Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
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Nous remercions le Dr Reuben Peters (Iowa State University, Usa) d'avoir fourni les constructions pIRS et pGGxZmAN2. Soutien financier pour ce travail par le NSF Plant-Biotic Interactions Program (subvention 1758976 à P.Z.), le Programme de recherche sur les carrières précoces du DOE (subvention DE-SC0019178 à P.Z.), le Programme conjoint de sciences communautaires de l'Institut du génome du DOE (subvention CSP2568 à P.Z.), le FNS Le Programme de bourses de recherche des diplômés (à K.M.M.) et la bourse de mentorat du doyen de l'UC Davis (à K.M.M.) sont reconnaissants.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Une étude et une application plus larges des produits naturels diterpénoïdes nécessitent des protocoles simples et peu coûteux pour synthétiser et purifier des quantités suffisantes de composés désirés. L'augmentation rapide du nombre d'enzymes diterpénoïdes-métaboliques disponibles à partir d'un large éventail d'espèces fournit maintenant un inventaire expansif pour la production enzymatique de diterpénoïdes à l'aide de systèmes d'hôtes microbiens et à base de plantes. En outre, l'architecture modulaire de nombreuses voies diterpénoïdes permet l'utilisation d'enzymes de la même espèce ou différentes dans les approches d'ingénierie combinatoire 'plug and play' pour générer un éventail de naturels et de nouveaux diterpenoid naturels produits2,14,26,35.
E. coli est un hôte microbien privilégié pour la biosynthèse des produits naturels en raison de sa robustesse, de sa facilité d'évolutivité, de sa complexité chimique limitée pour la contamination par les sous-produits réduits et de la richesse des outils disponibles pour l'assemblage et l'expression de l'ADN. Optimisation. D'après notre expérience, la plate-forme décrite ici est bien adaptée pour produire des rendements de produits allant jusqu'à plusieurs centaines de mg d'olefines et d'alcools diterpènes, ce qui convient à de nombreuses applications en aval, y compris celles proposées ici. Bien que ne répondant pas à l'échelle industrielle, la plate-forme de production décrite ici peut servir de base pour l'optimisation de la voie, de l'hôte et de la fermentation, comme cela a été démontré avec succès pour les diterpénoïdes connexes tels que le taxadène et le sclareol33 ,34. La surexpression des gènes de voie MVA ou MEP limitant le taux a été établie avec succès pour surmonter les facteurs limitant le rendement de la biosynthèse diterpénoïde, tels que l'approvisionnement insuffisant en précurseurs et le flux de précurseurs dans des voies concurrentes13, 32,33,39. Bien que prouvé succès dans plusieurs études, une mauvaise expression et l'activité catalytique de l'eucaryotique eucaryotique terpénoïde-métabolique P450s et d'autres enzymes membranaires dans E. coli est un facteur limitant probable33,39 ,48,49,50,51,52. L'utilisation de séquences optimisées en codon et de modifications protéiques, telles que l'élimination du peptide du signal réticulum endoplasmique ou l'introduction d'un peptide de signal plastidial, se sont avérées utiles pour augmenter l'expression soluble P45014,38 ,49,50,53. De telles modifications ont également été utilisées pour la coexpression microbienne du maïs CYP71Z1839 utilisé comme voie d'exemple dans cette étude. Les protocoles décrits sont basés sur l'utilisation de plasmides porteurs d'un ou deux gènes par construction, tous sous le même promoteur inductible. Lorsque des combinaisons de gènes à plus grande échelle sont souhaitées, il est conseillé d'utiliser diverses cassettes multigènes ou systèmes d'empilement de gènes disponibles pour atténuer l'efficacité réduite de la transformation et la croissance de la culture en raison de l'utilisation de plasmides multiples et d'antibiotiques13 .
Avec la plus grande disponibilité des ressources génétiques et génomiques, les systèmes d'hôtes végétaux deviennent également de plus en plus adaptés à la fabrication de produits naturels. Les avantages incluent la capacité des plantes à produire les précurseurs naturels requis alimentés par la photosynthèse, permettant ainsi la formation de produits sans avoir besoin de compléter les molécules précurseurs54,55. N. benthamiana est déjà largement utilisé pour la caractérisation fonctionnelle in vivo et l'expression combinatoire des voies terpénoïdes et autres produits naturels14,35,36,40 . Les avantages notables de l'utilisation de N. benthamiana comme système hôte comprennent la production endogène de précurseurs diterpénoïdes, l'utilisation de séquences génétiques indigènes, l'expression simplifiée des P450 eucaryotes, la facilité de la transformation des gènes combinatoires (comme antibiotiques distincts ne sont pas nécessaires pour la co-transformation transitoire), et l'extraction simple des produits cibles à partir de matière folique. Au besoin, la production de diterpénoïdes peut être améliorée par la co-expression des gènes clés de la voie des PEOAux pour augmenter l'offre de précurseurs36,41. Les contraintes pour la production évolutive de diterpénoïdes à N. benthamiana sont plus complexes par rapport aux cultures microbiennes liquides en raison de la nécessité de produire suffisamment de biomasse végétale, de purification de produits à forte intensité de main-d'œuvre à partir de produits chimiquement complexes. tissu végétal, et possible métabolisation indésirable des produits cibles par, par exemple, l'oxydation, la glycosylation ou la déphosphorylation par des enzymes endogènes36,43,44,45 ,46,47. Cependant, cette procédure peut être étendue jusqu'à mg quantités de produits en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l'agroinfiltration56.
Les protocoles d'extraction et de purification des produits décrits ici sont compatibles avec E. coli et N. benthamiana, ainsi que S. cerevisiae et d'autres systèmes d'hôtes végétaux ou microbiens, et offrent une approche rentable et facile à dans les laboratoires de biologie et de chimie et ne nécessite pas d'équipement de purification coûteux. L'extraction de métabolite à l'aide d'un entonnoir séparatiste est bien adaptée pour une extraction efficace et une séparation de phase avant la purification chromatographique. Les tailles d'entonnoir peuvent être facilement ajustées pour permettre de plus grands volumes de culture et de réduire le temps expérimental nécessaire pour extraire de grandes cultures. Nous avons trouvé l'utilisation d'un gradient d'acétate d'hexane/éthyle idéal pour extraire des diterpénoïdes de polarité différente comme démontré ici pour le groupe de dolabralexins qui comprennent à la fois les hydrocarbures et les composés oxygénés (figure 3). Selon les propriétés des produits cibles, d'autres mélanges de solvants peuvent être avantageux. Cependant, les solvants ne doivent pas être miscibles avec de l'eau pour assurer une extraction réussie et la séparation de phase en utilisant la technique d'entonnoir séparateur. En outre, la perte de produit par évaporation doit être prise en compte lors de l'utilisation de cette approche pour la production de composés organiques volatils (COV), tels que les mono- et sesqui-terpénoïdes de poids moléculaire inférieur et d'autres COV. La séparation chromatographique des diterpénoïdes de différents niveaux d'oxygénation à l'aide d'une colonne de silice à plus grande échelle (no 2 L) a été avantageuse dans notre expérience, car elle offre une meilleure séparation des produits et minimise le besoin de purification itérative étapes lors de l'utilisation de plus petits volumes de colonnes. Les volumes de colonnes et les matrices peuvent être ajustés au besoin pour le volume de culture désiré et le type de produit naturel. La pureté des produits cibles qui peuvent être atteints à l'aide de ce protocole convient à de nombreuses applications en aval, telles que les essais de bioactivité ou pour une utilisation dans les analyses d'activité enzymatiques. Cependant, lorsque des niveaux de pureté plus élevés sont nécessaires, tels que des analyses structurelles via la RMN, la pureté du produit peut être efficacement améliorée par une purification supplémentaire à l'aide (semi)-préparative HPLC.
Ce protocole décrit ici a été optimisé pour la production de produits naturels diterpénoïdes, mais peut également être facilement personnalisé aux mono-, sesqui- et tri-terpénoïdes connexes, aussi bien que d'autres classes de produits naturels simplement en générant l'enzyme désirée modules pour l'expression combinatoire14,57. Cependant, des modifications des procédures d'extraction et de purification des produits doivent être prises en considération pour les composés à plus forte volatilité, tels que les mono- et sesqui-terpénoïdes, ou une plus grande polarité et modification fonctionnelle comme l'illustre glycosylation de beaucoup de triterpénoïdes, phénylpropanoids, et d'autres classes naturelles de produit.
Bien que des plates-formes à l'échelle industrielle pour la fabrication de produits naturels soient disponibles, les protocoles décrits ici offrent un outil peu coûteux et personnalisable qui peut être facilement mis en place dans la plupart des laboratoires. Comme l'a démontré la production de dolabralexins de maïs ici et ailleurs39, les quantités de produits et la pureté qui peuvent être réalisées en utilisant cette approche sont généralement suffisantes pour faciliter diverses analyses et utilisations en aval, y compris, mais pas diverses études sur la bioactivité, l'analyse des interactions entre organismes, ainsi que l'utilisation comme substrat enzymatique ou comme matériau de départ pour les approches de semi-synthèse.

Les diterpénoïdes constituent un groupe chimiquement diversifié de plus de 12 000 produits naturels polycycliques à 20 carbonequis sont essentiels dans de nombreux organismes1. Les champignons et les plantes produisent la plus grande diversité de diterpénoïdes, mais il a également été démontré que les bactéries forment des diterpénoïdes bioactifs (voir les avis2,3,4,5). Enracinés dans leur grande diversité structurelle, les diterpénoïdes remplissent une multitude de fonctions biologiques. Quelques diterpénoïdes, tels que les hormones de croissance gibberellin, ont des fonctions essentielles dans les processus de développement5. Cependant, la majorité des diterpénoïdes servent de médiateurs de la défense chimique et des interactions interorganismales. Parmi ceux-ci, les acides de résine de diterpene dans la défense de parasites et d'agents pathogènes des arbres de conifères et des mélanges spécifiques d'espèces des diterpénoïdes antimicrobiens dans les principales cultures vivrières telles que le maïs (Zea mays) et le riz (Oryza sativa) ont été le plus largement étudié6,7. Ces bioactivities fournissent un riche dépôt chimique pour des applications commerciales, et certains diterpénoïdes sont utilisés comme produits pharmaceutiques importants, additifs alimentaires, adhésifs, et d'autres bioproduits de la vie quotidienne moderne8,9 ,10. Pour faire avancer la recherche sur la diversité naturelle et les fonctions biologiques des diterpénoïdes et, en fin de compte, promouvoir des applications commerciales plus larges, des outils pour la préparation rentable de composés purs sont nécessaires. L'isolement à grande échelle des matières végétales a été établi pour quelques bioproduits diterpénoïdes, tels que les acides de résine de diterpene qui sont produits comme sous-produit de l'industrie des pâtes et papiers8. Cependant, l'accumulation de diterpénoïdes dans seulement des tissus spécifiques et sous une réglementation stricte par des stimuli environnementaux limite souvent l'isolement des quantités suffisantes de produits du producteur naturel2. En outre, la complexité structurelle des diterpénoïdes entrave leur production par la synthèse chimique, bien que de telles approches aient été couronnées de succès dans plusieurs cas11,12. Avec la disponibilité des technologies génomiques et biochimiques avancées, les plates-formes de production enzymatiques ont gagné l'attention croissante pour produire une gamme de composés diterpénoïdes (voir les revues13,14, 15,16,17,18).
Tous les ténuodes, y compris les diterpénoïdes, sont dérivés de deux précurseurs isopréoïdes isomeriques, d'isopentenyl diphosphate (IPP) et de diméthylallyl diphosphate (DMAPP)19 qui, à leur tour, sont formés par le mévalonate (MVA) ou le méthylerythritol-5-phosphate (MEP) voie. La biosynthèse terpénoïde se poursuit à travers la voie mep dans les bactéries et la voie MVA chez les champignons, tandis que les plantes possèdent un MVA cytosolique et une voie plastique MEP, avec ce dernier étant la voie principale vers la formation diterpénoïde20. La condensation de l'IPP et du DMAPP par prenyl transferases donne le précurseur central de 20 carbone à tous les diterpénoïdes, le diphosphate geranylgeranyl (GGPP)20. En aval de la formation GGPP, deux familles d'enzymes, les synthases terpènes (TPS) et les monooxygénases cytochromes P450 (P450) contrôlent en grande partie la formation de la vaste diversité chimique du métabolisme terpénoïde21,22. Les synthases de Diterpene (diTPsS) catalysent la cyclisation et le réarrangement commis de la carbocation-conduite de GGPP pour former divers bi-, poly-, ou macro-cycliques d'échafaudage de diterpene de carbocation commis pour former divers échafaudages de diterpène stéréospécifiques de bi-, poly-, ou macro-cycliques1,3,23, 24. L'oxygénation et la décoration fonctionnelle de ces échafaudages sont ensuite facilitées par les enzymes P450 et sélectionnez d'autres familles d'enzymes22,25. Les TPS et les P450 existent généralement en tant que familles multigènes spécifiques aux espèces qui peuvent former des réseaux biosynthétiques modulaires, où la combinaison de différents modules d'enzymes le long d'un plan commun permet la formation d'un large éventail de composés2, 26. La découverte rapide d'enzymes fonctionnellement distinctes opérant dans des voies terpénoïdes modulaires au cours des dernières années a fourni des possibilités d'expansion pour leur utilisation comme une liste de pièces polyvalentes pour l'ingénierie métabolique des voies partielles ou complètes dans plates-formes de production microbiennes et végétales. Par exemple, la levure (Saccharomyces cerevisiae) a été appliquée avec succès à l'ingénierie des voies multi-enzymes pour la fabrication de bioproduits terpénoïdes, tels que le médicament antipaludique artémisinine27, les biocarburants sesquiterpenoid bisabolene et farnesene28, mais aussi sélectionner les diterpénoïdes29,30,31. De même, des plates-formes Escherichia coli conçues pour la fabrication à l'échelle industrielle ont été créées pour quelques métabolites diterpénoïdes, y compris le taxol précurseur taxadène taxadène utilisé comme médicament anticancéreux et l'alcool diterpene, sclareol , utilisé dans l'industrie des parfums13,32,33,34. Les progrès dans les technologies de génie génétique et de transformation ont également rendu les systèmes d'hôtes végétaux de plus en plus viables pour la production de produits naturels végétaux9,14,35,36. En particulier, le proche parent du tabac, Nicotiana benthamiana, est devenu un châssis largement utilisé pour l'analyse des voies terpénoïdes et l'ingénierie, en raison de la facilité de la transformation Agrobacterium-négociéde multiples combinaisons de gènes , biosynthèse efficace des précurseurs endogènes, et biomasse élevée14,35,36.
En nous appuyant sur ces plates-formes établies pour la biosynthèse terpénoïde, nous décrivons ici des méthodes faciles à utiliser et rentables pour la production enzymatique de diterpénoïdes et la purification de composés uniques. Les protocoles présentés illustrent comment les plates-formes E. coli et N. benthamiana conçues pour la biosynthèse améliorée des précurseurs diterpénoïdes peuvent être utilisées pour l'expression combinatoire de différentes enzymes diTPS et P450 pour générer composés diterpénoïdes désirés. L'application de ce protocole pour produire et purifier les diterpénoïdes structurellement différents est montrée par exemple de diterpénoïdes spécialisés à partir de maïs (Zea mays), appelés dolabralexins, biosynthèse endogène dont recrute deux diTPS et un P450 Enzyme. La purification de différentes dolabralexines allant des olefins aux dérivés oxygénés est alors réalisée en combinant l'extraction d'entonnoir séparatif avec la chromatographie à grande échelle de colonne de silice et la chromatographie liquide à haute pression préparative (HPLC). Les protocoles décrits sont optimisés pour la production de diterpénoïdes, mais peuvent également être facilement adaptés pour les classes terpénoïdes connexes, ainsi que d'autres produits naturels pour lesquels des ressources enzymatiques sont disponibles. Les composés produits à l'aide de cette approche conviennent à diverses applications en aval, y compris, sans s'y limiter, la caractérisation structurelle par l'analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN), l'utilisation comme substrats pour les études fonctionnelles enzymatiques, et une gamme de tests de bioactivité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Les diterpénoïdes forment une classe variée de produits naturels à petites molécules qui sont largement distribués à travers les royaumes de la vie et ont des fonctions biologiques critiques dans les processus de développement, les interactions interorganismales et l'adaptation environnementale. En raison de ces diverses bioactivités, de nombreux diterpénoïdes sont également d'importance économique comme les produits pharmaceutiques, les additifs alimentaires, les biocarburants et d'autres bioproduits. La génomique avancée et les approches biochimiques ont permis une augmentation rapide de la connaissance des gènes, des enzymes et des voies diterpéoïdes-métaboliques. Cependant, la complexité structurelle des diterpénoïdes et la répartition taxonomique étroite des composés individuels chez souvent une seule espèce demeurent des facteurs contraignants pour leur production efficace. La disponibilité d'un plus large éventail d'enzymes métaboliques fournit maintenant des ressources pour produire des diterpénoïdes dans des titres et une pureté suffisantes pour faciliter une étude plus approfondie de cet important groupe de métabolites. S'appuyant sur des outils établis pour la coexpression des enzymes microbiennes et végétales, nous présentons un protocole facile à actionnaliser et personnalisable pour la production enzymatique de diterpénoïdes dans Escherichia coli ou Nicotiana benthamiana, et la purification des produits désirés par chromatographie de silice et HPLC semi-préparatif. En utilisant le groupe de maïs (Zea mays) diterpénoïdes de dolabralexine comme exemple, nous soulignons comment des combinaisons modulaires d'enzymes de synthase diterpene (diTPS) et de cytochrome P450 monooxyase (P450) peuvent être utilisées pour générer différents échafaudages diterpénoïdes. Les composés purifiés peuvent être utilisés dans diverses applications en aval, telles que des analyses structurelles métabolites, des études de structure-fonction enzymatique, et des expériences de bioactivité in vitro et dans des expériences de bioactivité planta.

Flux de travail schématique pour la production de diterpénoïdes à l'aide d'E. coli La figure 1 illustre le flux de travail décrit pour la production de diterpénoïdes. Le protocole décrit ici a été adapté à partir d'une plate-forme E. coli précédemment décrite pour la biosynthèse diterpénoïde13,32 pour l'utilisation de cultures à plus grand volume et la purification des produits diterpénoïdes désirés via la silice Chromatographie. Pour démontrer l'utilisation de ce protocole, nous avons utilisé une voie de dolabralexine récemment identifiée à partir du maïs qui comprend deux diTPS, ZmAN2 (Zm00001d029648) et ZmKSL4 (Zm00001d032858), un P450 multifonctionnel (CYP71Z18, Zm00001d014134), et un cytochrome P450 réductase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figure 2). En bref, les cellules compétentes E. coli BL21DE3-C41 ont été pré-transformées avec le pCDFDuet:IRS et pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 plasmides13,32. Le pCDFDuet:IRS plasmide contient des enzymes clés pour la production de précurseurs diterpénoïdes, y compris 1-deoxy-D -xylulose-5-phosphate synthase (dxs), 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate réductase (dxr), et isopentenyl diphosphate isomerase (idi), et a été montré pour augmenter la formation de diterpénoïdes dans E. coli13. Le plasmide pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 contient le maïs ent-copalyl diphosphate synthase ZmAN2 et une synthase GGPP d'Abies grandis. Les enzymes catalysant les réactions engagées dans la biosynthèse de dolabralexin ont alors été co-transformées en plasmides pET28b:ZmKSL4 et pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Pour plus de détails sur les séquences et les constructions plasmides voir Mafu et al. 201839.
Un chromatogramme GC-MS des produits enzymatiques extraits est montré dans la figure 3A, illustrant la formation de trois composés de dolabralexine, à savoir le dolabradiene (1,2 à 0,25 mg/L), l'époxydolabrene (0,65 à 0,2 mg/L) et l'époxydolabranol (11,4 - 1,1 mg/L culture) comme quantifié sur la base d'une courbe standard à l'aide du sclareol diterpénoïde. Sclareol a été utilisé comme norme de référence, en raison de sa structure similaire et les propriétés chimiques par rapport aux dolabralexins. Les sous-produits mineurs généralement observés comprennent le chloramphenicol, les dérivés de l'indole oxindole et indole-5-aldéhyde, et le précurseur du diphosphate geranylgeranyl (GGPP) (figure 3). Indole représente généralement le sous-produit principal, mais n'est pas montré ici, en raison de son temps de rétention plus court que le retard solvant fixé de 7 min pour préserver l'intégrité de l'instrument GC-MS.
Flux de travail schématique de production de diterpénoïdes à l'aide de N. benthamiana La figure 4 représente un aperçu de l'expression de la voie dolabralexine dans N. benthamiana. Pour les produits décrits ici, les constructions suivantes ont été transformées séparément en A. tumefaciens souche GV3101: pLife33:p19 (exprimant la protéine suppresseur de silençage du gène p19), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. Des séquences indigènes pleine longueur des gènes de la voie de la dolabralexine du maïs ont été utilisées dans le vecteur binaire de l'ADN T pLife3341 avec résistance à la kanamycine pour la propagation chez E. coli et A. tumefaciens. La co-expression des gènes de voie terpénoïde en amont est facultative, puisque le diphosphate geranylgeranyl précurseur est endogènement formé dans N. benthamiana. Cependant, plusieurs études ont utilisé avec succès de telles approches pour augmenter la formation de diterpénoïdes dans N. benthamiana14,36,41. Comme illustré dans la figure 3, la co-expression a produit avec succès le dolabradiene et 15,16-éoxydolabrene. À la différence de la co-expression d'enzyme dans E. coli,15,16-éoxydolabranol n'a pas été détecté dans des extraits de métabolite.
La présence de 15,16-éoxydolabrene dans les extraits de feuilles a démontré l'activité de CYP71Z18 dans N. benthamiana. Comme 15,16-éoxydolabranol s'est avéré stable après extraction des cultures microbiennes (figure 3) ainsi qu'après isolement des tissus racinaires de maïs dans les études précédentes39, il semble plausible que le produit hydroxylé soit glycosylated par glycosyltransferases endogènes et ensuite séquestré dans le vacuole, le rendant inaccessible à l'extraction avec les mélanges de solvants organiques utilisés ici pour l'extraction36,43,44,45 ,46. Des modifications similaires de produits indésirables dans le contexte de l'ingénierie des voies dans N. benthamiana ont été signalées dans des études antérieures47. Comme le montre la coexpression dans E. coli, l'expression transitoire dans N. benthamiana entraîne l'extraction de plusieurs sous-produits, y compris des alcanes linéaires de longueur de chaîne différente selon la comparaison avec les bases de données de spectre de masse de référence. Les titres composés extraits de la matière foliaire se sont avérés en moyenne 2,4 euros/- 0,5 mg de dolabradiene et 0,9 mg de 15,16-éoxydolabrene par g de tissu foliaire sec. Ces titers ne peuvent pas être comparés directement au système de coexpression E. coli étant donné les différentes configurations expérimentales.
Purification diterpénoïde La purification de Diterpenoid a été réalisée utilisant la chromatographie de colonne de silice et HPLC semi-préparative suivante. Des extraits de métabolites de 12 L de cultures E. coli mises en commun ont été purifiés à l'aide de la chromatographie de colonne de silice pour séparer les trois composés focaux de dolabralexine (figure 3A). La chromatographie de silice est idéale pour atteindre la pureté élevée des composés cibles, car elle permet la séparation simple des olefins de diterpene et des dérivés oxygénés, et enlève facilement le contaminant principal, l'oxindole, qui est maintenu sur la matrice de silice ( Figure 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figure 1 : Flux de travail pour la production de diterpénoïdes chez E. coli et la purification des métabolites à partir de cultures bactériennes liquides. Les boîtes en pointillés représentent des étapes facultatives où une purification supplémentaire est nécessaire. (A) Image représentative de la culture E. coli extraite à l'aide d'un entonnoir séparatif. (B) Image représentative de la purification d'extrait de métabolite utilisant la chromatographie de silice.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figure 2 : Voie biosynthétique de Dolabralexin et constructions de gènes utilisées dans cette étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figure 3 : Résultats du GC-MS. Sont montrés des chromatogrammes REPRÉSENTATIFs de GC-MS de produits purifiés diterpénoïdes obtenus à l'aide d'analyses de coexpression enzymatiques dans (A) E. coli et (B) N. benthamiana. Les identifications de produits sont basées sur des comparaisons avec des normes authentiques et des spectres de masse de référence de la bibliothèque spectrale de masse du National Institute of Standards and Technology (NIST). 1, oxindole; 2, indole-5-aldéhyde; 3, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-(2-méthylpropyl)-; 4, 6-O-Acetyl-1-[[4-bromophenyl]thio]-a-d-glucoside S,S-dioxide; 5, dolabradiene; 6, 15,16-éoxydolabrene; 7, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15,16-éoxydolabranol; 9 et 12, inconnus; 10, chloramphenicol; 11, 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 13-16, alkanes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figure 4 : Production de diterpénoïdes à N. benthamiana. (A) Flux de travail de production de diterpénoïdes à N. benthamiana et de purification des métabolites à partir de matériel folique. (B) Image représentative des plantes De. benthamiana prêtes pour des expériences d'infiltration, avant l'élagage. (C) Images représentatives des plantes de N. benthamiana après l'élagage. (D) Image de feuilles infiltrées par seringue. Des zones plus sombres ont été infiltrées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Ici, nous présentons des protocoles faciles à utiliser pour produire et purifier les métabolites diterpénoïdes grâce à l'expression combinatoire des enzymes biosynthétiques dans Escherichia coli ou Nicotiana benthamiana, suivie par le produit chromatographique purification. Les métabolites qui en résultent conviennent à diverses études, y compris la caractérisation de la structure moléculaire, les études fonctionnelles enzymatiques et les essais de bioactivité.

Une approche personnalisable pour la production et la purification enzymatiques des produits naturels Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Ce protocole est adapté à la production de diterpenoids purifiés qui peuvent être utilisés pour différentes analyses en aval et peuvent être personnalisés pour une gamme de différentes cibles métabolites. Le principal avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une méthode simple et peu coûteuse pour produire des quantités milligrammes de métabolites spécialisés. En échangeant les gènes et les enzymes utilisés pour la co-expression, cette méthode peut être modifiée pour produire d’autres terpétoïdes, y compris les monoterpénoïdes et sesquiterpenoids, ainsi que d’autres classes de métabolites tels que les flavonoïdes.Pour la production et la transformation métaboliques des diterpénoïdes, commencez par réchauffer des cellules E.coli chimiquement compétentes sur la glace. Lorsque la culture a dégelé, ajouter 25 microlitres de cellules compétentes par construction à un microtube réfrigéré de 1,5 millilitre et ajouter 1 microlitre d’une solution de 100 nanogrammes par microlitre de chaque construction utilisée pour la co-expression. Incuber les mélanges sur la glace pendant 30 minutes avec un mélange doux toutes les 10 minutes en raclant les tubes sur un support de microtube.À la fin de l’incubation, la chaleur choque les mélanges cellulaires à 42 degrés Celsius pendant une minute avant de remettre les cellules sur la glace pendant au moins deux minutes de plus. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 37 degrés Celsius soc moyen aux tubes. Et incuber les cultures pendant une heure à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute.À la fin de l’incubation, ajouter environ 10 perles de verre autoclavées et 100 microlitres de cellules à une plaque de lysogène réchauffée de 37 degrés Celsius avec les antibiotiques appropriés. Et secouez la plaque horizontalement avec le couvercle en place pour répartir uniformément les cellules. Ensuite, appuyez doucement sur les perles de verre dans un récipient à déchets et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit, côté surface enduit vers le bas.Le lendemain, retirez la plaque de l’incubateur. Ajouter 5 millilitres de bouillon de lysogène fraîchement préparé avec les antibiotiques appropriés à un tube de verre stérile de 15 millilitres avec un bouchon respirant en plastique par culture prévue de 1 litre, et utiliser une pointe pipet pour choisir les colonies d’E.Coli transformées individuelles à partir de la plaque d’agar. Ajouter une colonie cueillie à chacun des tubes préparés de 15 millilitres et capuchon chaque tube avec le bouchon en plastique respirant qui l’accompagne.Ensuite, placez les petites cultures e.coli plafonnées dans un incubateur de secousses de 37 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures. Le lendemain ajouter 100 millilitres de 10x PBS à 900 millilitres de bouillon formidable dans un flacon de 1 litre par petite culture avec les antibiotiques appropriés. Et placez les flacons à 37 degrés Celsius et 140 rotations par minute pendant environ 30 minutes.Lorsque le bouillon formidable est chaud, ajouter l’ensemble du volume de 5 millilitres de chaque culture d’inoculation à un flacon de culture de 1 litre par culture. Et placez les flacons dans l’incubateur secouant à 140 rotations par minute pendant environ 3 heures. Lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint 0,6, réduire la température de l’incubateur à 16 degrés Celsius.Une fois l’incubateur refroidi, ajouter 1 millilitre d’un IPTG molaire, 1 millilitre d’acide aminolevulinique fraîchement préparé 4 grammes par litre de riboflavine et 1 millilitre d’acide aminolevulinique fraîchement préparé à chaque culture. Pour la production de diterpenoid, ajoutez 25 millilitres d’un pyruvate de sodium molaire à chaque culture pour assurer une formation suffisante de précurseurs. Ensuite, incuber les cultures à 16 degrés Celsius et 140 rotations par minute pendant 72 heures, en ajoutant 25 millilitres de pyruvate de sodium par jour aux cultures appropriées.Pour la séparation et la purification des métabolites, fixez un entonnoir séparateur sur un support d’anneau dans une hotte de fumée. Et placez un conteneur à déchets sous l’entonnoir. Verser 500 millilitres d’une solution 50/50 d’acétate d’éthyle et d’hexanes dans l’entonnoir séparateur.Et ajouter 500 millilitres de la culture transformée de co-expression E.coli d’intérêt dans l’entonnoir. Placez le bouchon de verre sur l’entonnoir et secouez l’entonnoir 5 à 10 fois pour mélanger la culture avec le solvant d’extraction, ouvrant fréquemment le spigot tandis que l’entonnoir est à l’envers et pointez-le dans le capot de fumée pour dégazer l’entonnoir. Après une deuxième série de secousses et de dégazage comme il vient de le démontrer, placez l’entonnoir droit dans le stand de l’anneau pendant environ une minute.Lorsque la couche solvant supérieure s’est séparée de la couche de culture aqueuse, retirez le bouchon et égouttez la couche E.coli dans un bécher à déchets, en conservant la couche de solvant dans l’entonnoir. Ensuite, répétez l’extraction avec les 500 millilitres restants de la culture à l’aide des mêmes 500 millilitres de solvant utilisés pour la première extraction, avant de drainer le solvant contenant les métabolites extraits dans un flacon propre. Ici, notre chromatogramme représentatif de chromatographie de gaz-masse de spectrométrie des produits enzymatiques extraits typiques est montré.Les sous-produits mineurs couramment observés comprennent le chloramphénicol et les dérivés de l’indole oxindole et le pivalaldéhyde indole. Après la purification diterpenoid par chromatographie de colonne de silice, trois composés de dolabralexin peuvent être obtenus, comme quantifié basé sur une courbe standard utilisant le sclareol diterpenoid. La chromatographie de la silice est idéale pour atteindre une grande pureté des composés cibles.Puisqu’il permet la préparation simple des oléfines de diterpene et des dérivés oxygénés et enlève facilement l’oxindole contamine principal, qui est retenu sur la matrice de silice. En outre, la co-expression des gènes de la voie terpénoïde peut être utilisée pour produire des diterpenoids dans N.Benthamiana, résultant en la production de dolabradiene et 15, 16 époxydolabrene. Les solvants utilisés pendant l’extraction doivent être optimisés pour les propriétés chimiques physiques des métabolites d’intérêt et ne doivent pas être mélangeables avec de l’eau pour maintenir deux couches distinctes.Après cette procédure, les métabolites purifiés peuvent être utilisés pour l’analyse en aval, y compris l’analyse structurale et les acides antibiotiques. Cette technique a permis la découverte de nouveaux diterpenoids, y compris ceux montrés ici, permettant à ces métabolites d’être analysés pour leur structure chimique et leurs nouvelles biactivités. Prenez des précautions lorsque vous utilisez des solvants organiques dans un entonnoir séparateur.Assurez-vous toujours d’éliminer les déchets biologiques selon vos normes de sécurité de laboratoire.

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