Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Wij erkennen Dr. Reuben Peters (Iowa State University, VS) voor het verstrekken van de pIRS en pGGxZmAN2 constructies. Financiële steun voor dit werk door de NSF plant-Biotic interactions programma (Grant # 1758976 tot P.Z.), het DOE Early Career research programma (Grant # DE-SC0019178 to P.Z.), het DOE joint Genoome Institute Community Science Program (Grant # CSP2568 to P.Z.), de NSF Graduate Research Fellowship Program (to K.M.M.) en een UC Davis dean's Mentorship Award Fellowship (to K.M.M.) worden dankbaar erkend.

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Breder onderzoek en toepassing van diterpenoid natuurlijke producten vereist eenvoudige, goedkope protocollen voor het synthetiseren en zuiveren van voldoende hoeveelheden van de gewenste verbindingen. De snelle toename van het aantal beschikbare diterpenoid-metabole enzymen uit een breed scala van soorten biedt nu een expansieve inventaris voor de enzymatische productie van diterpenoïden met behulp van microbiële en plantaardige hostsystemen. Daarnaast maakt de modulaire architectuur van veel diterpenoid trajecten het gebruik van enzymen van dezelfde of verschillende soorten in ' Plug & Play ' combinatorische technische benaderingen voor het genereren van een scala aan natuurlijke en nieuwe natuur-achtige diterpenoid natuurlijke producten2,14,26,35.
E. coli is een geprefereerde microbiële gastheer voor biosynthese van natuurlijke producten vanwege de robuustheid, het gemak van schaalbaarheid, beperkte chemische complexiteit voor verminderde bijproducten van het product en de rijkdom aan beschikbare hulpmiddelen voor DNA-assemblage en-expressie Optimalisatie. In onze ervaring is het hier beschreven platform zeer geschikt voor het produceren van product opbrengsten van maximaal enkele honderden mg diterpeen Olefins Polymers en alcoholen, wat geschikt is voor veel downstreamtoepassingen, waaronder die welke hier worden voorgesteld. Hoewel het niet voldoen aan industriële schaal, het productieplatform hier beschreven kan dienen als een basis voor verdere traject, gastheer, en fermentatie-optimalisatie zoals is met succes aangetoond voor gerelateerde diterpenoids zoals taxadiene en Sclareol33 ,34. Overmatige expressie van snelheids begrenzende MVA-of MEP-trajecten-genen is met succes vastgesteld om rendements beperkende factoren voor diterpenoid biosynthese te overwinnen, zoals een ontoereikende precursor-en precursor stroom in concurrerende trajecten13, 32,33,39. Hoewel bewezen succesvol in verschillende studies, slechte expressie en katalytische activiteit van Terpenoid-metabole eukaryotische P450s en andere membraan-gebonden enzymen in E. coli is een waarschijnlijke beperkende factor33,39 ,48,49,50,51,52. Gebruik van codon-geoptimaliseerde sequenties en eiwit modificaties, zoals het verwijderen van het endoplasmisch reticulum-signaal peptide of de introductie van een plastidial-signaal peptide, is nuttig gebleken om de oplosbare P450-expressie te verhogen14,38 ,49,50,53. Dergelijke wijzigingen werden ook toegepast voor de microbiële co-expressie van maïs CYP71Z1839 gebruikt als een voorbeeld traject in deze studie. De beschreven protocollen zijn gebaseerd op het gebruik van plasmiden die één of twee genen per constructie dragen, allemaal onder dezelfde, niet-induceerbaar promotor. Waar grotere gencombinaties gewenst zijn, is het raadzaam om verschillende beschikbare multi-Gene cassettes of genstacking systemen te gebruiken om de verminderde transformatie-efficiëntie en cultuur groei te verminderen door het gebruik van meerdere plasmiden en antibiotica13 .
Met de bredere beschikbaarheid van genetica en genomics middelen, worden plant host systemen ook steeds meer geschikt voor de vervaardiging van natuurlijke producten. Voordelen zijn onder andere het vermogen van planten om de vereiste natuurlijke precursoren te produceren die worden aangedreven door fotosynthese, waardoor product vorming mogelijk is zonder de noodzaak om precursor moleculen54,55aan te vullen. N. benthamiana wordt al veel gebruikt voor in vivo functionele karakterisering en combinatorische expressie van terpeen en andere natuurlijke product trajecten14,35,36,40 . Opmerkelijke voordelen van het gebruik van N. benthamiana als een gastheer systeem omvatten de endogene productie van diterpenoid precursoren, gebruik van inheemse genen sequenties, vereenvoudigde expressie van eukaryotische P450s, gemak van combinatorische gentransformatie (als afzonderlijke antibiotica zijn niet vereist voor voorbijgaande co-transformatie), en eenvoudige extractie van doel producten uit blad materiaal. Waar nodig kan de productie van diterpenoid worden verbeterd door middel van co-expressie van belangrijke MEP-traject genen om de precursor-aanvoer te verhogen36,41. Beperkingen voor schaalbare diterpenoid productie in N. benthamiana zijn complexer in vergelijking met vloeibare microbiële culturen als gevolg van de noodzaak voor het genereren van voldoende plant biomassa, meer arbeidsintensieve product zuivering van chemisch complexe plantenweefsel, en mogelijke ongewenste metabolization van doel producten door, bijvoorbeeld, oxidatie, glycosylatie of defosforylering door endogene enzymen36,43,44,45 ,46,47. Echter, deze procedure kan worden opgeschaald tot mg producthoeveelheden door het verhogen van het aantal planten gebruikt voor agroinfiltratie56.
De hier beschreven product extractie-en zuiverings protocollen zijn compatibel met E. coli en N. benthamiana, evenals S. cerevisiae en andere plantaardige of microbiële hostsystemen, en bieden een kostenefficiënte aanpak die gemakkelijk te opgezet in zowel biologie-als chemie laboratoria en vereist geen dure zuiverings apparatuur. De extractie van metabolieten met behulp van een scheitrechter is zeer geschikt voor efficiënte extractie en fasescheiding voorafgaand aan chromatografische zuivering. Trechter grootten kunnen gemakkelijk worden aangepast om grotere cultuur volumes mogelijk te maken en de experimentele tijd die nodig is om te extraheren uit grote culturen te verminderen. We vonden het gebruik van een hexaan/ethylacetaat gradiënt ideaal voor het extraheren van diterpenoïden van verschillende polariteit, zoals hier gedemonstreerd voor de groep van dolabralexinen die zowel koolwaterstof en zuurstofrijk verbindingen omvatten (Figuur 3). Afhankelijk van de eigenschappen van doel producten kunnen andere oplosmiddel mengsels voordelig zijn. Oplosmiddelen mogen echter niet mengbaar zijn met water om een succesvolle extractie en fasescheiding te garanderen met behulp van de separatory trechter techniek. Daarnaast moet rekening worden gehouden met productverlies door verdamping bij het gebruik van deze aanpak voor de productie van vluchtige organische stoffen (VOS), zoals mono-en SESQUI-terpenoïden met een lager molecuulgewicht en andere Vos. Chromatografische scheiding van diterpenoïden van verschillende niveaus van oxygenatie met behulp van een grotere schaal (~ 2 L) silica kolom is voordelig in onze ervaring, omdat het zorgt voor een verbeterde product scheiding en minimaliseert de noodzaak voor iteratieve zuivering stappen bij het gebruik van kleinere kolom volumes. Kolom volumes en matrices kunnen zo nodig worden aangepast voor het gewenste kweek volume en het type natuurproduct. De zuiverheid van doel producten die met dit protocol kan worden bereikt, is geschikt voor veel downstreamtoepassingen, zoals bioactiviteitentesten of voor gebruik in enzym activiteitsanalyses. Wanneer echter hogere zuiverheidsniveaus nodig zijn, zoals structurele analyses via NMR, kan de zuiverheid van het product efficiënt worden versterkt door extra zuivering met (semi)-preparatieve HPLC.
Dit protocol beschreven hier is geoptimaliseerd voor de productie van diterpenoid natuurlijke producten, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan verwante mono-, SESQUI-en Tri-terpenoïden, evenals andere natuurlijke productklassen gewoon door het genereren van het gewenste enzym modules voor combinatorische expressie14,57. Er moet echter rekening worden gehouden met wijzigingen in de procedures voor product extractie en-zuivering voor verbindingen met een hogere volatiliteit, zoals mono-en SESQUI-terpenoïden, of hogere polariteit en functionele modificatie zoals geïllustreerd door glycosylatie van vele triterpenoïden, fenylpropanoïden, en andere natuurlijke productklassen.
Hoewel industriële platforms voor de vervaardiging van natuurlijke producten beschikbaar zijn, bieden de hier beschreven protocollen een goedkoop, aanpasbaar hulpmiddel dat in de meeste laboratoria gemakkelijk kan worden opgezet. Zoals blijkt uit de productie van maïs dolabralexinen hier en elders39, zijn de producthoeveelheden en zuiverheid die met deze benadering kunnen worden bereikt, doorgaans voldoende om verschillende downstreamanalyses en toepassingen te faciliteren, waaronder, maar niet beperkt tot, verschillende bioactiviteitsonderzoeken, analyse van interacties tussen organismen, evenals voor gebruik als enzym substraten of als uitgangsmateriaal voor semi-synthese benaderingen.

Diterpenoids bestaat uit een chemisch diverse groep van meer dan 12.000 overwegend polycyclische 20-koolstof natuurlijke producten die een cruciale rol spelen in vele organismen1. Schimmels en planten produceren de grootste diversiteit van diterpenoïden, maar bacteriën hebben ook aangetoond dat ze bioactieve diterpenoïden vormen (Zie beoordelingen2,3,4,5). Geworteld in hun enorme structurele diversiteit, dienen diterpenoids een veelheid aan biologische functies. Een paar diterpenoids, zoals gibberellin groei hormonen, hebben essentiële functies in ontwikkelingsprocessen5. Echter, de meerderheid van diterpenoids dienen als bemiddelaar van chemische verdediging en interorganismale interacties. Onder deze, diterpeen harszuren in de plaag en pathogenen verdediging van naaldbomen en soortspecifieke mengsels van antimicrobiële diterpenoïden in grote voedselgewassen zoals maïs (Zea mays) en rijst (Oryza sativa) zijn het meest uitgebreid heeft6,7. Deze bioactiviteiten bieden een rijke chemische opslagplaats voor commerciële toepassingen, en selecteer diterpenoids worden gebruikt als belangrijke farmaceutische producten, levensmiddelenadditieven, lijmen, en andere Bioproducts van de dagelijkse moderne leven8,9 ,10. Om verder onderzoek te doen naar de natuurlijke diversiteit en biologische functies van diterpenoïden en uiteindelijk bredere commerciële toepassingen te bevorderen, zijn instrumenten nodig voor de kostenefficiënte bereiding van zuivere verbindingen. Grootschalige isolatie van plant materiaal is vastgesteld voor een paar diterpenoid Bioproducts, zoals diterpeen-harszuren die worden geproduceerd als bijproduct van de pulp-en papierindustrie8. Accumulatie van diterpenoïden in alleen specifieke weefsels en onder strakke regulering door milieu stimuli beperkt echter vaak de isolatie van voldoende producthoeveelheden van de natuurlijke producent2. Bovendien belemmert de structurele complexiteit van diterpenoids hun productie door middel van chemische synthese, hoewel dergelijke benaderingen in verschillende gevallen11,12succesvol zijn geweest. Met de beschikbaarheid van geavanceerde genomische en biochemische technologieën, hebben enzymatische productie platformen steeds meer aandacht gekregen voor het produceren van een reeks diterpenoid verbindingen (Zie beoordelingen13,14, 15,16,17,18).
Alle terpenen, met inbegrip van diterpenoïden, zijn afgeleid van twee isomere isoprenoid-precursoren, isopentenylpyrofosfaat-difosfaat (IPP) en dimethylallyldifosfaat (DMAPP)19 , die op hun beurt worden gevormd door het mevalonaat (MVA) of de methylerythritol-5-fosfaat (MEP) pathway. Terpenoid biosynthese verloopt via het MEP-traject in bacteriën en de MVA-route in schimmels, terwijl planten een cytosolische MVA en een plastidial MEP-traject bezitten, waarbij de laatste de primaire route is naar diterpenoid formatie20. Condensatie van IPP en DMAPP door prenyl-transferasen levert de centrale 20-koolstof precursor voor alle diterpenoïden, geranylgeranyl difosfaat (GGPP)20. Stroomafwaarts van de vorming van ggpp beheersen twee enzym families, terpeen synthases (tpss) en cytochroom P450 monooxygenasen (P450s) grotendeels de vorming van de enorme chemische diversiteit van terpeen metabolisme21,22. Diterpeen synthases (ditpss) katalyseert de betrokken carbocation-gestuurde cyclisering en herschikking van ggpp om verschillende stereospecifieke bi-, poly-of macro-cyclische diterpeen steigers te vormen1,3,23, 24. Oxygenatie en verdere functionele decoratie van deze steigers wordt vervolgens vergemakkelijkt door de P450-enzymen en selecteer andere enzym families22,25. TPSs en P450s bestaan gewoonlijk als soortspecifieke, multi-Gene families die modulaire biosynthetische netwerken kunnen vormen, waarbij het combineren van verschillende enzym modules langs een gemeenschappelijke blauwdruk de vorming van een breed scala aan verbindingen2mogelijk maakt, 26. de snelle ontdekking van functioneel verschillende enzymen die in de afgelopen jaren in modulaire terpeen trajecten werkzaam zijn, heeft de uitbreiding van de mogelijkheden voor het gebruik ervan als een veelzijdige onderdelenlijst voor metabole engineering van gedeeltelijke of volledige trajecten in zowel microbiële als plantaardige productie platformen. Bijvoorbeeld, gist (Saccharomyces cerevisiae) is toegepast met succes te ingenieur Multi-enzym trajecten voor de vervaardiging van terpeen Bioproducts, zoals de anti-malaria drug artemisinine27, de sesquiterpeen biobrandstoffen bisaboleen en farnesene28, maar ook selecteren diterpenoids29,30,31. Evenzo zijn Engineered Escherichia coli -platformen voor de vervaardiging op industriële schaal vastgesteld voor een paar diterpenoid metabolieten, waaronder de voorloper van taxol taxadiene die wordt gebruikt als anti-kanker medicijn en de diterpeen alcohol, Sclareol , gebruikt in de geur industrie13,32,33,34. Ook vooruitgang in genetische manipulatie en transformatietechnologieën hebben installaties voor de productie van plantaardige producten steeds levensvatbaar gemaakt voor het produceren van plantaardige natuurlijke produkten9,14,35,36. In het bijzonder, de nauwe tabak familielid, Nicotiana benthamiana, is uitgegroeid tot een veelgebruikte chassis voor terpeen pathway analyse en engineering, als gevolg van het gemak van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van meerdere gen combinaties , efficiënte biosynthese van endogene precursoren, en hoge biomassa14,35,36.
Tekening op deze gevestigde platforms voor terpeen biosynthese, beschrijven we hier eenvoudig te gebruiken en kostenefficiënte methoden voor de enzymatische productie van diterpenoids en de zuivering van enkelvoudige verbindingen. De gepresenteerde protocollen illustreren hoe E. coli en N. benthamiana platforms ontwikkeld voor verbeterde diterpenoid precursor biosynthese kan worden gebruikt voor de combinatorische uitdrukking van verschillende ditpss en P450 enzymen om te genereren gewenste diterpenoid verbindingen. Toepassing van dit protocol om structureel verschillende diterpenoïden te produceren en te zuiveren wordt aangetoond door een voorbeeld van gespecialiseerde diterpenoïden uit maïs (Zea mays), dolabralexinen genoemd, endogene biosynthese waarvan twee ditp's en een P450 Enzym. Zuivering van verschillende dolabralexines variërend van olefinen tot zuurstofrijk derivaten wordt vervolgens bereikt door het combineren van separatory trechter extractie met grootschalige silica Kolomchromatografie en preparatieve hogedrukvloeistof chromatografie (HPLC). De beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd voor de productie van diterpenoïden, maar kunnen ook gemakkelijk worden aangepast voor gerelateerde terpeen klassen, evenals andere natuurlijke producten waarvoor enzym bronnen beschikbaar zijn. Met deze aanpak geproduceerde verbindingen zijn geschikt voor verschillende downstreamtoepassingen, waaronder, maar niet beperkt tot, structurele karakterisering via nucleaire magnetische resonantie (NMR) analyse, gebruik als substraten voor enzym functionele studies en een reeks bioactiviteit assays.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoids vormen een gevarieerde klasse van kleine moleculen natuurlijke producten die op grote schaal verdeeld over de koninkrijken van het leven en hebben kritische biologische functies in ontwikkelingsprocessen, interorganismale interacties, en milieu-aanpassing. Door deze verschillende bioactiviteiten zijn veel diterpenoïden ook van economisch belang als farmaceutische producten, levensmiddelenadditieven, biobrandstoffen en andere bioproducten. Geavanceerde Genomics en biochemische benaderingen hebben gezorgd voor een snelle toename van de kennis van diterpenoid-metabole genen, enzymen en trajecten. De structurele complexiteit van diterpenoïden en de nauwe taxonomische verdeling van afzonderlijke verbindingen in vaak slechts één soort blijven echter de factoren voor hun efficiënte productie beperken. De beschikbaarheid van een breder scala van metabole enzymen biedt nu middelen voor het produceren van diterpenoïden in voldoende Antilichaamtiters en zuiverheid om een dieper onderzoek van deze belangrijke metaboliet groep mogelijk te maken. Op basis van gevestigde hulpmiddelen voor microbiële en plantaardige enzym co-expressie, presenteren wij een gemakkelijk bediend en aanpasbaar protocol voor de enzymatische productie van diterpenoïden in zowel Escherichia coli als Nicotiana benthamiana, en de zuivering van de gewenste producten via silica chromatografie en semi-preparatieve HPLC. Met behulp van de groep van maïs (Zea mays) dolabralexin diterpenoids als voorbeeld, we benadrukken hoe modulaire combinaties van diterpeen synthase (ditps) en cytochroom P450 monooxygenase (P450) enzymen kunnen worden gebruikt voor het genereren van verschillende diterpenoid steigers. Gezuiverde verbindingen kunnen worden gebruikt in verschillende downstream toepassingen, zoals structurele analyses van de metaboliet, enzym structuur-functie studies, en in vitro en in planta bioactiviteit experimenten.

Schematische workflow voor diterpenoid productie met behulp van E. coli Figuur 1 illustreert de beschreven workflow voor de productie van diterpenoid. Het hier beschreven protocol is aangepast van een eerder beschreven E. coli -platform voor diterpenoid biosynthese13,32 voor het gebruik van grotere culturen en zuivering van de gewenste diterpenoid producten via silica Chromatografie. Om het gebruik van dit protocol aan te tonen, gebruikten we een recent geïdentificeerde dolabralexin traject van maïs dat bestaat uit twee diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) en ZmKSL4 (Zm00001d032858), een multi-functioneel P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), en een cytochroom P450 reductase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figuur 2). In het kort werden E. coli BL21DE3-C41 competente cellen voorgetransformeerd met het pcdfduet: IRS en pacyc-duet: ggpps/ZmAN2 plasmiden13,32. Het pCDFDuet: IRS plasmide bevat belangrijke enzymen voor de productie van de voorloper van diterpenoid, waaronder 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfaat synthase (DXS), 1-deoxy-d-xylulose-5-fosfaat reductase (DXR), en isopentenylpyrofosfaat difosfaat isomerase (Idi), en bleek te verhogen diterpenoid vorming in E. coli13. Het pACYC-duet: GGPPS/ZmAN2 plasmide bevat de maïs ent-copalyl difosfaat synthase ZmAN2 en een ggpp synthase van Abies grandis. Enzymen die de betrokken reacties katalyseren in de biosynthese van dolabralexin werden vervolgens samen getransformeerd als plasmiden pET28b: ZmKSL4 en pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Voor details over sequenties en plasmide constructies Zie Mafu et al. 201839.
Een GC-MS chromatogram van de geëxtraheerde enzym producten wordt getoond in Figuur 3a, ter illustratie van de vorming van drie dolabralexin verbindingen, namelijk dolabradiene (1,2 ± 0,25 mg/l cultuur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l cultuur), en epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L cultuur), zoals gekwantificeerd op basis van een standaard curve met behulp van de diterpenoid Sclareol. Sclareol werd gebruikt als een referentie-standaard, als gevolg van de soortgelijke structuur en chemische eigenschappen in vergelijking met dolabralexins. Typisch waargenomen kleine bijproducten omvatten chlooramfenicol, de indoolderivaten oxindole en indool-5-aldehyde, en de precursor geranylgeranyl difosfaat (GGPP) (Figuur 3). Indool vertegenwoordigt meestal het primaire bijproduct, maar wordt hier niet weergegeven, vanwege de retentietijd korter dan de ingestelde oplosmiddel vertraging van 7 min om de integriteit van het GC-MS-instrument te behouden.
Schematische workflow van diterpenoid productie met behulp van N. benthamiana Figuur 4 toont een overzicht van de uitdrukking van het dolabralexin traject in N. benthamiana. Voor de hier beschreven producten werden de volgende constructies afzonderlijk omgezet in een. tumefaciens stam GV3101: pLife33: P19 (uitdrukken van het P19 gen uitschakeling eiwit), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Volledige lengte inheemse sequenties van de maïs dolabralexin pathway genen werden gebruikt in de binaire T-DNA vector pLife3341 met kanamycine resistentie voor vermeerdering in E. coli en A. tumefaciens. Co-expressie van upstream terpeen pathway genen is facultatief, aangezien de precursor geranylgeranyl difosfaat endogeen is gevormd in N. benthamiana. Echter, verschillende studies hebben met succes gebruikt dergelijke benaderingen te verhogen diterpenoid vorming in N. benthamiana14,36,41. Zoals geïllustreerd in Figuur 3, produceerde co-expressie met succes dolabradiene en 15, 16-epoxydolabrene. In tegenstelling tot enzym co-expressie in E. coli, is 15, 16-epoxydolabranol niet gedetecteerd in extracten van de metaboliet.
Aanwezigheid van 15, 16-epoxydolabrene in blad extracten demonstreerde de activiteit van CYP71Z18 in N. benthamiana. Aangezien 15, 16-epoxydolabranol bleek stabiel te zijn na extractie uit microbiële culturen (Figuur 3) en na isolatie van maïs wortel weefsels in eerdere studies39, lijkt het aannemelijk dat het gehydroxyleerde product geglycosyleerd is door endogene glycosyltransferasen en vervolgens in de vacuole, waardoor het ontoegankelijk is voor extractie met de organische oplosmiddel mengsels die hier worden gebruikt voor extractie36,43,44,45 ,46. Soortgelijke ongewenste product modificaties in het kader van pathway Engineering in N. benthamiana zijn gemeld in voorgaande studies47. Zoals weergegeven voor co-expressie in E. coli, voorbijgaande expressie in N. benthamiana resulteert in de extractie van verschillende bijproducten, met inbegrip van lineaire alkanen van verschillende ketenlengte als gebaseerd op vergelijking met referentiemassa Spectra databases. Samengestelde Antilichaamtiters geëxtraheerd uit blad materiaal bleken gemiddeld 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene en 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g droog blad weefsel. Deze Antilichaamtiters kunnen niet rechtstreeks worden vergeleken met het E. coli co-expressie systeem gezien de verschillende experimentele set-ups.
Diterpenoid zuivering Diterpenoid zuivering werd bereikt met behulp van silica Kolomchromatografie en daaropvolgende semi-preparatieve HPLC. Metaboliet extracten van 12 L gepoolde E. coli culturen werden gezuiverd met behulp van silica Kolomchromatografie om de drie focal dolabralexin verbindingen te scheiden (Figuur 3a). Silica chromatografie is ideaal voor het bereiken van hoge zuiverheid van de doelverbindingen, omdat het eenvoudige scheiding van diterpeen olefinen en zuurstof derivaten mogelijk maakt, en gemakkelijk verwijdert de grote verontreiniging, oxindole, die wordt vastgehouden op de silica matrix ( Figuur 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figuur 1: workflow voor diterpenoid productie in E. coli en metaboliet zuivering uit vloeibare bacteriële culturen. Onderbroken dozen geven optionele stappen weer waar extra zuivering nodig is. A) representatiefbeeld van de geëxtraheerde E. coli cultuur met behulp van een separatoire trechter. B) representatief beeld van de zuivering van de metaboliet extract met behulp van silica chromatografie.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figuur 2: Dolabralexin biosynthetische pathway en genconstructies gebruikt in deze studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figuur 3: GC-MS-resultaten. Weergegeven zijn representatieve GC-MS-chromatogrammen van gezuiverde diterpenoid producten verkregen met behulp van enzym-co-expressie-assays in (a) E. coli en (B) N. benthamiana. Product identificaties zijn gebaseerd op vergelijkingen met authentieke normen en referentiemassa spectra van de National Institute of Standards and Technology (NIST) Mass spectrale bibliotheek. 1, oxindole; 2, indool-5-aldehyde; 3, pyrrolo [1,2-a] Pyrazine-1, 4-dione, hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] thio]-a-d-glucoside S, S-dioxide; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] Pyrazine-1, 4-dione, hexahydro-3-(fenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 en 12, onbekend; 10, chlooramfenicol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkanen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figuur 4: Diterpenoid productie in N. benthamiana. (A) workflow van diterpenoid productie in N. benthamiana en metaboliet zuivering van blad materiaal. B) representatief beeld van n. benthamiana -planten, klaar voor infiltratie-experimenten, alvorens te snoeien. C) representatieve beelden van N. benthamiana -planten na snoeien. D) beeld van door de spuit geïnfiltreerde bladeren. Er zijn donkere gebieden geïnfiltreerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Hier presenteren we gemakkelijk te gebruiken protocollen voor het produceren en zuiveren van diterpenoid metabolieten door de combinatorische expressie van biosynthetische enzymen in Escherichia coli of Nicotiana benthamiana, gevolgd door chromatografische product Zuivering. De resulterende metabolieten zijn geschikt voor verschillende studies, waaronder moleculaire structuur karakterisering, enzym functionele studies, en bioactiviteitentesten.

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Dit protocol is geschikt voor het produceren van gezuiverde diterpenoïden die kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-analyse en kan worden aangepast voor een reeks verschillende metabolietdoelen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het is een eenvoudige en goedkope methode om milligram hoeveelheden gespecialiseerde metabolieten te produceren. Door het uitwisselen van de genen en enzymen die worden gebruikt voor co-expressie, kan deze methode worden gewijzigd om andere terpenoïden te produceren, waaronder monoterpenoïden en sesquiterpenoïden, evenals andere metaboliet klassen zoals flavonoïden.Voor diterpenoïde metabolische productie en transformatie, beginnen met het opwarmen van chemisch bevoegde E.coli cellen op ijs. Wanneer de cultuur ontdooid is, voeg 25 microliter van bevoegde cellen per constructie toe aan een gekoelde 1,5 milliliter microbuis en voeg 1 microliter van een 100 nanogram per microliteroplossing toe van elke constructie die wordt gebruikt voor co-expressie. Incubeer de mengsels op ijs gedurende 30 minuten met zachte mengen om de 10 minuten door het schrapen van de buizen over een microtube rack.Aan het einde van de incubatie schokt de warmte de celmengsels op 42 graden Celsius gedurende een minuut voordat de cellen nog minstens twee minuten in het ijs worden gezet. Voeg vervolgens 200 microliters van 37 graden Celsius SOC medium toe aan de buizen. En broeden de culturen voor een uur op 37 graden celsius en 200 rotaties per minuut.Voeg aan het einde van de incubatie ongeveer 10 autoclaved glass kralen en 100 microliter cellen toe aan een 37 graden celsius opgewarmde lysogeny brijplaat met de juiste antibiotica. En schud de plaat horizontaal met het deksel op zijn plaats om de cellen gelijkmatig te verdelen. Tik vervolgens voorzichtig de glazen kralen in een afvalcontainer en broed de plaat 's nachts op 37 graden celsius, gecoate oppervlaktezijde naar beneden.De volgende dag, verwijder de plaat uit de couveuse. Voeg 5 milliliter vers bereide lysogeny bouillonmedium met de juiste antibiotica toe aan een 15 milliliter steriele glazen buis met een plastic ademende dop per geplande 1 liter kweek, en gebruik een pipettip om individuele getransformeerde E.Coli kolonies uit de agarplaat te plukken. Voeg een geplukte kolonie toe aan elk van de bereide buizen van 15 milliliter en dop elke buis met de bijbehorende ademende plastic dop.Plaats vervolgens de afgetopte E.coli kleine culturen in een 37 graden celsius schudden incubator voor 12 tot 24 uur. De volgende dag voeg 100 milliliter 10x PBS tot 900 milliliter geweldige bouillon in een 1 liter fles per kleine cultuur met de juiste antibiotica. En plaats de kolven op 37 graden celsius en 140 rotaties per minuut gedurende ongeveer 30 minuten.Wanneer de geweldige bouillon warm is, voeg dan het volledige volume van 5 milliliter van elke inentingscultuur toe aan één 1 liter cultuurfles per cultuur. En plaats de kolven in de schuddende couveuse op 140 rotaties per minuut gedurende ongeveer 3 uur. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,6 bereikt, verlaagt u de temperatuur van de couveuse tot 16 graden Celsius.Zodra de couveuse is afgekoeld, voeg 1 milliliter van een molaire IPTG, 1 milliliter vers bereide 4 gram per liter riboflavine en 1 milliliter vers bereide 150 gram aminolevulinic zuur aan elke cultuur. Voor de productie van diterpenoïden, voeg 25 milliliter van een molaire natrium pyruvaat aan elke cultuur om een voldoende voorloper vorming te garanderen. Vervolgens, incubeer de culturen op 16 graden Celsius en 140 rotaties per minuut gedurende 72 uur, het toevoegen van 25 milliliter natrium pyruvaat dagelijks aan de juiste culturen.Voor metabolietscheiding en zuivering, zet een separatory trechter op een ringstandaard in een rookkap. En plaats een afvalcontainer onder de trechter. Giet 500 milliliter van een 50/50 oplossing van ethylacetaat en hexanen in de separatory trechter.En voeg 500 milliliter van de getransformeerde E.coli co-expressie cultuur van belang in de trechter. Plaats de glazen stop op de trechter en schud de trechter 5 tot 10 keer om de cultuur te mengen met het extractieoplosmiddel, vaak het openen van de spigot, terwijl de trechter ondersteboven is en richt het in de rookkap om de trechter te ontgassen. Na een tweede ronde van schudden en ontgassen zoals net aangetoond, plaats de trechter rechtop in de ring staan voor ongeveer een minuut.Wanneer de bovenste oplosmiddellaag van de waterige cultuurlaag is gescheiden, verwijdert u de stop en giet u de E.coli-laag af in een afvalbeker, waarbij de oplosmiddellaag in de trechter behouden blijft. Herhaal vervolgens de extractie met de resterende 500 milliliter van de cultuur met dezelfde 500 milliliter oplosmiddel die voor de eerste extractie wordt gebruikt, voordat het oplosmiddel met de geëxtraheerde metabolieten in een schone kolf wordt afgevoerd. Hier wordt onze representatieve gaschromatografie-massaspectrometriechromatogram van typische geëxtraheerde enzymproducten getoond.Algemeen waargenomen kleine bijproducten zijn chlooramfenicol en de indool derivaten oxindool en indool pivalaldehyde. Na diterpenoïde zuivering via silicakolomchromatografie kunnen drie dolabralexinverbindingen worden verkregen, zoals gekwantificeerd op basis van een standaardcurve met behulp van de diterpenoïde sclareol. Silica chromatografie is ideaal voor het bereiken van een hoge zuiverheid van de doelverbindingen.Omdat het de eenvoudige voorbereiding van diterpene olefinen en zuurstofhoudende derivaten mogelijk maakt en gemakkelijk de belangrijkste besmette oxindool verwijdert, die op de silicamatrix wordt bewaard. Verder kan de co-expressie van de terpenoïde pathway genen worden gebruikt om diterpenoïden te produceren in N.Benthamiana, wat resulteert in de productie van dolabradiene en 15, 16 epoxydolabren. De oplosmiddelen die tijdens de extractie worden gebruikt, moeten worden geoptimaliseerd voor de fysische chemische eigenschappen van de metabolieten van belang en mogen niet met water kunnen worden gemengd om twee afzonderlijke lagen te behouden.Na deze procedure kunnen gezuiverde metabolieten worden gebruikt voor downstream-analyse, inclusief structurele analyse en antibioticazuren. Deze techniek maakte het mogelijk om nieuwe diterpenoïden te ontdekken, inclusief die welke hier worden getoond, waardoor deze metabolieten konden worden geanalyseerd op hun chemische structuur en nieuwe biactivies. Neem voorzorgsmaatregelen bij het gebruik van organische oplosmiddelen in een separatory trechter.Zorg er altijd voor dat u biologisch afval afvoert volgens de veiligheidsnormen van uw lab.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay voor fosforylatie en microtubulus bindende samen met lokalisatie van Tau-eiwit in Colorectal kankercellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...