE-SC0019178 到 P.Z.）、DOE 联合基因组研究所社区科学计划（授予 CSP2568 到 P.Z.））为这项工作提供财政支持研究生研究奖学金计划（到K.M.M.），和加州大学戴维斯分校院长导师奖奖学金（K.M.M.）是感谢感谢。

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

更广泛的调查和应用二苯甲苯天然产品需要简单，廉价的协议来合成和纯化足够数量的所需化合物。各种物种中可用的二苯基代谢酶数量迅速增加，这为使用微生物和植物宿主系统的二苯甲苯类酶的酶生产提供了广阔的库存。此外，许多二苯醚通路的模块化架构允许在"即插即用"组合工程方法中使用来自相同或不同物种的酶，以生成一系列天然和新的自然类二苯类天然产品2，14，26，35.
大肠杆菌是天然产品生物合成的首选微生物宿主，因其坚固性、易伸缩性、减少副产品污染的化学复杂性有限以及可用于 DNA 组装和表达的丰富工具优化。根据我们的经验，这里描述的平台非常适合生产高达几百毫克的二烯烯烃和醇的产品产量，适用于许多下游应用，包括这里提出的应用。虽然不符合工业规模，但此处所述的生产平台可以作为进一步途径、宿主和发酵优化的基础，正如已成功地证明相关的二苯酚（如 taxadiene 和 sclareol33）一样 ， 34.已成功地建立了速率限制 MVA 或 MEP 通路基因的表达，以克服二苯基苯甲酸盐生物合成的产量限制因素，例如前体供应不足和前体通量进入竞争途径13 32，33，39.虽然在多项研究中证明是成功的，但大肠杆菌中三烯代谢真核P450s和其他膜结合酶的表达和催化活性差是一个可能的限制因子33，39 ，48，49，50，51，52。使用科顿优化的序列和蛋白质修饰，如去除内质视网膜信号肽或引入一个板面信号肽，已被证明有助于增加可溶性P450表达14，38 ，49，50，53.这种修饰也用于玉米CYP71Z1839的微生物共表达，作为本研究的范例途径。所述协议基于每个构造携带一个或两个基因的质粒的使用，所有基因都位于同一诱导启动子之下。在需要大规模基因组合的情况下，建议使用各种可用的多基因盒或基因堆叠系统，以减轻由于使用多种质粒和抗生素而降低转化效率和培养增长的情况 13.
随着遗传学和基因组学资源的广泛普及，植物宿主系统也越来越适合制造天然产品。优点包括植物能够生产所需的天然前体由光合作用，从而使产品形成，而无需补充前体分子54，55。N. 本查米亚纳已广泛用于体内功能表征和组合表达的三苯酮和其他天然产物通路14，35，36，40.使用N. benthamiana作为宿主系统的显著优势包括二苯甲苯前体的内源性生产、使用本地基因序列、简化真核P450s的表达、易于组合基因转化（如瞬态共转化不需要单独的抗生素，并且从叶材料中简单提取目标产品。必要时，可通过共同表达关键MEP通路基因来增强二苯基苯甲苯的产生，以增加前体供应36，41。与液体微生物培养相比，在N.benthamiana中可扩展的二苯并苯生产的限制更为复杂，因为需要产生足够的植物生物量，从化学复杂物中更劳动密集型的产品进行纯化植物组织，以及目标产品的可能不需要的代谢，例如，氧化、糖基化或内源酶的脱磷酶36、43、44、45 ，46，47.然而，通过增加用于农业渗透的植物数量，可以扩大到毫克产品数量56。
此处描述的产品提取和纯化方案与大肠杆菌和N.benthamiana，以及S.cerevisiae和其他植物或微生物宿主系统兼容，并提供一种经济高效的方法，易于在生物和化学实验室建立，不需要昂贵的净化设备。使用分色漏斗提取代谢物非常适合在色谱纯化之前进行高效提取和相分离。漏斗尺寸可以很容易地调整，以允许更大的培养量，并减少从大型培养物中提取所需的实验时间。我们发现，使用己氧/乙酸乙酯梯度是提取不同极性二苯基的理想产物，这里就证明了包括碳氢化合物和含氧化合物的多拉布拉辛组（图3）。根据目标产品的性能，其他溶剂混合物可能具有优势。但是，溶剂不得与水相融合，以确保使用分离漏斗技术成功提取和相分离。此外，在使用这种方法生产挥发性有机化合物（VOC）时，必须考虑蒸发产生的产品损失，例如低分子量单体和分体类化合物以及其他挥发性有机化合物。使用较大规模（±2 L）二氧化硅柱对不同氧化水平的二甲苯的色谱分离对我们的经验有利，因为它提供了改进的产品分离，并最大限度地减少了迭代纯化的需要使用较小的列卷时的步骤。可以根据需要根据所需的培养量和天然产品类型调整列卷和矩阵。使用该协议可实现的目标产品的纯度适用于许多下游应用，如生物活性测定或酶活性分析。然而，当需要更高的纯度时，例如通过NMR进行结构分析，通过使用（半）预置HPLC进行额外的纯化可以有效地提高产品纯度。
此处描述的此协议已针对二苯甲苯基天然产物的生产进行了优化，但也可以轻松定制到相关的单体、分体和三元苯甲酯，以及其他天然产品类别，只需生成所需的酶组合表达式14，57的模块。但是，对于挥度较高的化合物，如单体和分体，或更高的极性和功能修饰，必须考虑产品提取和纯化程序的修改，许多三烯酰胺、苯丙酮和其他天然产物的糖基化。
尽管有工业规模的天然产品制造平台，但此处描述的协议提供了一种价格低廉、可定制的工具，可在大多数实验室轻松设置。正如在这里和其他地方生产玉米多拉布拉辛所所证明的39，使用这种方法可以达到的产品数量和纯度通常足以促进各种下游分析和使用，包括，但不限于各种生物活性研究，分析生物体之间的相互作用，以及用作酶基质或半合成方法的起始材料。

二苯酚由12，000多种以多环20碳天然产品组成的化学多样性组组成，在许多生物体中起着关键作用。真菌和植物产生最大的多样性的二甲苯类化合物，但细菌也已被证明形成生物活性二苯甲苯类化合物（见评论2，3，4，5）。植根于其巨大的结构多样性， 二苯甲醚服务于多种生物功能.少数二苯甲苯，如赤霉素生长激素，在发育过程中具有基本功能5。然而，大多数二苯甲苯类化合物是化学防御和组织间相互作用的中介。其中，针叶树的害虫和病原体防御中的二苯基树脂酸，以及玉米（Zea Mays）和水稻（Oryzasativa）等主要粮食作物中抗菌二苯酚的物种特异性混合物中，其范围最为广泛。研究6，7。这些生物活性为商业应用提供了丰富的化学储存库，而精选的二苯甲酮被用作现代生活中重要的药品、食品添加剂、粘合剂和其他生物产品8、 ， 10.为了推进对二苯醚的自然多样性和生物功能的研究，并最终促进更广泛的商业应用，需要为具有成本效益的纯化合物制备工具。已经为一些二烯类生物制品建立了与植物材料的大规模隔离，例如作为纸浆和造纸工业的副产品生产的二苯基树脂酸。然而，仅在特定组织中积累二苯基苯甲苯，并在环境刺激的严格监管下，往往限制了从天然生产者2分离足够的产品量。此外，二苯甲苯的结构复杂性阻碍了其通过化学合成的生产，尽管这些方法在一些情况下已经成功11，12。随着先进的基因组和生化技术的可用性，酶生产平台在生产一系列二苯甲酮化合物方面越来越受到关注（见评论13，14，15，16，17，18。
所有三烯类化合物，包括二苯甲酸酯，均来自两个异位异类前体，二磷基苯甲基（IPP）和二甲基二磷酸二磷酸二醇（DMAPP）19，反过来，通过甲氧酸酯（MVA）或甲基二甲二醇-5-磷酸盐（MEP）途径。特氏体生物合成通过细菌中的MEP通路和真菌中的MVA通路进行，而植物则具有细胞体MVA和表皮MEP通路，后者是二苯甲苯形成的主要途径20。IPP和DMAPP的冷凝通过前尼转移酶产生中央20碳前体的所有二苯基苯甲酸二醇，二磷酸盐（GGPP）20。在GGPP形成的下游，两个酶系，三烯合成酶（TTPS）和细胞色素P450单氧酶（P450s）在很大程度上控制了三烯代谢的庞大化学多样性21、22的形成。二聚苯乙烯合成酶 （diTPS） 催化承诺的雕刻驱动循环和重新排列的 GGPP 形成各种立体特异性双、多、或宏观环二苯基器支架1，3，23 ， 24.然后由P450酶和选择其他酶族22、25促进这些支架的氧化和进一步功能装饰。TTPS 和 P450 通常作为物种特定的多基因家族存在，可以形成模块化生物合成网络，结合共同蓝图的不同酶模块，从而形成广泛的化合物2。26.近年来，在模块化三烯体通路中运行的功能独特的酶的迅速发现，为它们作为部分或完整通路的代谢工程的多功能部件列表提供了不断扩大的机会。微生物和植物生产平台。例如，酵母（糖母素）已成功应用于设计用于制造三烯类生物制品的多酶通路，如抗疟药物青蒿素27、Sesquiterpenoid生物燃料比萨博列和法尔内内28，但也选择了二苯甲苯29，30，31。同样，为工业规模制造而设计的大肠杆菌平台已经为一些二苯丙酮代谢物而建立，包括用作抗癌药物的Taxol前体Taxadiene和二苯酚醇，sclareol，用于香水行业13，32，33，34.基因工程和转化技术的进步也使植物宿主系统越来越适用于生产植物天然产物9，14，35，36。特别是，密切的烟草亲戚，尼科蒂亚娜本查米亚纳，已成为一个广泛使用的底盘的三苯酮通路分析和工程，由于容易的农业细菌介导转换的多个基因组合，内源前体的有效生物合成，高生物量14，35，36。
利用这些已建立的三烯生物合成平台，我们在这里描述了用于酶化生产二苯酮和纯化单一化合物的易于使用且经济高效的方法。所提出的协议说明了如何利用大肠杆菌和N.benthamiana平台，用于增强二烯体前体生物合成，以组合表达不同的二苯基苯甲醚和P450酶，以产生所需的二苯二烯化合物。该协议在生产和纯化结构上不同的二苯基苯甲苯（二苯类）的实例中显示了来自玉米（Zea Mays）的专用二苯甲苯（Zea Mays），称为多拉布拉列辛，其内源性生物合成，其中招募了两个二TPS和一个P450酶。通过将分离漏斗萃取与大规模硅柱色谱和预置高压液相色谱（HPLC）相结合，实现从烯烃到含氧衍生物的不同多拉拉列辛的纯化。所述协议针对二苯甲苯类的产生进行了优化，但也可轻松适应相关的类，以及可用于酶资源的其他天然产品。使用这种方法生产的化合物适用于各种下游应用，包括但不限于通过核磁共振 （NMR） 分析进行的结构表征、用作酶功能研究的基质，以及一系列生物活性测定。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

二苯醚类形成一类多样化的小分子天然产物，广泛分布于生命王国，在发育过程、组织间相互作用和环境适应中具有重要的生物功能。由于这些不同的生物活性，许多二甲苯类药物也具有经济重要性，如药品、食品添加剂、生物燃料和其他生物产品。先进的基因组学和生化方法使对二苯基代谢基因、酶和通路的知识迅速增加。然而，二苯甲苯的结构性复杂性和单个化合物在单个物种中狭窄的分类分布，仍然是限制其有效生产的因素。更广泛的代谢酶现在为生产足够的二苯并物质和纯度提供了资源，以促进对这一重要代谢物群的深入研究。利用微生物和植物酶共表达的既定工具，我们提出了一个易于操作和可定制的方案，用于在大肠杆菌或尼科蒂亚纳本查米亚纳的酶化生产二苯基苯甲酮，通过硅色谱和半预准备HPLC对所需产品的纯化。以玉米组 （Zea Mays） 多拉布拉辛二苯基异物为例， 我们强调如何使用二苯甲苯合成酶 （diTPS） 和细胞色素 P450 单氧酶 （P450） 酶的模块化组合来生成不同的二苯甲苯脚手架。纯化化合物可用于各种下游应用，如代谢物结构分析、酶结构功能研究以及体外和植物生物活性实验。

使用大肠杆菌生产二苯并类动物的原理工作流程 图 1说明了描述的二苯二烯生产的工作流。此处概述的协议改编自前面描述的大肠杆菌平台，用于二烯体生物合成 13、32，用于使用大体积培养物，并通过二氧化硅纯化所需的二苯基苯甲酸酯产品相 色 谱 法。为了演示此协议的使用， 我们使用最近鉴定的玉米多拉布拉列辛通路，包括两个diTpS，ZmAN2（Zm00001d029648）和ZmKSL4（Zm00001d032858），一种多功能P450（CYP71Z18，Zm000001d14134），以及acytochrome P450还原酶 （ZmCPR2， Zm00001d026483） （图2）。简而言之，大肠杆菌BL21DE3-C41合格细胞用pCDFDuet：IRS和pACYC-Duet：GGPPS/ZmAN2质粒13、32进行预转化。 pCDFDuet：IRS质粒含有用于二苯甲酸酯前体生产的关键酶，包括1-脱氧-D-黄糖-5-磷酸合成酶（dxs）、1-脱氧-D-黄糖-5-磷酸还原酶（dxr），以及二磷酸二醇酶（i），并证明增加大肠杆菌13的二苯基苯甲酸酯形成。pACYC-Duet：GGPPS/ZmAN2质粒含有玉米正二磷酸二磷酸合成酶ZmAN2和来自阿比斯大分的GGPP合成酶。酶催化多拉布拉辛生物合成中的承诺反应，然后共同转化为质粒pET28b：ZmKSL4和pETDUET：ZmCPR2/ZmCYP71Z18。有关序列和质粒构造的详细信息，请参阅 Mafu 等人 201839。
图3A显示了萃取酶产物的GC-MS色谱图，说明了三种多拉布拉辛化合物的形成，即多拉布拉基尼（1.2± 0.25 mg/L 培养物）、环氧二苯丙烯（0.65 ± 0.2 mg/L 培养）和环氧二醇 （11.4）• 1.1 mg/L 培养物，根据使用二苯丙酮的标准曲线进行量化。斯克拉罗被用作参考标准，因为它的结构和化学性质与多拉布拉辛相似。通常观察到的次要副产品包括氯霉素、蛋白醇衍生物牛耳和丁多尔-5-醛，以及前体二磷酸二磷酸二磷酸二磷酸（GGPP）（图3）。Indole 通常代表主要副产品，但此处未显示，因为其保留时间比设定的溶剂延迟短 7 分钟，以保持 GC-MS 仪器的完整性。
使用N.本查米亚纳生产二苯甲苯的原理工作流程 图4描绘了在N.本查米亚纳的多拉布拉辛通路表达的概述。对于此处描述的产品，以下结构分别转换为A. tumefaciens菌株 GV3101：pLife33：p19（表达 p19 基因沉默抑制蛋白），pLife33：ZmCYP71Z18，pLife33：ZmAN2，pLife33：ZmKSL4。玉米多拉拉列辛通路基因的全长原生序列用于二元T-DNA载体pLife3341，具有卡那霉素耐药性，在大肠杆菌和A.tumefaciens中繁殖。上游三烯体通路基因的共同表达是可选的，因为前体二磷酸盐是内生形成的N.benthamiana。然而，一些研究已经成功地采用这些方法，以增加在N.本塔米亚纳14，36，41的二苯甲苯形成。如图3所示，共表达成功地产生了多拉布拉迪烯和15，16-环氧二苯丙烯。与大肠杆菌中的酶共表达不同，在代谢物提取物中未检测到15，16-环氧二甲苯酚。
叶提取物中15，16-环氧多烯的存在表明CYP71Z18在N.benthamiana的活性。由于15，16-环氧多拉他醇在从微生物培养物中萃取后稳定（图3），以及从玉米根组织分离后，在以前的研究中，似乎似乎羟基化产物是糖基化通过内源性糖基转移酶，随后在真空中隔离，使其无法用此处用于提取的有机溶剂混合物进行提取 36、43、44、45 ， 46.在以前的研究中，类似的不受欢迎的产品修改在N.benthamiana的通路工程中已经报道。如大肠杆菌中的共表达所示，N.benthamiana中的瞬态表达导致提取了几种副产品，包括基于参考质量光谱数据库比较的不同链长度的线性烷。从叶材料中提取的复合定子平均为2.4 +/- 0.5毫克多拉比拉酮和0.9+/- 0.3毫克15，16-环氧二苯丙烯每克干叶组织。鉴于不同的实验设置，这些定子不能直接与大肠杆菌共同表达系统进行比较。
二苯并苯纯化 使用硅柱色谱法和随后的半预化HPLC实现了二苯基苯甲酸化合物纯化。使用二氧化硅柱色谱法纯化了12L池大肠杆菌培养物的代谢物提取物，以分离三种焦多拉拉列辛化合物（图3A）。硅色谱是实现目标化合物高纯度的理想选择，因为它能够简单分离二烯烯烃和含氧衍生物，并轻松去除主要污染物，氧化硅基质上保留的氧化烷（图 3A.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> 图1：大肠杆菌中二苯二烯类药物的生产工作流程，以及从液体细菌培养物中代谢物纯化的工作流程。虚线框表示需要额外纯化的可选步骤。（A） 使用分皮漏斗提取大肠杆菌培养物的代表图像.（B） 使用硅色谱法的代谢物提取物纯化的代表性图像。  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> 图2：本研究中使用的多拉布拉辛生物合成途径和基因结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> 图 3：GC-MS 结果。所示是使用酶co表达测定在大肠杆菌和（B）N.本查米亚纳中获得的纯化二苯甲苯类产品的代表性GC-MS色谱图。产品识别基于与美国国家标准与技术研究院 （NIST） 质量光谱库的真实标准和参考质谱的比较。1、牛耳;2、蛋白二苯甲醚5甲醛;3、皮罗洛[1，2-a_pyrazine-1，4-二酮，六氢-3-（2-甲基丙基）-;4、6-O-乙酰-1-[4-溴化物]-d-葡胶面S，S-二分;5、多拉拉迪尼;6， 15，16-环氧二苯丙烯;7、皮罗洛[1，2-a_pyrazine-1，4-二烯，六氢-3-（苯甲基）-;8， 15，16-环氧多拉他醇;9 和 12，未知;10、氯霉素;11， 3，7，11，15-四甲基-2-六十二十二丁基-1-醇;13-16，烷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> 图4：N.本巴米亚纳的二苯胺生产。（A） 在修剪前，从叶材料中生产二苯甲酸盐和从叶材料中纯化代谢物的工作流程. （B） N. 本特哈米亚纳植物的代表性图像，准备进行渗透实验，然后再修剪。（C） 修剪后N.本查米亚纳植物的代表图像.（D） 注射器渗透的叶子的图像.较暗的地区已被渗透。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

在这里，我们提出了易于使用的协议，通过大肠杆菌或尼科蒂亚纳本塔米亚中的生物合成酶的组合表达来生产和纯化二苯基代谢物，然后是色谱产物净化。由此产生的代谢物适用于各种研究，包括分子结构表征、酶功能研究和生物活性测定。

一种可定制的酶化生产与纯化天然产物的方法

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

该协议适用于生产纯化二肽，可用于不同的下游分析，并可针对一系列不同的代谢物目标进行定制。这种方法的主要优点是，它是一种简单而廉价的方法来生产微量的专用代谢物。通过交换用于共同表达的基因和酶，可以修改这种方法来产生其他三叶草，包括单肽和四叶草，以及其他代谢物类，如黄酮类。对于二肽代谢的产生和转化，首先在冰上加热化学上称职的大肠杆菌细胞。培养体解冻后，将每个构造的25微升称称细胞添加到冰冷的1.5毫升微管中，并添加1微升，每个微升溶液100毫微克用于共同表达。在冰上孵育混合物30分钟，每10分钟轻轻混合一次，将管子刮过微管架。在孵育结束时，热能使细胞混合物在42摄氏度下冲击一分钟，然后将细胞放回冰上至少两分钟。接下来，在管中加入200微升37摄氏度的SSC介质。在37摄氏度和每分钟200次旋转下孵育培养素一小时。在孵育结束时，将大约10个自功能化玻璃珠和100微升细胞加入一个37摄氏度的温化乳糖汤加糖板，并加入适当的抗生素。水平摇动板，盖到位，均匀分布细胞。然后，轻轻将玻璃珠敲击到废容器中，在37摄氏度下孵育板，将表面涂层朝下。第二天，从培养箱中取出盘子。将 5 毫升新鲜准备好的利原汤培养基与适当的抗生素添加到一个 15 毫升无菌玻璃管中，每计划 1 升培养培养的塑料可呼吸盖，并使用移液尖端从阿加板中挑选个别转化的 E.Coli 菌落。在每个准备好的 15 毫升管中加入一个采摘的菌落，并用随附的透气塑料盖盖住每个管。然后，将盖有盖的大肠杆菌小培养物放在37摄氏度的震动培养箱中，12至24小时。第二天，用适当的抗生素将100毫升的10x PBS添加到900毫升的特好肉汤中。将烧瓶在摄氏37度，每分钟旋转140次，约30分钟。当了不起的肉汤是温暖的，添加整个5毫升体积每个接种文化到一个1升文化烧瓶每个培养。将烧瓶以每分钟 140 次旋转的速度放在摇培养箱中，约 3 小时。当 600 纳米的光学密度达到 0.6 时，将孵化器的温度降至 16 摄氏度。一旦孵化器冷却，加入1毫升一摩尔IPTG，1毫升新鲜准备4克每升核黄素和1毫升新鲜准备150克每升氨基。对于二甲酮生产，在每个培养中加入25毫升的一个摩尔丙酮钠，以确保足够的前体形成。然后，在16摄氏度和每分钟140次旋转下孵育培养物72小时，每天向适当的培养物中添加25毫升的丙酮钠。对于代谢物分离和纯化，请将分离漏斗固定到烟罩中的环支架上。在漏斗下放置一个废物容器。将500毫升的50/50乙酸乙酸乙酯和六烷溶液倒入分离漏斗中。并将500毫升的转化大肠杆菌共表达文化添加到漏斗中。将玻璃塞放在漏斗上，摇动漏斗 5 到 10 次，将培养与萃取溶剂混合，在漏斗倒置时经常打开吸气管，并将其指向烟罩中，以解气。在第二轮摇晃和脱气后，正如刚刚展示的，将漏斗直立在环支架中约一分钟。当顶部溶剂层与水培养层分离时，拆下塞子并将大肠杆菌层排入废杯中，将溶剂层保留在漏斗内。然后，使用用于首次萃取的相同 500 毫升溶剂，用培养物的剩余 500 毫升重复萃取，然后将含有萃取代谢物的溶剂排入干净的烧瓶中。在这里，我们具有代表性的气相色谱-质谱色谱色谱仪的典型萃取酶产品显示。通常观察到的次要副产品包括氯霉素和丁二烯衍生物奥辛多勒和二甲苯甲醛。通过二氧化硅柱色谱进行二甲酮纯化后，可获得三种多布拉莱辛化合物，根据使用二甲醇的标准曲线进行量化。硅色谱是实现目标化合物高纯度的的理想之选。由于它使二分烯烃和含氧衍生物的简单制备，并容易去除主要污染的二氧化二氮，这是保留在二氧化硅基质上。此外，三叶草通路基因的共表达可用于在N.Benthamiana生产二肽，从而产生多拉布拉丁和15，16环氧二甲苯。萃取过程中使用的溶剂应针对感兴趣的代谢物的物理化学性质进行优化，不得与水混合以保持两个不同的层。按照这个程序，纯化代谢物可用于下游分析，包括结构分析和抗生素酸。这项技术使得发现了新的二肽，包括这里显示的二肽，使得这些代谢物能够被分析为它们的化学结构和新的双活性。在分离漏斗中使用有机溶剂时，应采取预防措施。请务必按照实验室安全标准处理生物废物。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

从外膜囊泡内蛋白质导演包装<em&gt;大肠杆菌</em&gt;：设计，生产和纯化

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

科研

生物化学

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

快速一步酶法合成海藻糖类似物的全净化水

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

可逆二硫键交联胶束生产的简便和有效途径

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

实验室规模的生产和治疗性抗体的纯化

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

巨囊泡封装微球通过一个水包油乳液的离心制备

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

大肠癌细胞中磷酸化和微管结合与 Tau 蛋白定位的测定

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

化学感受器配体结合域的高效复用与纯化方法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

光谱分析 TRPV1 的纯化与重构

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...