Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Wir danken Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) für die Bereitstellung der pIRS- und pGXZmAN2-Konstrukte. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch das NSF Plant-Biotic Interactions Program (Zuschuss Nr. 1758976 an P.Z.), das DOE Early Career Research Program (Grant- DE-SC0019178 to P.Z.), das DOE Joint Genome Institute Community Science Program (Grant- CSP2568 to P.Z.), das NSF Das Graduate Research Fellowship Program (zu K.M.M.) und ein UC Davis Dean es Mentorship Award Fellowship (an K.M.M.) werden dankbar gewürdigt.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Eine breitere Untersuchung und Anwendung von Diterpenoid-Naturprodukten erfordert einfache, kostengünstige Protokolle, um ausreichende Mengen gewünschter Verbindungen zu synthetisieren und zu reinigen. Die rasante Zunahme der Anzahl der verfügbaren diterpenoid-metabolischen Enzyme aus einer breiten Palette von Arten bietet nun ein umfangreiches Inventar für die enzymatische Produktion von Diterpenoiden mit mikrobiellen und pflanzlichen Wirtssystemen. Darüber hinaus ermöglicht die modulare Architektur vieler Diterpenoid-Wege die Verwendung von Enzymen aus der gleichen oder verschiedenen Arten in "Plug & Play" kombinatorischen Engineering-Ansätzen, um eine Reihe von natürlichen und neuen naturähnlichen diterpenoidnatürlichen Produkte2,14,26,35.
E. coli ist ein bevorzugter mikrobieller Wirt für die Biosynthese von Naturprodukten aufgrund seiner Robustheit, der einfachen Skalierbarkeit, der begrenzten chemischen Komplexität für eine reduzierte Nebenproduktkontamination und der Fülle verfügbarer Werkzeuge für die DNA-Montage und -Expression. Optimierung. Nach unserer Erfahrung eignet sich die hier beschriebene Plattform gut für die Herstellung von Produkterträgen von bis zu mehreren hundert mg Diterpenolefinen und Alkoholen, was für viele nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der hier vorgeschlagenen, geeignet ist. Die hier beschriebene Produktionsplattform erfüllt zwar nicht den industriellen Maßstab, kann aber als Grundlage für weitere Wege-, Host- und Fermentationsoptimierung dienen, wie sie erfolgreich für verwandte Diterpenoide wie Taxadien und Sclareol 33 demonstriert wurde. ,34. Die Überexpression von ratenbegrenzenden MVA- oder MEP-Signalsignalgenen wurde erfolgreich etabliert, um ertragsbegrenzende Faktoren für die Diterpenoid-Biosynthese zu überwinden, wie z. B. unzureichende Vorläuferversorgung und Vorläuferfluss in konkurrierende Pfade13, 32,33,39. Obwohl sich in mehreren Studien als erfolgreich erwiesen, ist eine schlechte Expression und katalytische Aktivität von terpenoid-metabolischen eukaryotischen P450s und anderen membrangebundenen Enzymen in E. coli ein wahrscheinlich erbegrenzender Faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Die Verwendung von codonoptimierten Sequenzen und Proteinmodifikationen, wie die Entfernung des endoplasmatischen Retikulumsignalpeptids oder die Einführung eines plastidialen Signalpeptids, haben sich als nützlich erwiesen, um die lösliche P450-Expression14,38 zu erhöhen. ,49,50,53. Solche Modifikationen wurden auch für die mikrobielle Ko-Expression von Mais CYP71Z1839 als Beispielweg in dieser Studie verwendet. Die beschriebenen Protokolle basieren auf der Verwendung von Plasmiden, die ein oder zwei Gene pro Konstrukt tragen, alle unter demselben induzierbaren Promotor. Wenn größere Genkombinationen gewünscht werden, ist es ratsam, verschiedene verfügbare Multigenkassetten oder Gen-Stacking-Systeme zu verwenden, um die reduzierte Transformationseffizienz und das Kulturwachstum durch den Einsatz mehrerer Plasmide und Antibiotika zu verringern13 .
Mit der breiteren Verfügbarkeit von Genetischen und Genomressourcen werden Pflanzenwirtsysteme auch zunehmend für die Herstellung natürlicher Produkte geeignet. Vorteile sind die Fähigkeit von Pflanzen, die erforderlichen natürlichen Vorläufer zu produzieren, die durch Photosynthese angetrieben werden, wodurch die Produktbildung ermöglicht wird, ohne dass die Vorläufermoleküle54,55ergänzt werden müssen. N. benthamiana ist bereits weit verbreitet für in vivo funktionelle Charakterisierung und kombinatorische Expression von Terpenoid und anderen natürlichen Produktwegen14,35,36,40 . Bemerkenswerte Vorteile der Verwendung von N. benthamiana als Wirtssystem sind die endogene Produktion von Diterpenoid-Vorstufen, die Verwendung nativer Gensequenzen, die vereinfachte Expression von eukaryotischen P450s, die Einfache kombinationskombinierte Gentransformation (als für die vorübergehende Kotransformation und die einfache Extraktion von Zielprodukten aus Blattmaterial sind keine separaten Antibiotika erforderlich. Bei Bedarf kann die Diterpenoidproduktion durch die Koexpression wichtiger MEP-Signalweggene verbessert werden, um die Vorläuferversorgung zu erhöhen36,41. Die Beschränkungen für die skalierbare Diterpenoid-Produktion in N. benthamiana sind komplexer als flüssige mikrobielle Kulturen, da ausreichende pflanzliche Biomasse, arbeitsintensivere Produktreinigung aus chemisch komplexen Pflanzengewebe und mögliche unerwünschte Metabolisierung von Zielprodukten, z.B. Oxidation, Glykosylierung oder Dephosphorylierung durch endogene Enzyme36,43,44,45 ,46,47. Dieses Verfahren kann jedoch auf mg-Produktmengen skaliert werden, indem die Anzahl der für die Agroinfiltration verwendeten Pflanzen erhöht wird56.
Die hier beschriebenen Produktextraktions- und Reinigungsprotokolle sind mit E. coli und N. benthamianasowie S. cerevisiae und anderen pflanzlichen oder mikrobiellen Wirtssystemen kompatibel und bieten einen kosteneffizienten Ansatz, der leicht sowohl in Biologie- als auch in Chemielaboren eingerichtet und erfordert keine teuren Reinigungsgeräte. Die Metabolitenextraktion mit einem Trenntrichter eignet sich gut für eine effiziente Extraktion und Phasentrennung vor der chromatographischen Reinigung. Trichtergrößen können leicht angepasst werden, um größere Kulturvolumina zu ermöglichen und die experimentelle Zeit zu reduzieren, die für die Extraktion aus großen Kulturen benötigt wird. Wir fanden die Verwendung eines Hexan/Ethylacetat-Gradienten ideal für die Extraktion von Diterpenoiden unterschiedlicher Polarität, wie hier für die Gruppe der Dolabralexine gezeigt, die sowohl Kohlenwasserstoff- als auch sauerstoffhaltige Verbindungen umfassen (Abbildung 3). Je nach Eigenschaften der Zielprodukte können andere Lösungsmittelgemische von Vorteil sein. Lösungsmittel dürfen jedoch nicht mit Wasser mischbar sein, um eine erfolgreiche Extraktion und Phasentrennung mit der Trenntrichtertechnik zu gewährleisten. Darüber hinaus muss bei der Verwendung dieses Ansatzes zur Herstellung flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs), wie z. B. mono- und sesquiterpenoide und andere VOCs mit geringerem Molekulargewicht, der Produktverlust durch Verdampfung berücksichtigt werden. Die chromatographische Trennung von Diterpenoiden unterschiedlicher Sauerstoffgehalte mit einer größeren Kieselsäuresäule im größeren Maßstab (2 l) ist unserer Erfahrung nach von Vorteil, da sie eine verbesserte Produkttrennung bietet und den Bedarf an iterativer Reinigung minimiert. Schritte bei verwendung kleinerer Spaltenvolumes. Säulenvolumina und Matrizen können je nach Bedarf für das gewünschte Kulturvolumen und die Art des Naturprodukts angepasst werden. Die Reinheit von Zielprodukten, die mit diesem Protokoll erreicht werden können, eignet sich für viele nachgelagerte Anwendungen, wie Bioaktivitätstests oder für den Einsatz in Enzymaktivitätsanalysen. Wenn jedoch höhere Reinheitsgrade erforderlich sind, wie z. B. Strukturanalysen über NMR, kann die Produktreinheit durch zusätzliche Reinigung mit (halb-)präparativem HPLC effizient verbessert werden.
Dieses hier beschriebene Protokoll wurde für die Herstellung von diterpenoiden Naturprodukten optimiert, kann aber auch leicht an verwandte Mono-, Sesqui- und Tri-Terpenoide sowie andere natürliche Produktklassen angepasst werden, indem einfach das gewünschte Enzym erzeugt wird. Module für kombinatorische Expression14,57. Änderungen der Verfahren zur Produktextraktion und -reinigung müssen jedoch bei Verbindungen mit höherer Volatilität, wie Mono- und Sesqui-Terpenoiden, oder bei höherer Polarität und funktioneller Modifikation berücksichtigt werden, wie sie durch Glykosylierung vieler Triterpenoide, Phenylpropanoide und anderer natürlicher Produktklassen.
Obwohl industrielle Plattformen für die Herstellung natürlicher Produkte verfügbar sind, bieten die hier beschriebenen Protokolle ein kostengünstiges, anpassbares Werkzeug, das in den meisten Laboratorien problemlos eingerichtet werden kann. Wie die Produktion von Mais-Dolabralexinen hier und anderswozeigt 39, reichen die Produktmengen und die Reinheit, die mit diesem Ansatz erreicht werden können, in der Regel aus, um verschiedene nachgelagerte Analysen und Verwendungen zu erleichtern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf verschiedene Bioaktivitätsstudien, Die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Organismen sowie zur Verwendung als Enzymsubstrate oder als Ausgangsmaterial für Halbsyntheseansätze.

Diterpenoide bilden eine chemisch vielfältige Gruppe von mehr als 12.000 überwiegend polyzyklischen 20-Kohlenstoff-Naturprodukten, die in vielen Organismen eine entscheidende Rolle spielen1. Pilze und Pflanzen produzieren die größte Vielfalt an Diterpenoiden, aber Bakterien haben auch gezeigt, bioaktive Diterpenoide zu bilden (siehe Bewertungen2,3,4,5). Verwurzelt in ihrer enormen strukturellen Vielfalt, dienen Diterpenoide einer Vielzahl von biologischen Funktionen. Ein paar Diterpenoide, wie Gibberellin Wachstumshormone, haben wesentliche Funktionen in Entwicklungsprozessen5. Die Mehrheit der Diterpenoide dient jedoch als Vermittler der chemischen Verteidigung und interorganismusalen Wechselwirkungen. Unter diesen, Diterpen-Harzsäuren in der Schädlings- und Pathogenabwehr von Nadelbäumen und artenspezifische Mischungen von antimikrobiellen Diterpenoiden in wichtigen Nahrungspflanzen wie Mais (Zea Mays) und Reis (Oryza sativa) wurden am umfangreichsten studiert6,7. Diese Bioaktivitäten bieten ein reiches chemisches Reservoir für kommerzielle Anwendungen, und ausgewählte Diterpenoide werden als wichtige Pharmazeutika, Lebensmittelzusatzstoffe, Klebstoffe und andere Bioprodukte des modernen Alltags verwendet8,9 ,10. Um die Erforschung der natürlichen Vielfalt und der biologischen Funktionen von Diterpenoiden voranzutreiben und letztlich breitere kommerzielle Anwendungen zu fördern, sind Werkzeuge zur kosteneffizienten Herstellung reiner Verbindungen erforderlich. Für einige Diterpenoid-Bioprodukte, wie z. B. Diterpenharzsäuren, die als Nebenprodukt der Zellstoff- und Papierindustrie hergestellt werden, wurde eine großflächige Isolierung von Pflanzenmaterial hergestellt8. Die Anhäufung von Diterpenoiden nur in bestimmten Geweben und unter strenger Regulierung durch Umweltreize schränkt jedoch häufig die Isolierung ausreichender Produktmengen vom natürlichen Hersteller2ein. Darüber hinaus behindert die strukturelle Komplexität der Diterpenoide ihre Produktion durch chemische Synthese, obwohl solche Ansätze in mehreren Fällen erfolgreich waren11,12. Mit der Verfügbarkeit fortschrittlicher genomischer und biochemischer Technologien haben enzymatische Produktionsplattformen zunehmend Aufmerksamkeit für die Herstellung einer Reihe von Diterpenoidverbindungen erhalten (siehe Bewertungen13,14, 15,16,17,18).
Alle Terpenoide, einschließlich Diterpenoide, stammen von zwei isomerisoprenomischen Vorläufern, Isopentenyldiphosphat (IPP) und Dimethylaldiphosphat (DMAPP)19, die wiederum durch das Mevalonat (MVA) oder die Methylerythritol-5-Phosphat (MEP) (MEP). Die Terpenoid-Biosynthese verläuft über den MEP-Weg bei Bakterien und den MVA-Weg bei Pilzen, während Pflanzen eine zytosolische MVA und einen plastidialen MEP-Weg besitzen, wobei letztere der primäre Weg zur Diterpenoidbildung20ist. Kondensation von IPP und DMAPP durch Prenyltransferasen ergibt den zentralen 20-Kohlenstoff-Vorläufer für alle Diterpenoide, Geranylgeranyldiphosphat (GGPP)20. Nach der GGPP-Bildung steuern zwei Enzymfamilien, Terpensynthasen (TPS) und Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450s) weitgehend die Bildung der großen chemischen Vielfalt des Terpenoidstoffwechsels21,22. Diterpen-Synthasen (DiTPS) katalysieren die engagierte karbonkationsgetriebene Cyclisierung und Neuanordnung von GGPP zu verschiedenen stereospezifischen bi-, poly- oder makrozyklischen Diterpengerüsten1,3,23, 24. Die Sauerstoffversorgung und weitere funktionelle Dekoration dieser Gerüste wird dann durch P450-Enzyme und ausgewählte andere Enzymfamilien22,25erleichtert. TPS und P450 existieren häufig als artspezifische Multigenfamilien, die modulare biosynthetische Netzwerke bilden können, wo die Kombination verschiedener Enzymmodule entlang einer gemeinsamen Blaupause die Bildung einer breiten Palette von Verbindungen ermöglicht2, 26. Die schnelle Entdeckung funktionell unterschiedlicher Enzyme, die in modularen Terpenoidwegen in den letzten Jahren arbeiten, hat zu einer erweiterung ihrer Verwendung als vielseitige Teileliste für metabolische Engineering spartieller oder vollständiger sowohl mikrobielle als auch pflanzliche Produktionsplattformen. Zum Beispiel, Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wurde erfolgreich angewendet, um Multi-Enzym-Wege für die Herstellung von Terpenoid-Bioprodukten zu entwickeln, wie das Malariamedikament Artemisinin27, die Sesquiterpenoid Biokraftstoffe Bisabolen und Farnesen28, aber auch diterpenoide29,30,31auswählen. Ebenso wurden entwickelte Escherichia coli-Plattformen für die industrielle Herstellung für einige diterpenoide Metaboliten eingerichtet, darunter das Taxol-Vorläufer-Taxadien, das als Krebsmedikament verwendet wird, und den Diterpenalkohol, Sclareol , verwendet in der Duftstoffindustrie13,32,33,34. Fortschritte in der Gentechnik und Transformationstechnologien haben auch Pflanzenwirtsysteme zunehmend lebensfähig für die Herstellung von pflanzlichen Naturprodukten9,14,35,36. Insbesondere der nahe Tabak Verwandte, Nicotiana benthamiana, hat sich zu einem weit verbreiteten Chassis für Terpenoid-Signal-Analyse und Engineering, aufgrund der Leichtigkeit von Agrobacterium-vermittelte Transformation von mehreren Genkombinationen , effiziente Biosynthese von endogenen Vorläufern und hoher Biomasse14,35,36.
Anhand dieser etablierten Plattformen für die Terpenoid-Biosynthese beschreiben wir hier einfach zu bedienende und kosteneffiziente Methoden zur enzymatischen Herstellung von Diterpenoiden und zur Reinigung einzelner Verbindungen. Die vorgestellten Protokolle veranschaulichen, wie E. coli- und N. benthamiana-Plattformen, die für eine verbesserte Diterpenoid-Vorläufer-Biosynthese entwickelt wurden, für die kombinatorische Expression verschiedener DiTPS und P450-Enzyme verwendet werden können, um gewünschten Diterpenoidverbindungen. Die Anwendung dieses Protokolls zur Herstellung und Reinigung strukturell unterschiedlicher Diterpenoide wird anhand von spezialisierten Diterpenoiden aus Mais (Zea mays), dolabralexins bezeichnet, die endogene Biosynthese, von denen zwei diTPS und ein P450 rekrutiert enzym. Die Reinigung verschiedener Dolabralexine von Olefinen bis hin zu sauerstoffhaltigen Derivaten wird dann durch die Kombination von Separatorentrichterextraktion mit großflächiger Kieselsäuresäulenchromatographie und präparativer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) erreicht. Die beschriebenen Protokolle sind für die Herstellung von Diterpenoiden optimiert, können aber auch leicht für verwandte Terpenoidklassen sowie andere natürliche Produkte angepasst werden, für die Enzymressourcen zur Verfügung stehen. Verbindungen, die mit diesem Ansatz hergestellt werden, eignen sich für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die strukturelle Charakterisierung durch Kernspinresonanzanalyse (NMR), die Verwendung als Substrate für Enzymfunktionsstudien und eine Reihe von Bioaktivitäts-Assays.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoide bilden eine vielfältige Klasse von natürlichen Kleinmolekülprodukten, die weit über die Königreiche des Lebens verteilt sind und kritische biologische Funktionen in Entwicklungsprozessen, interorganismusförmigen Wechselwirkungen und Umweltanpassung haben. Aufgrund dieser verschiedenen Bioaktivitäten sind viele Diterpenoide auch als Pharmazeutika, Lebensmittelzusatzstoffe, Biokraftstoffe und andere Bioprodukte von wirtschaftlicher Bedeutung. Fortschrittliche Genomik und biochemische Ansätze haben eine schnelle Zunahme des Wissens über diterpenoid-metabolische Gene, Enzyme und Wege ermöglicht. Die strukturelle Komplexität der Diterpenoide und die enge taxonomische Verteilung einzelner Verbindungen in oft nur einer einzigen Art bleiben jedoch einschränkende Faktoren für ihre effiziente Produktion. Die Verfügbarkeit einer breiteren Palette von metabolischen Enzymen bietet jetzt Ressourcen für die Herstellung von Diterpenoiden in ausreichenden Tittern und Reinheit, um eine tiefere Untersuchung dieser wichtigen Metabolitengruppe zu erleichtern. Auf der Grundlage etablierter Werkzeuge für die mikrobielle und pflanzliche Enzym-Co-Expression, präsentieren wir ein leicht zu bedienendes und anpassbares Protokoll für die enzymatische Produktion von Diterpenoiden in Escherichia coli oder Nicotiana benthamiana,und die Reinigung der gewünschten Produkte mittels Kieselsäurechromatographie und semipräparativer HPLC. Am Beispiel der Gruppe der Mais -Zea mays) Dolabralexin Diterpenoide, heben wir hervor, wie modulare Kombinationen von Diterpen-Synthase (DiTPS) und Cytochrom-P450-Monooxygenase (P450) Enzymen verwendet werden können, um verschiedene Diterpenoid-Gerüste zu erzeugen. Gereinigte Verbindungen können in verschiedenen nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, wie metabolitische Strukturanalysen, Enzymstruktur-Funktionsstudien sowie In-vitro- und in Planta-Bioaktivitätsexperimenten.

Schematischer Workflow für die Diterpenoid-Produktion mit E. coli Abbildung 1 zeigt den beschriebenen Workflow für die Diterpenoidproduktion. Das hier skizzierte Protokoll wurde von einer zuvor beschriebenen E. coli-Plattform für die Diterpenoid-Biosynthese13,32 für die Verwendung von größeren Volumenkulturen und die Reinigung der gewünschten Diterpenoid-Produkte über Kieselsäure angepasst. Chromatographie. Um die Verwendung dieses Protokolls zu demonstrieren, wir verwendeten einen kürzlich identifizierten Dolabralexin-Weg aus Mais, der zwei DiTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) und ZmKSL4 (Zm000001d032858), eine multifunktionale P450 (CYP71Z18, Zm000001d014134) und ein Cytochrom P450 Reduktase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Abbildung 2). Kurz gesagt, E. coli BL21DE3-C41 kompetente Zellen wurden mit den pCDFDuet:IRS und pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 Plasmiden13,32vortransformiert. Das pCDFDuet:IRS-Plasmid enthält Schlüsselenzyme für die Diterpenoid-Vorläuferproduktion, einschließlich 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Synthase (dxs), 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktase(dxr), und isopentenyldiphosphat isomerase (idi), und wurde gezeigt, dass Diterpenoidbildung in E. coli13zu erhöhen. Das pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 Plasmid enthält die Mais-Ent-Copalyldiphosphat-Synthase ZmAN2 und eine GGPP-Synthase von Abies grandis. Enzyme, die die engagierten Reaktionen in der Dolabralexin-Biosynthese katalysieren, wurden dann als Plasmide pET28b:ZmKSL4 und pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18 kotransformiert. Einzelheiten zu Sequenzen und Plasmidkonstrukten finden Sie unter Mafu et al. 201839.
Ein GC-MS-Chromatogramm der extrahierten Enzymprodukte ist in Abbildung 3Adargestellt, das die Bildung von drei Dolabralexin-Verbindungen veranschaulicht, nämlich Dolabradien (1,2 x 0,25 mg/L-Kultur), Epoxydolabren (0,65 x 0,2 mg/L-Kultur) und Epoxydolabranol (11,4 • 1,1 mg/L-Kultur) auf der Grundlage einer Standardkurve unter Verwendung des Diterpenoid-Sclareols quantifiziert. Sclareol wurde als Referenzstandard verwendet, aufgrund seiner ähnlichen Struktur und chemischen Eigenschaften im Vergleich zu Dolabralexinen. Typische kleinere Nebenprodukte sind Chloramphenicol, die Indolederivate Oxindole und Indole-5-Aldehyd und der Vorläufer Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) (Abbildung 3). Indole stellt in der Regel das primäre Nebenprodukt dar, wird hier aber nicht gezeigt, da seine Retentionszeit kürzer ist als die eingestellte Lösungsmittelverzögerung von 7 min, um die Integrität des GC-MS-Instruments zu erhalten.
Schematische Arbeitsabläufe der Diterpenoid-Produktion mit N. benthamiana Abbildung 4 zeigt einen Überblick über den Ausdruck des Dolabralexin-Weges in N. benthamiana. Für die hier beschriebenen Produkte wurden die folgenden Konstrukte separat in Den A. tumefaciens-Stamm GV3101 umgewandelt: pLife33:p19 (ausdrückend das p19-Gen-Silencing-Suppressor-Protein), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. In dem binären T-DNA-Vektor pLife3341 mit Kanamycinresistenz zur Vermehrung in E. coli und A. tumefaciens wurden in der Länge native Sequenzen der Maisdolabralexin-Signalweggene verwendet. Die Koexpression vorgeschalteter Terpenoid-Signalweggene ist optional, da der Vorläufer geranylgeranyldiphosphat in N. benthamiana endogen gebildet wird. Jedoch, mehrere Studien haben erfolgreich solche Ansätze verwendet, um Diterpenoid-Bildung in N. benthamiana14,36,41zu erhöhen. Wie in Abbildung 3dargestellt, produzierte der Co-Expression erfolgreich Dolabradien und 15,16-Epoxydolabren. Im Gegensatz zur Enzym-Co-Expression in E. coliwurde 15,16-Epoxydolabranol in Metabolitenextrakten nicht nachgewiesen.
Die Anwesenheit von 15,16-Epoxydolabren in Blattextrakten zeigte die Aktivität von CYP71Z18 in N. benthamiana. Da sich 15,16-Epoxydolabranol nach Extraktion aus mikrobiellen Kulturen(Abbildung 3) sowie nach Isolierung aus Maiswurzelgeweben in früheren Studien 39 als stabil erwiesenhat,erscheint es plausibel, dass das hydroxylierte Produkt glykosyliert ist. durch endogene Glykosyltransferasen und anschließend im Vakuum sequestriert, so dass es unzugänglich für die Extraktion mit den hier für die Extraktion verwendeten organischen Lösungsmittelgemischen36,43,44,45 46. Ähnliche unerwünschte Produktmodifikationen im Zusammenhang mit der Pfadtechnik in N. benthamiana wurden in früheren Studien berichtet47. Wie für die Koexpression in E. coligezeigt, führt die transiente Expression in N. benthamiana zur Extraktion mehrerer Nebenprodukte, einschließlich linearer Alkane unterschiedlicher Kettenlänge, die auf dem Vergleich mit Referenzmassenspektrendatenbanken basieren. Es wurde festgestellt, dass aus Blattmaterial extrahierte Verbundtiter im Durchschnitt 2,4 +/- 0,5 mg Dolabradien und 0,9 +/- 0,3 mg 15,16-Epoxydolabren pro g trockenem Blattgewebe sind. Diese Titer können angesichts der unterschiedlichen Versuchsanlagen nicht direkt mit dem E. coli-Co-Expressionssystem verglichen werden.
Diterpenoid-Reinigung Die Diterpenoid-Reinigung wurde mit der Kieselsäuresäulenchromatographie und der anschließenden semipräparativen HPLC erreicht. Metabolitenextrakte aus 12 L gepoolten E. coli-Kulturen wurden mittels Kieselsäuresäulenchromatographie gereinigt, um die drei fokalen Dolabralexinverbindungen zu trennen (Abbildung 3A). Die Kieselsäurechromatographie ist ideal, um eine hohe Reinheit der Zielverbindungen zu erreichen, da sie eine einfache Trennung von Diterpenolefinen und sauerstoffhaltigen Derivaten ermöglicht und leicht den Hauptschadstoff, Oxindole, entfernt, der auf der Kieselsäurematrix zurückgehalten wird ( Abbildung 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow für die Diterpenoidproduktion in E. coli und Metabolitenreinigung aus flüssigen Bakterienkulturen. Gestrichelte Boxen zeigen optionale Schritte, bei denen eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist. (A) Repräsentatives Bild der extrahierten E. coli-Kultur mit einem Trenntrichter. (B) Repräsentatives Bild der Metabolitenextraktreinigung mittels Kieselsäurechromatographie.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Dolabralexin biosynthetischer Signalweg und Genkonstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Abbildung 3: GC-MS-Ergebnisse. Gezeigt werden repräsentative GC-MS-Chromatogramme von gereinigten Diterpenoid-Produkten, die mit Enzym-Co-Expression-Assays in (A) E. coli und (B) N. benthamianagewonnen wurden. Produktidentifikationen basieren auf Vergleichen mit authentischen Standards und Referenzmassenspektren der Massenspektralbibliothek des National Institute of Standards and Technology (NIST). 1, Oxindole; 2, Indole-5-Aldehyd; 3, Pyrrolo[1,2-a]pyrazin-1,4-dione, Hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-Acetyl-1-[4-Bromphenyl]thio]-a-d-Glucosid S,S-dioxid; 5, dolabradien; 6, 15,16-Epoxydolabren; 7, Pyrrolo[1,2-a]Pyrazin-1,4-dion, Hexahydro-3-(Phenylmethyl)-; 8, 15,16-Epoxydolabranol; 9 und 12, unbekannt; 10, Chloramphenicol; 11, 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 13-16, Alkane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Abbildung 4: Diterpenoid-Produktion in N. benthamiana. (A) Workflow der Diterpenoid-Produktion in N. benthamiana und Metabolitenreinigung aus Blattmaterial. (B) Repräsentatives Bild von N. benthamiana Pflanzen bereit für Infiltrationsexperimente, vor dem Beschnitt. (C) Repräsentative Bilder von N. benthamiana Pflanzen nach dem Beschnitt. (D) Bild von spritzeninfiltrierten Blättern. Dunklere Gebiete wurden infiltriert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Hier präsentieren wir einfach zu bedienende Protokolle zur Herstellung und Reinigung von Diterpenoid-Metaboliten durch die kombinatorische Expression biosynthetischer Enzyme in Escherichia coli oder Nicotiana benthamiana, gefolgt von chromatographischem Produkt reinigung. Die resultierenden Metaboliten eignen sich für verschiedene Studien, einschließlich molekularer Strukturcharakterisierung, Enzymfunktionsstudien und Bioaktivitätstests.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Dieses Protokoll eignet sich zur Herstellung von gereinigten Diterpenoiden, die für verschiedene nachgelagerte Analysen verwendet werden können und für eine Reihe von verschiedenen Metabolitenzielen angepasst werden können. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es eine einfache und kostengünstige Methode ist, Milligramm Mengen an spezialisierten Metaboliten zu produzieren. Durch den Austausch der Gene und Enzyme, die für die Co-Expression verwendet werden, kann diese Methode modifiziert werden, um andere Terpenoide zu produzieren, einschließlich Monoterpenoide und Sesquiterpenoide, sowie andere Metabolitenklassen wie Flavonoide.Für diterpenoide metabolische Produktion und Transformation, beginnen sie mit der Erwärmung chemisch kompetenter E.coli-Zellen auf Eis. Wenn die Kultur aufgetaut ist, fügen Sie 25 Mikroliter kompetenter Zellen pro Konstrukt zu einem gekühlten 1,5 Milliliter Mikrorohr hinzu und fügen Sie 1 Mikroliter einer 100 Nanogramm pro Mikroliter Lösung jedes Konstrukts hinzu, das für die Koexpression verwendet wird. Inkubieren Sie die Mischungen auf Eis für 30 Minuten mit sanftem Mischen alle 10 Minuten durch Kratzen der Rohre über ein Mikrorohr-Rack.Am Ende der Inkubation schockieren die Zellenmischungen eine Minute lang bei 42 Grad Celsius, bevor sie die Zellen noch mindestens zwei Minuten auf eisern. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter 37 Grad Celsius SOC Medium zu den Rohren hinzu. Und bebrüten die Kulturen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute.Am Ende der Inkubation etwa 10 autoklavierte Glasperlen und 100 Mikroliter Zellen zu einem 37 Grad Celsius erwärmten Lysogeny-Brühe-Agar-Platte mit den entsprechenden Antibiotika hinzufügen. Und schütteln Sie die Platte horizontal mit dem Deckel an Ort und Stelle, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Dann tippen Sie die Glasperlen vorsichtig in einen Abfallbehälter und bebrüten die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, beschichtete Oberflächenseite nach unten.Entfernen Sie am nächsten Tag die Platte aus dem Inkubator. Fügen Sie 5 Milliliter frisch zubereitetes Lysogeny-Brühemedium mit den entsprechenden Antibiotika zu einem 15 Milliliter sterilen Glasrohr mit einer atmungsplastischen Kunststoffkappe pro geplanter 1-Liter-Kultur hinzu und wählen Sie mit einer Pipettenspitze einzelne transformierte E.Coli-Kolonien aus der Agarplatte. Fügen Sie jedem der vorbereiteten 15-Milliliter-Rohre eine gepflückte Kolonie hinzu und verkappen jedes Rohr mit der begleitenden atmungsaktiven Kunststoffkappe.Dann legen Sie die gekappten E.coli-Kleinkulturen 12 bis 24 Stunden lang in einen 37 Grad Celsius schüttelnden Brutkasten. Am nächsten Tag 100 Milliliter 10x PBS zu 900 Millilitern grandioser Brühe in einen 1-Liter-Kolben pro kleiner Kultur mit den entsprechenden Antibiotika geben. Und legen Sie die Kolben bei 37 Grad Celsius und 140 Umdrehungen pro Minute für etwa 30 Minuten.Wenn die grandiose Brühe warm ist, fügen Sie das gesamte Volumen von 5 Millilitern jeder Impfkultur zu einem 1 Liter Kulturkolben pro Kultur hinzu. Und legen Sie die Kolben in den Schüttel-Inkubator bei 140 Umdrehungen pro Minute für ca. 3 Stunden. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur des Inkubators auf 16 Grad Celsius.Sobald der Inkubator abgekühlt ist, fügen Sie 1 Milliliter eines Molaren IPTG, 1 Milliliter frisch zubereitete 4 Gramm pro Liter Riboflavin und 1 Milliliter frisch zubereitete 150 Gramm pro Liter Aminolevulinsäure in jede Kultur. Für die Diterpenoid-Produktion, fügen Sie 25 Milliliter eines Molaren-Natriumpyruvat zu jeder Kultur, um eine ausreichende Vorläuferbildung zu gewährleisten. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 16 Grad Celsius und 140 Umdrehungen pro Minute für 72 Stunden, hinzufügen 25 Milliliter Natriumpyruvat täglich zu den entsprechenden Kulturen.Zur Metabolitentrennung und -reinigung einen Trenntrichter auf einem Ringständer in einer Dunstabzugshaube sichern. Und legen Sie einen Abfallbehälter unter den Trichter. 500 Milliliter einer 50/50-Lösung aus Ethylacetat und Hexan in den Trenntrichter gießen.Und fügen Sie 500 Milliliter der transformierten E.coli-Co-Expression-Kultur von Interesse in den Trichter. Legen Sie den Glasstopfen auf den Trichter und schütteln Sie den Trichter 5 bis 10 Mal, um die Kultur mit dem Extraktionslösungsmittel zu mischen, wobei sie häufig den Zapfen öffnet, während der Trichter auf dem Kopf steht, und ihn in die Dunstabzugshaube zeigen, um den Trichter zu entgasen. Nach einer zweiten Runde des Schüttelns und Entgasens, wie gerade gezeigt, stellen Sie den Trichter für etwa eine Minute aufrecht in den Ringständer.Wenn sich die obere Lösungsmittelschicht von der wässrigen Kulturschicht getrennt hat, entfernen Sie den Stopfen und entleeren Sie die E.coli-Schicht in ein Abfallbecher, wodurch die Lösungsmittelschicht im Trichter beibehalten wird. Wiederholen Sie dann die Extraktion mit den restlichen 500 Millilitern der Kultur mit den gleichen 500 Milliliterl Lösungsmittel, die für die erste Extraktion verwendet wurden, bevor Sie das Lösungsmittel, das die extrahierten Metaboliten enthält, in einen sauberen Kolben entleeren. Hier wird unser repräsentatives Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Chromatogramm typischer extrahierter Enzymprodukte gezeigt.Häufig beobachtete kleinere Nebenprodukte sind Chloramphenicol und die Indole-Derivate Oxindole und Indole-Pivalaldehyd. Nach der Diterpenoid-Reinigung mittels Kieselsäuresäulenchromatographie können drei Dolabralexinverbindungen erhalten werden, wie auf Basis einer Standardkurve mit dem Diterpenoid Sclareol quantifiziert. Die Kieselsäurechromatographie ist ideal, um eine hohe Reinheit der Zielverbindungen zu erreichen.Da es die einfache Herstellung von Diterpenolefinen und sauerstoffhaltigen Derivaten ermöglicht und leicht die hauptkontaminierte Oxindole entfernt, die auf der Kieselsäurematrix zurückgehalten wird. Weiterhin kann die Koexpression der Terpenoid-Signalweggene zur Herstellung von Diterpenoiden in N.Benthamiana verwendet werden, was zur Produktion von Dolabradien und 15, 16 Epoxydolabren führt. Die während der Extraktion verwendeten Lösungsmittel sollten für die physikalischen chemischen Eigenschaften der von Interesse sindden Metaboliten optimiert werden und dürfen nicht mit Wasser vermischt werden können, um zwei unterschiedliche Schichten zu erhalten.Nach diesem Verfahren können gereinigte Metaboliten für nachgelagerte Analysen, einschließlich Strukturanalysen und Antibiotikasäuren, verwendet werden. Diese Technik ermöglichte die Entdeckung neuer Diterpenoide, einschließlich der hier gezeigten, so dass diese Metaboliten auf ihre chemische Struktur und neue Biaktivien analysiert werden konnten. Vorsichtsmaßnahmen bei der Verwendung organischer Lösungsmittel in einem Trenntrichter.Achten Sie immer darauf, biologische Abfälle gemäß Ihren Laborsicherheitsstandards zu entsorgen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...