Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Vi anerkender taknemmeligt Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for at levere de pIRS og pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiel støtte til dette arbejde af NSF Plant-Biotic interaktioner program (Grant # 1758976 til P.Z.), DOE Early karriere Research program (Grant # DE-SC0019178 til P.Z.), DOE joint Genome Institute community Science program (Grant # CSP2568 til P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Deans mentorordning Award Fellowship (til K.M.M.) er taknemmeligt anerkendt.

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Bredere undersøgelse og anvendelse af isomere naturlige produkter nødvendiggør enkle, billige protokoller til at syntetisere og rense tilstrækkelige mængder af ønskede forbindelser. Den hurtige stigning i antallet af tilgængelige diterpenoid-metaboliske enzymer fra en bred vifte af arter giver nu en ekspansiv opgørelse for den enzymatiske produktion af diterpenoider ved hjælp af mikrobielle og plantebaserede værtssystemer. Derudover gør den modulære arkitektur af mange diterpenoide veje det muligt at bruge enzymer fra samme eller forskellige arter i ' plug & play ' kombinatoriske ingeniør tilgange til at generere en række naturlige og nye naturlignende isomere natur produkter2,14,26,35.
E. coli er en foretrukken mikrobiel vært for naturligt produkt biosyntese på grund af sin robusthed, lethed af skalerbarhed, begrænset kemisk kompleksitet for reduceret biprodukt forurening, og den rigdom af tilgængelige værktøjer til DNA-samling og udtryk Optimering. Det er vores erfaring, at platformen beskrevet her er velegnet til fremstilling af produkt udbytter på op til flere hundrede mg diterpenforbindelser olefiner og alkoholer, som er egnet til mange downstream-anvendelser, herunder dem, der foreslås her. Selv om det ikke opfylder industriel skala, kan den produktionsplatform, der er beskrevet her, fungere som et fundament for yderligere pathway, Host og fermenterings optimering, som det med succes er påvist for beslægtede diterpenoider som taxadien og sclareol33 ,34. Over-ekspression af rate-begrænsende MVA eller MEP pathway gener er blevet etableret med succes for at overvinde udbytte-begrænsende faktorer for isomere biosyntese, såsom utilstrækkelig forløber levering og forløber flux i konkurrerende veje13, 32,33,39. Selvom bevist succes i flere undersøgelser, dårlig ekspression og katalytisk aktivitet af terpenoid-metaboliske eukaryote P450s og andre membran-bundne enzymer i E. coli er en sandsynlig begrænsende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Brug af codon-optimerede sekvenser og protein modifikationer, såsom fjernelse af endoplasmatiske reticulum signal peptid eller indførelse af et plastidial signal peptid, har vist sig nyttigt at øge opløseligt P450-udtryk14,38 ,49,50,53. Sådanne ændringer var også anvendt til det mikrobielle Co-ekspression af majs CYP71Z1839 , der anvendes som et eksempel på en vej i denne undersøgelse. De beskrevne protokoller er baseret på anvendelse af plasmider, der transporterer et eller to gener pr. konstruktion, alt sammen under den samme inducerbare promotor. Hvor der ønskes større gene kombinationer, er det tilrådeligt at bruge forskellige tilgængelige multi-gen-kassetter eller genstablings systemer for at afbøde reduceret Transformations effektivitet og vækst i kulturen på grund af brugen af flere plasmider og antibiotika13 .
Med den bredere tilgængelighed af genetik og genomforskning ressourcer, anlæg værtssystemer også bliver stadig mere egnet til fremstilling af naturlige produkter. Fordele omfatter evnen af planter til at producere de nødvendige naturlige prækursorer drives af fotosyntese, dermed muliggør produkt dannelse uden behov for at supplere prækursorer molekyler54,55. N. benthamiana anvendes allerede i vid udstrækning til in vivo funktionel karakterisering og kombinatorisk ekspression af terpenoid og andre naturlige produkt veje14,35,36,40 . Bemærkelsesværdige fordele ved at bruge N. benthamiana som værtssystem omfatter den endogene produktion af diterpenoide prækursorer, brug af indfødte gensekvenser, forenklet ekspression af eukaryote P450s, let kombinatorisk gen-transformation (som separate antibiotika er ikke påkrævet for forbigående Co-transformation), og enkel ekstraktion af målprodukter fra blad materiale. Hvor det er nødvendigt, kan isomere produktion forbedres gennem Co-ekspression af centrale MEP-pathway gener for at øge prækursorer36,41. Begrænsninger for skalerbar isomere produktion i N. benthamiana er mere komplekse sammenlignet med flydende mikrobielle kulturer på grund af behovet for at generere tilstrækkelig plantebiomasse, mere arbejdskraftintensiv produkt rensning fra kemisk komplekse plante væv, og mulig uønsket metabolisering af målprodukter gennem, for eksempel, oxidation, glykosylering eller defosforylering af endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Men, denne procedure kan skaleres op til mg produktmængder ved at øge antallet af planter, der anvendes til agroinfiltration56.
De produkt ekstraktions-og rensnings protokoller, der er beskrevet her, er kompatible med E. coli og N. benthamianasamt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle værtssystemer og giver en omkostningseffektiv tilgang, der er let at oprettet i både biologi og kemilaboratorier og kræver ikke dyre rensningsanlæg. Metabolitten ekstraktion ved hjælp af en skilletragt er velegnet til effektiv ekstraktion og faseadskillelse før kromatografisk rensning. Tragt størrelser kan let justeres for at give mulighed for større kultur mængder og reducere eksperimentel tid, der kræves for at udtrække fra store kulturer. Vi fandt brugen af en hexan/ethylacetat gradient til at være ideel til udvinding diterpenoider af forskellig polaritet som påvist her for gruppen af dolabralexiner, der omfatter både kulbrinte og oxygenerede forbindelser (figur 3). Afhængigt af egenskaberne for målprodukterne kan andre opløsnings blandinger være fordelagtige. Opløsningsmidler må dog ikke være blandbare med vand for at sikre en vellykket ekstraktion og faseadskillelse ved hjælp af den separatoriske tragt teknik. Desuden skal der tages hensyn til produkttab ved fordampning ved anvendelse af denne metode til fremstilling af flygtige organiske forbindelser (VOC), såsom lavmolekylære mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografisk adskillelse af diterpenoider af forskellige niveauer af iltning ved hjælp af en større skala (~ 2 L) silica kolonne har været fordelagtigt i vores erfaring, da det giver forbedret produkt adskillelse og minimerer behovet for iterativ rensning trin, når du bruger mindre kolonne volumener. Kolonne volumener og matricer kan justeres efter behov for den ønskede kultur mængde og typen af naturprodukt. Renheden af målprodukter, der kan opnås ved hjælp af denne protokol, er velegnet til mange downstream-anvendelser, såsom bioaktivitets analyser eller til brug i enzym aktivitetsanalyse. Hvis der er behov for højere renhedsgrad, såsom strukturelle analyser via NMR, kan produktets renhed dog forbedres effektivt ved yderligere rensning ved hjælp af (semi) præparativ HPLC.
Denne protokol, der er beskrevet her, er blevet optimeret til produktion af isomere naturlige produkter, men kan også let tilpasses til beslægtede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produktklasser blot ved at generere det ønskede enzym moduler til kombinatorisk udtryk14,57. Der skal dog tages hensyn til ændringer af procedurerne for produkt udvinding og-rensning for forbindelser med større volatilitet, såsom mono-og sesqui-terpenoider, eller højere polaritet og funktionel modifikation som eksemplificeret ved glykosylering af mange triterpenoider, phenylpropanoider og andre naturlige produktklasser.
Selv om industrielle platforme til fremstilling af naturlige produkter er tilgængelige, de protokoller, der er beskrevet her, tilbyder et billigt, tilpasselig værktøj, som let kan oprettes i de fleste laboratorier. Som det fremgår af produktionen af majs dolabralexiner her og andetsteds39, er de produktmængder og den renhed, der kan opnås ved hjælp af denne metode, typisk tilstrækkelige til at lette forskellige downstream-analyser og-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, forskellige bioaktivitets undersøgelser, analyse af interaktioner mellem organismer, samt til anvendelse som enzym substrater eller som udgangsmateriale til semi-syntese tilgange.

Diterpenoider omfatter en kemisk forskelligartet gruppe på mere end 12.000 overvejende polycykliske 20-kulstof naturprodukter, der spiller en kritisk rolle i mange organismer1. Svampe og planter producerer den største mangfoldighed af diterpenoider, men bakterier har også vist sig at danne bioaktive diterpenoider (Se anmeldelser2,3,4,5). Diterpenoider har rødder i deres enorme strukturelle mangfoldighed og tjener et væld af biologiske funktioner. Et par diterpenoider, såsom Gibberellin væksthormoner, har væsentlige funktioner i udviklingsmæssige processer5. Men de fleste diterpenoider tjener som mæglere i kemisk forsvar og interorganismal interaktioner. Blandt disse er diterpenharpiks syrer i skadedyrs-og patogen forsvaret af nåletræer og artsspecifikke blandinger af antimikrobielle diterpenoider i større fødevareafgrøder såsom majs (Zea mays) og ris (Oryza sativa) i vid udstrækning blevet har studeret6,7. Disse bioaktiviteter giver en rig kemisk repository til kommercielle applikationer, og vælg diterpenoider anvendes som vigtige lægemidler, tilsætningsstoffer, klæbemidler, og andre bioprodukter i hverdagen moderne liv8,9 ,10. For at fremme forskningen i diterpenoider ' naturlige mangfoldighed og biologiske funktioner og i sidste ende promovere bredere kommercielle anvendelser er det nødvendigt med værktøjer til omkostningseffektiv tilberedning af rene forbindelser. Storstilet isolation fra plantemateriale er blevet etableret for nogle få isomere bioprodukter, såsom diterpenforbindelser harpikssyrer, der produceres som et biprodukt af papirmasse-og papirindustrien8. Akkumulering af diterpenoider i kun specifikke væv og under stram regulering af miljømæssige stimuli begrænser imidlertid ofte isolering af tilstrækkelige produktmængder fra den naturlige producent2. Desuden hæmmer den strukturelle kompleksitet af diterpenoider deres produktion gennem kemisk syntese, selv om sådanne tilgange har været vellykkede i flere tilfælde11,12. Med tilgængeligheden af avancerede genomiske og biokemiske teknologier har enzymatiske produktionsplatforme fået stigende opmærksomhed for at producere en række isomere forbindelser (Se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).
Alle terpenoider, herunder diterpenoider, er afledt af to isomeriske isoprenoide prækursorer, isopentenyldiphosphat (IPP) og dimethylallyldiphosphat (DMAPP)19 , der til gengæld dannes gennem mevalonat (MVA) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) pathway. Terpenoid biosyntese fortsætter gennem MEP-stien i bakterier og MVA-vejen i svampe, hvorimod planterne besidder en cytosolisk MVA og en plastidial MEP-pathway, hvor sidstnævnte er den primære vej mod isomere dannelse20. Kondensation af IPP og DMAPP ved prenyl transferaser giver den centrale 20-Carbon forløber til alle diterpenoider, geranylgeranyl diphosphat (GGPP)20. Downstream af ggpp formation, to enzym familier, terpen synthaser (tpss) og cytochrom P450 monooxygenaser (P450s) stort set kontrollere dannelsen af den store kemiske mangfoldighed af terpenoid metabolisme21,22. Diterpenforbindelser synthases (ditpss) katalyserer den engagerede kulhydrat-drevne cyklisering og omorganisering af ggpp til dannelse af forskellige stereo specifikke bi-, poly-eller makrocykliske diterpenstilladser1,3,23, 24. Iltning og yderligere funktionel dekoration af disse stilladser er derefter lettet af P450 enzymer og vælge andre enzym familier22,25. TPSs og P450s findes almindeligvis som artsspecifikke, multi-gene familier, der kan danne modulære biosyntetiske netværk, hvor kombinationen af forskellige enzym moduler langs en fælles plan muliggør dannelsen af en bred vifte af forbindelser2, 26. den hurtige opdagelse af funktionelt adskilte enzymer, der opererer i modulære terpenoide veje i de seneste år, har givet udvidede muligheder for deres anvendelse som en alsidig Reservedelsliste til metabolisk manipulation af delvise eller komplette veje i både mikrobielle og plantebaserede produktionsplatforme. For eksempel, gær (Saccharomyces cerevisiae) er blevet anvendt med succes til at ingeniør multi-enzym veje til fremstilling af terpenoid bioprodukter, såsom malaria medicin artemisinin27, sesquiterpenoid biobrændstoffer bisabolene og farnesen28, men også vælge diterpenoider29,30,31. Ligeledes er der konstrueret Escherichia coli -platforme til industriel fremstilling for nogle få isomere-metabolitter, herunder taxolprækursor taxadien, der anvendes som et anti-cancer-lægemiddel, og diterpen-alkoholen, sclareol , der anvendes i duft industrien13,32,33,34. Fremskridt inden for genteknologi og Transformations teknologier har også gjort plante værtssystemer stadig mere levedygtige til produktion af plante naturprodukter9,14,35,36. Især den tætte tobak relative, Nicotiana benthamiana, er blevet et meget anvendt chassis til terpenoid pathway analyse og ingeniørarbejde, på grund af den lethed af Agrobacterium-medieret omdannelse af flere gene kombinationer , effektiv biosyntese af endogene prækursorer og høj biomasse14,35,36.
Tegning på disse etablerede platforme for terpenoid biosyntese, vi beskriver her let at bruge og omkostningseffektive metoder til enzymatisk produktion af diterpenoider og oprensning af enkelte forbindelser. De præsenterede protokoller illustrerer, hvordan E. coli og N. benthamiana platforme udviklet til forbedret isomere forløber biosyntese kan udnyttes til kombinatorisk ekspression af forskellige ditpss og P450 enzymer til at generere ønskede isomere-forbindelser. Anvendelsen af denne protokol til at fremstille og rense strukturelt forskellige diterpenoider er vist ved eksempel på specialiserede diterpenoider fra majs (Zea mays), kaldet dolabralexiner, endogene biosyntese, hvoraf rekrutter to ditps og en P450 Enzym. Rensning af forskellige dolabralexiner, der spænder fra olefiner til oxygenholdige derivater, opnås derefter ved at kombinere separatoriske tragt ekstraktion med stor skala silica-kolonne kromatografi og præparativ højtryksvæskekromatografi (HPLC). De beskrevne protokoller er optimeret til produktion af diterpenoider, men kan også let tilpasses til relaterede terpenoid klasser, samt andre naturlige produkter, for hvilke enzym ressourcer er til rådighed. Forbindelser fremstillet ved hjælp af denne metode er velegnede til forskellige downstream-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, strukturel karakterisering via nuklear magnetisk resonans (NMR) analyse, anvendelse som substrater for enzym funktionelle undersøgelser og en række Bioaktivitet assays.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoider danner en mangfoldig klasse af små molekyle naturlige produkter, der er bredt fordelt på tværs af livets riger og har kritiske biologiske funktioner i udviklingsmæssige processer, interorganismal interaktioner, og miljøtilpasning. På grund af disse forskellige bioaktiviteter er mange diterpenoider også af økonomisk betydning som lægemidler, fødevaretilsætningsstoffer, biobrændstoffer og andre bioprodukter. Avancerede genomforskning og biokemiske tilgange har muliggjort en hurtig stigning i kendskabet til diterpenoid-metaboliske gener, enzymer, og veje. Men den strukturelle kompleksitet af diterpenoider og den snævre taksonomiske fordeling af individuelle forbindelser i ofte kun en enkelt art er fortsat begrænsende faktorer for deres effektive produktion. Tilgængeligheden af en bredere vifte af metaboliske enzymer giver nu ressourcer til at producere diterpenoider i tilstrækkelige titre og renhed for at lette en dybere undersøgelse af denne vigtige metabolit gruppe. Ved at trække på etablerede værktøjer til mikrobielt og plantebaseret enzym-Co-ekspression præsenterer vi en let betjent og tilpasselig protokol til enzymatisk produktion af diterpenoider i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensning af ønskede produkter via silica-kromatografi og semi-præparativ HPLC. Ved hjælp af gruppen af majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoider som et eksempel, vi fremhæver, hvordan modulære kombinationer af diterpenforbindelser syntase (ditps) og cytochrom P450 oxygenase (P450) enzymer kan bruges til at generere forskellige isomere stilladser. Rensede forbindelser kan anvendes i forskellige downstream-applikationer, såsom metabolit strukturelle analyser, enzym struktur-funktion undersøgelser, og in vitro og i planta Bioaktivitet eksperimenter.

Skematisk arbejdsgang for isomere-produktion med E. coli Figur 1 illustrerer den beskrevne arbejdsgang for isomere produktion. Den protokol, der er skitseret her, er blevet tilpasset fra en tidligere beskrevet E. coli platform for isomere biosyntese13,32 for brug af større volumen kulturer og rensning af ønskede isomere produkter via silica Kromatografi. For at demonstrere brugen af denne protokol brugte vi en nyligt identificeret dolabralexin-vej fra majs, der består af to diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) og ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multifunktionel P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) og en cytochrom P450 reduktase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). Kort fortalt blev E. coli BL21DE3-C41 kompetente celler præ-omdannet med pcdfduet: IRS og pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmider13,32. Pcdfduet: IRS plasmid indeholder nøgle enzymer til produktion af isomere prækursorer, herunder 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat syntase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfat reduktase (DXR) og isopentenyldiphosphat-isomeriase (Idi) og viste sig at øge isomere dannelse i E. coli13. PACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmid indeholder majs-copalyldifosfat syntase ZmAN2 og en ggpp-syntase fra Abies Grandis. Enzymer katalyserer de engagerede reaktioner i dolabralexin biosyntesen blev derefter Co-omdannet som plasmider pET28b: ZmKSL4 og petduet: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. For detaljer om sekvenser og plasmid konstruktioner Se Mafu et al. 201839.
Et GC-MS-kromatogram af de ekstraherede Enzymprodukter er vist i figur 3a, der illustrerer dannelsen af tre dolabralexin-forbindelser, nemlig dolabradien (1,2 ± 0,25 mg/l kultur), epoxydolabren (0,65 ± 0,2 mg/l kultur) og epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L kultur) som kvantificeret på basis af en standardkurve med isomere sclareol. Sclareol blev anvendt som referencestandard på grund af sin lignende struktur og kemiske egenskaber sammenlignet med dolabralexins. Typisk observerede mindre biprodukter omfatter chloramphenicol, indol derivater oxindol og indol-5-aldehyd, og prækursor geranylgeranyl diphosphat (GGPP) (figur 3). Indole repræsenterer almindeligvis det primære biprodukt, men vises ikke her, da opbevaringstiden er kortere end den indstillede solvens forsinkelse på 7 minutter for at bevare GC-MS-instrumentets integritet.
Skematisk arbejdsgang for isomere produktion med N. benthamiana Figur 4 viser en oversigt over ekspression af dolabralexin-vejen i N. benthamiana. For de produkter, der er beskrevet her, blev følgende konstruktioner omdannet separat til A. tumefaciens Strain GV3101: pLife33: P19 (der udtrykker det P19 genhæmmende suppressor-protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Fuld længde indfødte sekvenser af majs dolabralexin pathway gener blev brugt i den binære T-DNA vektor pLife3341 med kanamycin resistens for formering i E. coli og A. tumefaciens. Co-ekspression af upstream terpenoid pathway gener er valgfri, da prækursor geranylgeranyl diphosphat er endogent dannet i N. benthamiana. Men, flere undersøgelser har med held ansat sådanne tilgange til at øge isomere dannelse i N. benthamiana14,36,41. Som illustreret i figur 3producerede Co-Expression med succes dolabradiene og 15, 16-epoxydolabrene. I modsætning til enzym-Co-ekspression i E. coliblev der ikke påvist 15, 16-epoxydolabranol i metabolitten ekstrakter.
Tilstedeværelse af 15, 16-epoxydolabrene i blad ekstrakter viste aktiviteten af CYP71Z18 i N. benthamiana. Da 15, 16-epoxydolabranol viste sig at være stabilt efter ekstraktion fra mikrobielle kulturer (figur 3) samt efter isolering fra majs rodvæv i tidligere undersøgelser39, forekommer det plausibelt, at det hydroxylerede produkt er glykosyleret af endogene glycosyltransferaser og efterfølgende afsondret i vakuole, hvilket gør det utilgængelige for ekstraktion med de organiske opløsningsmidler blandinger, der anvendes her til ekstraktion36,43,44,45 ,46. Lignende uønskede produktændringer i forbindelse med pathway Engineering i N. benthamiana er blevet rapporteret i tidligere undersøgelser47. Som vist for Co-ekspression i E. coliresulterer forbigående ekspression i N. benthamiana i udvinding af flere biprodukter, herunder lineære alkaner af forskellig kædelængde som baseret på sammenligning med reference massespektrdata baser. Sammensatte titre ekstraheret fra blad materiale fandtes at være i gennemsnit 2,4 +/-0,5 mg dolabradien og 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene pr g tørt blad væv. Disse titre kan ikke sammenlignes direkte med E. coli -co-Expression-systemet i betragtning af de forskellige eksperimentelle opsætninger.
Diterpenoid rensning Diterpenoid oprensning blev opnået ved anvendelse af silica-kolonne kromatografi og efterfølgende semi-præparativ HPLC. Metabolit ekstrakter fra 12 L af poolede E. coli -kulturer blev renset ved hjælp af silica-kolonne kromatografi for at adskille de tre fokale dolabralexin-forbindelser (figur 3a). Silica kromatografi er ideel til opnåelse af høj renhed af målforbindelserne, da det muliggør enkel adskillelse af diterpenolefiner og oxygenerede derivater, og fjerner let det største forurenende stof, oxindol, som bevares på silicagmatricen ( Figur 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figur 1: workflow for isomere produktion i E. coli og metabolit rensning fra flydende bakterielle kulturer. Stiplede felter viser valgfrie trin, hvor yderligere rensning er påkrævet. A) repræsentativt billede af den ekstraherede E. coli -kultur ved hjælp af en skilletragt. (B) repræsentativt billede af metabolitten ekstrakt rensning ved hjælp af silica kromatografi.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figur 2: Dolabralexin biosyntetisk vej og genkonstruktioner, der anvendes i dette studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figur 3: GC-MS-resultater. Er repræsentative GC-MS-kromatogrammer af rensede diterpenoide produkter, der er fremstillet ved hjælp af enzym Co-Expression assays i (A) E. coli og (B) N. benthamiana. Produkt identifikationer er baseret på sammenligninger med autentiske standarder og reference massespektre fra National Institute of Standards and Technology (NIST) Mass spektral Library. 1, oxindol; 2, indol-5-aldehyd; 3, pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] thio]-a-d-glucosid S, S-dioxid; 5, dolabradien; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pyrazine-1, 4-Dione, hexahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 og 12, ukendt; 10, chloramphenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figur 4: Diterpenoid-produktion i N. benthamiana. (A) arbejdsgangen for isomere produktion i N. benthamiana og metabolit rensning fra blad materiale. B) repræsentativt billede af n. benthamiana -planter klar til infiltration eksperimenter, før beskæring. C) repræsentative billeder af planter af N. benthamiana efter beskæring. (D) billede af sprøjte infiltrerede blade. Mørkere områder er blevet infiltreret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Her præsenterer vi let at bruge protokoller til fremstilling og rensning af isomere metabolitter gennem kombinatorisk ekspression af biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, efterfulgt af kromatografisk produkt Rensning. De resulterende metabolitter er egnede til forskellige undersøgelser, herunder molekylær struktur karakterisering, enzym funktionelle undersøgelser, og Bioaktivitet assays.

En tilpasselig tilgang til enzymatisk produktion og rensning af Diterpenoid naturprodukter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Denne protokol er velegnet til fremstilling af renset diterpenoids, der kan bruges til forskellige downstream analyse og kan tilpasses til en række forskellige metabolit mål. Den største fordel ved denne metode er det er en enkel og billig metode til at producere milligram mængder af specialiserede metabolitter. Ved at udveksle gener og enzymer, der anvendes til co-ekspression, kan denne metode ændres til at producere andre terpenoider, herunder monoterpenoider og sesquiterpenoids, samt andre metabolitklasser såsom flavonoider.For diterpenoid metabolisk produktion og transformation, begynde med opvarmning kemisk kompetente E.coli celler på is. Når kulturen er optøet, tilsættes 25 mikroliter af kompetente celler pr. konstruktion til en kølet 1,5 millilitermikrotube og der tilsættes 1 mikroliter af et 100 nanogram pr. mikroliteropløsning af hver konstruktion, der anvendes til co-expression. Inkuber blandingerne på is i 30 minutter med blid blanding hvert 10.Ved slutningen af inkubationen stød varmebestatorerne ved 42 grader celsius i et minut, før cellerne sættes tilbage på is i mindst to minutter mere. Dernæst tilsættes 200 mikroliter på 37 grader celsius SOC medium til rørene. Og inkuber kulturerne i en time ved 37 grader celsius og 200 rotationer i minuttet.Ved slutningen af inkubationen tilsættes ca. 10 autoklavede glasperler og 100 mikroliter af celler til en 37 grader celsius opvarmet lysogen bouillon agar plade med de relevante antibiotika. Og ryst pladen vandret med låget på plads for at fordele cellerne jævnt. Derefter skal du forsigtigt banke glasperlerne ind i en affaldsbeholder og inkubere pladen ved 37 grader celsius natten over, belagt overfladesiden nedad.Den næste dag, fjerne pladen fra inkubatoren. Tilsæt 5 milliliter frisklavet lysogen bouillon medium med de relevante antibiotika til en 15 milliliter sterilt glasrør med en plastik åndbar hætte pr planlagt 1 liters kultur, og bruge en pipet tip til at plukke individuelle omdannede E.Coli kolonier fra agar plade. Der tilsættes en plukket koloni til hver af de forberedte 15 milliliterrør, og hætten hvert rør med den medfølgende åndbare plasthætte.Derefter placeres de udjævnede E.coli små kulturer i en 37 grader celsius rystende inkubator i 12 til 24 timer. Den næste dag tilføje 100 milliliter 10x PBS til 900 milliliter af fantastisk bouillon i en 1 liters kolbe pr lille kultur med de relevante antibiotika. Og læg kolberne ved 37 grader celsius og 140 rotationer i minuttet i ca. 30 minutter.Når den fantastiske bouillon er varm, tilsæt hele 5 milliliter volumen af hver vaccination kultur til en 1 liters kultur kolbe pr kultur. Kolben anbringes i rystende inkubator ved 140 omdrejninger i minuttet i ca. 3 timer. Når den optiske tæthed ved 600 nanometer når 0,6, reducere temperaturen af inkubatoren til 16 grader celsius.Når inkubatoren er afkølet, tilsættes 1 milliliter en molar IPTG, 1 milliliter frisklavet 4 gram per liter riboflavin og 1 milliliter frisklavet 150 gram per liter aminolevulinic syre til hver kultur. Til diterpenoidproduktion tilsættes 25 milliliter en molar natriumpyruvat til hver kultur for at sikre en tilstrækkelig prækursordannelse. Derefter inkuberes kulturerne ved 16 grader celsius og 140 rotationer i minuttet i 72 timer, hvilket tilføjer 25 milliliter natriumpyruvat dagligt til de relevante kulturer.For metabolit separation og rensning, sikre en separatory tragt på en ring stativ i en røghætte. Og læg en affaldsbeholder under tragten. Hæld 500 milliliter af en 50/50 opløsning af ethylacetat og hexaner i separatory tragt.Og tilsæt 500 milliliter af den transformerede E.coli co-expression kultur af interesse i tragten. Anstævrglasproppen på tragten og ryst tragten 5 til 10 gange for at blande kulturen med ekstraktionsopløsningsmidlet, der ofte åbner studsen, mens tragten vender på hovedet, og ret den ind i røghætten for at afgase tragten. Efter en anden omgang rysten og afgasning som netop påvist, skal tragten være oprejst i ringstanden i ca. et minut.Når det øverste opløsningsmiddellag er adskilt fra det vandige kulturlag, fjernes proppen og e.coli-laget afspørkes i et affalds bægerglas, hvor opløsningsmiddellaget i tragten bevares. Ekstraktionen gentages derefter med de resterende 500 milliliter af kulturen med de samme 500 milliliter opløsningsmiddel, der anvendes til den første ekstraktion, før opløsningsmidlet, der indeholder de ekstraherede metabolitter, tømmes i en ren kolbe. Her vises vores repræsentative gaskromatografi-massespektrometrikromatogram af typiske ekstraherede enzymprodukter.Almindeligt observeret mindre biprodukter omfatter chloramphenicol og inddoliske derivater oxindole og indole pivalaldehyd. Efter diterpenoid rensning via silica kolonne kromatografi, tre dolabralexin forbindelser kan opnås, som kvantificeret baseret på en standard kurve ved hjælp af diterpenoid sclareol. Silica kromatografi er ideel til at opnå en høj renhed af målet forbindelser.Da det gør det muligt blot at forberede diterpen olefiner og iltede derivater og let fjerner de vigtigste forurenende oxindole, som bevares på silica matrix. Endvidere kan co-ekspression af terpenoid pathway gener bruges til at producere diterpenoids i N.Benthamiana, hvilket resulterer i produktion af dolabradiene og 15, 16 epoxydolabrene. De opløsningsmidler, der anvendes under ekstraktionen, skal optimeres til de fysiske kemiske egenskaber af de pågældende metabolitter og må ikke kunne blandes med vand for at opretholde to forskellige lag.Efter denne procedure, renset metabolitter kan anvendes til downstream analyse, herunder strukturel analyse og antibiotikasyrer. Denne teknik gjorde det muligt at opdage nye diterpenoider, herunder dem, der vises her, så disse metabolitter, der skal analyseres for deres kemiske struktur og nye biaktiviteter. Tag forholdsregler, når du bruger organiske opløsningsmidler i en separattragt.Sørg altid for at bortskaffe biologisk affald i henhold til dine sikkerhedsstandarder.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid Et-trins enzymatisk syntese og All-vandig Oprensning af trehalose Analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion og oprensning af et terapeutisk antistof

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Fremstilling af Giant vesikler indkapslende mikrosfærer ved centrifugering af en vand-i-olie-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilgang til oprensning af enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...