Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

אנו מכירים בהכרת ד ר ראובן פיטרס (אוניברסיטת איווה סטייט, ארה ב) למתן מבנים pIRS ו pGGxZmAN2. תמיכה פיננסית עבור עבודה זו על ידי NSF צמח-ביוטי אינטראקציות התוכנית (גרנט 1758976 כדי P.Z.), DOE מוקדם מחקר הקריירה התוכנית (גרנט DE-SC0019178 P.Z.), DOE משותף הגנום מכון הקהילה המדע (גרנט CSP2568 ל P.Z.), NSF מלגת מחקר מוסמכים (ל-K.M.M.), ומלגת פרס מנטורה של אוניברסיטת דיוויס (ל-K.M.M.) מוכרת בהכרת תודה.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

חקירה רחבה ויישום של מוצרים טבעיים diterpenoid מחייבת פשוט, פרוטוקולים זולים לסנתז ולטהר כמויות מספיקות של תרכובות הרצוי. העלייה המהירה של מספר diterpenoid-אנזימים מטבולית ממגוון רחב של מינים מספקת כעת מלאי ולקיבולת עבור הייצור האנזימטי של diterpenoid באמצעות מערכות מארח מבוססות צמחים וחומרים מארחים. בנוסף, הארכיטקטורה המודולארית של מסלולים diterpenoid רבים מאפשר את השימוש באנזימים מאותם מינים או שונים בתוך ' הכנס & שחק ' קומבינטורית הנדסה גישות לייצר מערך טבעי וחדש כמו הטבע diterpenoid טבעי . מוצרים2,14,26,35
E. coli הוא מארח חיידקים מועדף עבור יוסינטזה מוצר טבעי בשל החוסן שלה, קלות מדרגיות, מורכבות כימית מוגבלת לזיהום התוצר לוואי מופחת, ואת העושר של כלים זמינים עבור הרכבה וביטוי DNA אופטימיזציה. בניסיון שלנו, הפלטפורמה המתוארת כאן הוא מתאים היטב להפקת תשואות המוצר של עד כמה מאות מ"ג diterpene אולפינים ו אלכוהול, אשר מתאים ליישומים רבים במורד הזרם כולל אלה המוצעים כאן. בעוד לא להיפגש בקנה מידה תעשייתי, פלטפורמת הייצור המתוארת כאן יכול לשמש כבסיס עבור מסלול נוסף, מארח, ומיטוב התסיסה כפי שכבר הפגינו בהצלחה עבור diterpenoids קשורים כגון מיסוי sclareol33 ,34. ביטוי יתר של הגבלת קצב MVA או מסלול MEP הגנים כבר הוקמה בהצלחה כדי להתגבר על תשואה הגבלת גורמים לביוסינתזה diterpenoid, כגון אספקה קודמן מספיק השטף הקודמי לתוך מסלולים מתחרים13, 32,33,39. למרות מוכח מוצלח במחקרים מספר, הביטוי המסכן ופעילות קטליטי של terpenoid-מטבולית איקריוטית P450s ואנזימים מאוגד ממברנה אחרים E. coli הוא גורם מגביל סביר33,39 ,48,49,50,51,52. שימוש ברצפים ממוטבים של codon ושינויי חלבונים, כגון הסרת האות פפטיד בתדר רשתית פלזמית או מבוא של פפטיד האות הפלסטיות, הוכיחו שימושי כדי להגדיל P450 ביטוי מסיסים14,38 ,49,50,53. שינויים כאלה היו גם מועסק עבור מיקרוביאלית ביטוי של תירס CYP71Z1839 משמש כמסלול לדוגמה במחקר זה. הפרוטוקולים המתוארים מבוססים על שימוש בפלמידים הנושאים גנים אחד או שניים לכל מבנה, כולם תחת אותו מקדם inducible. היכן שילובי גנים בקנה מידה גדול יותר רצוי, מומלץ להשתמש בקלטות מרובות גנים מסוגים שונים או לערום מערכות גנים כדי להמתיק את יעילות השינוי הנמוכה ואת צמיחת התרבות עקב שימוש בפלמידים מרובים ואנטיביוטיקה13 .
עם זמינות רחבה יותר של גנטיקה משאבים גנומיקה, מערכות מארח הצמח גם להיות מתאים יותר ויותר לייצור של מוצרים טבעיים. היתרונות כוללים את היכולת של צמחים לייצר את הסמנים הטבעיים הדרושים מופעל על ידי הפוטוסינתזה, ובכך מאפשר היווצרות המוצר ללא צורך להשלים מולקולות קודמן54,55. N. benthamiana כבר בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי vivo וביטוי קומבינטורית של terpenoid ומסלולים אחרים מוצר טבעי14,35,36,40 . היתרונות הבולטים של שימוש ב -N. benthamiana כמערכת מארח כוללים את הייצור האנדוגניים של מקדים diterpenoid, השימוש ברצפי גנים יליד, ביטוי מפושט של איקריוטית P450s, קלות של שינוי גנים קומבינטורית (כמו אנטיביוטיקה נפרדת אינם נדרשים עבור שיתוף משותף ארעי), והפקת פשוטה של מוצרי יעד מחומר עלה. במידת הצורך, ייצור diterpenoid יכול להיות משופר באמצעות שיתוף ביטוי של גנים מסלול mep מפתח כדי להגדיל את האספקה הקודמן36,41. אילוצים עבור ייצור diterpenoid מדרגי ב -N. benthamiana הם מורכבים יותר לעומת תרבויות מיקרוביאלית נוזלי בשל הצורך ביצירת ביומסה צמח מספיק, טיהור עבודה אינטנסיבית יותר מוצר מקומפלקס כימית רקמת הצמח, והאפשרי בלתי רצויות של מוצרי היעד דרך, למשל, חמצון, גליקוזילציה או dephosphorylation על ידי אנזימים אנדוגני36,43,44,45 ,46,47. עם זאת, הליך זה ניתן לשנות עד כמויות המוצר של mg על ידי הגדלת מספר הצמחים המשמשים לחדירה56.
הפקת המוצר ופרוטוקולי הטיהור המתוארים כאן תואמים ל -E. coli ו -N. benthamiana, כמו גם S. cerevisiae ס ומערכות אחרות של צמחים או חיידקים, ולספק גישה חסכונית קל ל הקים מעבדות ביולוגיה וכימיה ואינו דורש ציוד טיהור יקר. מטבוליזם מטבוליט באמצעות משפך מופרדים הוא מתאים היטב לחילוץ יעיל והפרדת הפאזה לפני טיהור כרומאטוגרפי. ניתן לכוונן בקלות את גודל המשפך כדי לאפשר כמויות גדולות יותר של התרבות ולהקטין את הזמן הנסיוני הדרוש לחילוץ מתרבויות גדולות. מצאנו את השימוש של hexane/אתיל אצטט מעבר להיות אידיאלי לחילוץ diterpenoids של קוטביות שונים כפי שניתן להדגים כאן לקבוצה של dolabralexins המהווים הן חומרים פחמימנים ו חמצון (איור 3). בהתאם למאפיינים של מוצרי היעד, תערובות ממיסים אחרים עשויים להיות יתרון. עם זאת, אין לmiscible ממיסים במים על מנת להבטיח הוצאה מוצלחת והפרדת פאזה באמצעות טכניקת המשפך הבדלנית. בנוסף, אובדן המוצר באמצעות התאיידות יש לקחת בחשבון בעת שימוש בגישה זו להפקת תרכובות אורגניות נדיף (וכדומה), כגון משקל מולקולרי נמוך מונו-ו sesqui-terpenoids ו-ווקנואידים אחרים. הפרדה כרומאטוגרפית של דיטרפננואידים של רמות שונות של חמצון באמצעות בקנה מידה גדול יותר (~ 2 L) בטור סיליקה היה יתרון על הניסיון שלנו, שכן הוא מספק הפרדה מוצר משופר וממזער את הצורך טיהור איטרטיבי שלבים בעת שימוש באמצעי אחסון קטנים יותר של עמודות. ניתן לכוונן אמצעי אחסון ומטריצות של עמודות לפי הצורך עבור אמצעי האחסון הרצוי לתרבות ולסוג המוצר הטבעי. הטוהר של מוצרי היעד, כי ניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה מתאים ליישומים רבים במורד הזרם, כגון בחני פעילות ביולוגית או לשימוש ניתוחים אנזימים הפעילות. עם זאת, כאשר רמות טוהר גבוהות יותר נדרשים, כגון ניתוחים מבניים באמצעות NMR, טוהר המוצר יכול להיות משופר ביעילות על ידי טיהור נוסף באמצעות (חצי)-הייצור הניתנים.
פרוטוקול זה תיאר כאן כבר אופטימיזציה לייצור מוצרים טבעיים diterpenoid, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות הקשורים מונו-, sesqui-ו tri-terpenoid, כמו גם מחלקות מוצרים טבעיים אחרים פשוט על ידי יצירת האנזים הרצוי מודולים עבור קומבינטורית ביטוי14,57. עם זאת, שינויים של ההליכים להפקת מוצר וטיהור חייב להילקח בחשבון עבור תרכובות עם תנודתיות גבוהה יותר, כגון מונו ו sesqui-terpenoids, או קוטביות גבוהה שינוי פונקציונלי כפי שניתן למשל גליקוזילציה של טריטרפננואידים רבים, פנילפרופננואידים, ושיעורי מוצרים טבעיים אחרים.
למרות פלטפורמות בקנה מידה תעשייתי לייצור מוצרים טבעיים זמינים, הפרוטוקולים המתוארים כאן מציעים זול, כלי להתאמה אישית שניתן להגדיר בקלות ברוב המעבדות. כפי שמתואר על ידי ייצור של תירס dolabralexins כאן ובמקומות אחרים39, כמויות המוצר וטוהר כי ניתן להשיג באמצעות גישה זו מספיקים בדרך כלל כדי להקל על ניתוח שונים במורד הזרם ושימושים, כולל, אבל לא מוגבל, למחקרים ביולוגיים שונים, ניתוח של אינטראקציות בין אורגניזמים, כמו גם לשימוש כמו מצעים אנזימים או כחומר התחלתי עבור הגישות למחצה סינתזה.

Diterpenoids מהווים קבוצה מגוונת כימית של יותר מ 12,000 ברובו פחמימנים 20-פחמן מוצרים טבעיים לשחק תפקידים קריטיים באורגניזמים רבים1. פטריות וצמחים לייצר את המגוון הגדול ביותר של diterpenoids, אבל חיידקים יש גם הוכחו טופס ביואקטיבי diterpenoids (ראה ביקורות2,3,4,5). מושרשת במגוון המבני העצום שלהם, diterpenoids לשרת שפע של פונקציות ביולוגיות. כמה diterpenoids, כגון הורמוני גדילה של הצמיחה, יש פונקציות חיוניות בתהליכים התפתחותיים5. עם זאת, רוב הדיטרפננואידים משמשים כמגשרים של הגנה כימית ואינטראקציות אינטראורגאיקליות. בין אלה, חומצות שרף diterpene בתוך הדברה ופתוגן הגנה של עצי מחטניים ומינים ספציפיים תערובות של diterpene מיקרוביאלית בגידולי מזון מרכזיים כגון תירס (Zea מייז) ו אורז (oryza סאטיבה) כבר בהרחבה למד6,7. פעילויות ביולוגיות אלה מספקות מאגר כימי עשיר ליישומים מסחריים, ובחירת diterpenoids משמשת כתרופות חשובות, תוספי מזון, דבקים, וביורוצינורות אחרים של החיים המודרניים היומיומיים8,9 ,10. כדי לקדם מחקר על הגיוון הטבעי ופונקציות ביולוגיות של diterpenoids ובסופו של דבר לקדם יישומים מסחריים רחבים יותר, כלים עבור הכנה חסכונית של תרכובות טהורות נדרשים. בידוד בקנה מידה גדול מחומר הצמח הוקם עבור כמה ביוטרואיד diterpenoid, כגון חומצות שרף diterpenoid המיוצרים כתוצר לוואי של תעשיית הנייר הזולה,8. עם זאת, הצטברות של diterpenoids ברקמות ספציפיות בלבד ותחת רגולציה הדוקה על ידי גירויים סביבתיים מגביל לעתים קרובות את הבידוד של סכומי מוצרים מספיקים ממפיק הטבעי2. בנוסף, המורכבות המבנית של דיטרפננואידים מסלים את הייצור שלהם באמצעות סינתזה כימית, למרות שגישות כאלה הצליחו במספר מקרים11,12. עם הזמינות של טכנולוגיות גנומית מתקדמת וביוכימית, פלטפורמות הייצור אנזימטיות צברה הגדלת תשומת לב להפקת מגוון תרכובות diterpenoid (ראה ביקורות13,14, 15,16,17,18).
כל הטרנואידים, כולל diterpenoids, נגזר שני מקדם-סמנים isoprenoid isopentenyl diפוספט (IPP) ו di allyl diפוספט (DMAPP)19 כי, בתורו, נוצרות דרך mevalonate (mva) או מתילאריתריטול-5-פוספט (MEP) מסלול. ביולוגי terpenoid ההכנסות דרך מסלול MEP בחיידקים ואת מסלול MVA בפטריות, בעוד צמחים בעלי ציטוסולג MVA ומסלול MEP הפלסטיות, עם האחרון להיות המסלול העיקרי לקראת היווצרות diterpenoid20. התעבות של IPP ו DMAPP על ידי העברת הסכם התפוקה המרכזית 20-פחמן מבשר לכל diterpenoids, geranylgeranyl diפוספט (GGPP)20. במורד המבנה של ggpp, שתי משפחות אנזימים, terpene סטנדרטים (tpss) ו ציטוכרום P450 monooxygenases P450s) שליטה במידה רבה על היווצרות המגוון הכימי המכריע של מטבוליזם terpene21,22. Diterpene סטנדרטים (מעודד) לזרז את המחזוריות הנהוגה על-ידי מחזוריות וסידור מחדש של ggpp כדי ליצור מגוון שונים של הדו-, פולי-, או מאקרו מחזורי מחזורית, מקפלים1,3,23, . עשרים וארבע חמצן ועוד קישוט פונקציונלי של הפיגומים האלה הוא הקלה לאחר מכן על ידי אנזימים P450 ולבחור משפחות אנזימים אחרים22,25. TPSs ו P450s להתקיים בדרך כלל כמו מינים ספציפיים, משפחות רב-גנים שיכולים ליצור רשתות biosynthetic מודולרי, שבו שילוב מודולים אנזימים שונים לאורך תוכנית משותפת מאפשר היווצרות של מגוון רחב של תרכובות2, 26. התגלית המהירה של אנזימים ברורים מבחינה פונקציונלית הפעלה מסלולים terpenoid מודולרי בשנים האחרונות סיפקה אפשרויות הרחבת לשימוש שלהם כרשימת חלקים תכליתי עבור הנדסת מטבולית של מסלולים חלקיים או מלאים ב פלטפורמות ייצור מבוססות צמחים ומיקרוביאלית. לדוגמה, שמרים (סכביסים cerevisiae ס) הוחל בהצלחה מהנדס multi-אנזים מסלולים לייצור של ביופואיד מלריה, כגון התרופה artemisinin שנת27, הדלק ביולוגי הסנסיטראיד ביאבולפן ו farnesene28, אבל גם לבחור diterpenoids29,30,31. באופן דומה, מהונדסים es, מהונדס בפלטפורמות קולי עבור ייצור בקנה מידה תעשייתי הוקמו עבור כמה מטבוליטים diterpenoid, כולל מיסוי מטקנול מספר המשמש כתרופה נגד סרטן ואת האלכוהול diterpenoid, sclareol , בשימוש בתעשיית הבושם13,32,33,34. התקדמות הנדסה גנטית טכנולוגיות שינוי גם הפכו מערכות מארח הצמח קיימא יותר ויותר להפקת מוצרים טבעיים הצמח9,14,35,36. בפרט, הטבק קרוב יחסית, טבק benthamiana, הפך מארז נרחב בשימוש עבור ניתוח המסלול terpenoid והנדסה, בשל הקלות של Agrobacterium-שינוי מתווך של שילובים גנים מרובים , ביוסינתזה יעילה של סמנים אנדודוגני, וביומסה גבוה14,35,36.
רישום על פלטפורמות אלה הוקמה עבור biopenoid ביוסינתזה, אנו מתארים כאן קל לשימוש וחסכוני שיטות לייצור אנזימטי של diterpenoids וטיהור של תרכובות יחיד. הפרוטוקולים המוצגים מדגימים כיצד E. coli ו -N. benthamiana פלטפורמות הנדסה עבור ביולוגי משופר diterpenoid הביוסינתזה יכול להיות מנוצל עבור הביטוי קומבינטורית של שונים Ditpss ו P450 אנזימים כדי ליצור תרכובות diterpenoid הרצוי. היישום של פרוטוקול זה כדי לייצר ולטהר diterpenoids שונים מבנית מוצג בדוגמה של diterpenoids מיוחדים מ תירס (Zea מייז), כינה dolabralexins, ביודוגני אנדוסינטזה של אשר מגייסים שני P450 ואחד אנזים. טיהור של dolabralexins שונים החל על-ידי אולפינים חמצון מושגת לאחר מכן על ידי שילוב החילוץ משפך הפרדה עם כרומטוגרפיה בקנה מידה גדול של עמוד סיליקה כרומטוגרפיה וכרומטותרפיה בלחץ גבוה נוזלי (בדיקות). הפרוטוקולים המתוארים ממוטבים לייצור diterpenoids, אבל יכול גם להיות מותאם בקלות עבור מחלקות terpenoid קשור, כמו גם מוצרים טבעיים אחרים שעבורם משאבי אנזימים זמינים. תרכובות המיוצרים באמצעות גישה זו מתאימים ליישומים שונים במורד הזרם, כולל אך לא מוגבל, אפיון מבניים באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח, להשתמש בתור מצעים למחקרים ותפקודי אנזימים, ומגוון של בעלי פעילות ביולוגית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoids ליצור מחלקה מגוונת של מולקולות קטנות הטבעית מוצרים המופצים באופן נרחב על פני ממלכות החיים יש פונקציות ביולוגיות קריטיות בתהליכים התפתחותיים, אינטראקציות בין-אורגאיתיות, והסתגלות סביבתית. בשל פעילויות ביולוגיות שונות אלה, הרבה דיטרפננואידים הינם גם בעלי חשיבות כלכלית כתרופות, תוספי מזון, דלק ביולוגי וביורוצינורות אחרים. גנומיקה מתקדמים וגישות ביוכימיים אפשרו עלייה מהירה בידע של diterpenoid-גנים מטבולית, אנזימים, ומסלולים. עם זאת, המורכבות המבנית של diterpenoids והתפלגות מטקמית צרה של תרכובות בודדות בדרך כלל רק מינים בודדים להישאר מגביל גורמים לייצור יעיל שלהם. הזמינות של מגוון רחב יותר של אנזימים מטבוליים מספקים כעת משאבים להפקת diterpenoids ב-מגדל מספיקות וטוהר כדי להקל על חקירה עמוקה יותר של קבוצת מטבוליזם חשוב זה. ציור על כלים שנקבעו עבור חיידקים ומבוסס על הצמח האנזים שיתוף ביטוי, אנו מציגים פרוטוקול מופעל בקלות להתאמה אישית עבור ייצור אנזימטי של diterpenoids ב es, coli או טבק benthamiana, ו טיהור של המוצרים הרצויים באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה ובדיקות למחצה. באמצעות הקבוצה של תירס (Zea מייז) dolabralexin diterpenoids כדוגמה, אנו להדגיש כיצד שילובים מודולריים של diterpenoids סטנדרטים (מדיטטית) ו ציטוכרום P450 monooxygenase (P450) אנזימים ניתן להשתמש כדי ליצור מקפלים שונים diterpenoids. תרכובות מטוהרים ניתן להשתמש ביישומים שונים במורד הזרם, כגון ניתוחים מבניים מטבוליט, מבנה האנזים מחקר הפונקציה, ו בתוך מבחנה ובניסויים ביולוגית רצפה.

עבודה סכמטית עבור ייצור diterpenoid באמצעות E. coli איור 1 ממחיש את זרימת העבודה המתוארת עבור ייצור diterpenoid. הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפלטפורמת E. coli בעבר שתוארה לביוסינתזה diterpenoid13,32 לשימוש בתרבויות נפח גדול יותר וטיהור של מוצרים diterpenoid הרצוי באמצעות סיליקה כרומטוגרפיה. כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה, השתמשנו מסלול dolabralexin שזוהו לאחרונה מ תירס המהווה שני מדיטגים, ZmAN2 (Zm00001d029648) ו ZmKSL4 (Zm00001d032858), רב תפקודי P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), ו ציטוכרום P450 רדוקטאז (ZmCPR2, Zm00001d026483) (איור 2). בקצרה, E. coli BL21DE3-C41 תאים המוסמכים השתנו מראש עם pcdfduet: IRS ו-pacyc-דואט: ggpps/ZmAN2 פלמידים13,32. PCDFDuet: הIRS הכנסה מכיל אנזימים מפתח עבור הייצור הקודמי diterpenoid, כולל 1-deoxy-d-xylulose-5-פוספט סטנדרטים (dxs), 1-deoxy-d-xylulose-5-פוספט רדוקטאז (dxs), ו isopentenyl diphosphate איזומראז (אידי), והוכח להגדיל את היווצרות diterpenoid ב -E. coli13. PACYC-דואט: GGPPS/ZmAN2 פלאבין מכיל את תירסלהיות-copalyl Diphosphate סטנדרטים ZmAN2 ו-ggpps סינתאז מ abies grandis. אנזימים מעודדים את התגובות מחויבות בביוסינתזה dolabralexin היו אז שינו שינוי כמו פלמידס pET28b: ZmKSL4 ו pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. לפרטים על רצפים ובנייה פלסטלינה לראות Mafu et al. 201839.
GC-MS chromatogram של מוצרי האנזים המחולצים מוצג באיור 3A, הממחישות את היווצרות של שלושה תרכובות דולאבalexin, כלומר dolabralexin (1.2 ± 0.25 Mg/l תרבות), אפוקסי (0.65 ± 0.2 Mg/l), ואפוקסידולרן (11.4 ± 1.1 mg/L תרבות) ככמת בהתבסס על עקומת תקן באמצעות sclareol diterpenoid. Sclareol שימש כתקן התייחסות, בשל מבנה דומה ותכונות כימיות לעומת dolabralexins. בדרך כלל נצפו לוואי משנית כוללים כלוראמננול, האינדול נגזרות אוקדול ו אינדול 5-אלדהיד, ו-geranylgeranyl diphosphate (באיור 3). אינדול מייצג בדרך כלל את התוצר הראשי העיקרי, אך אינו מוצג כאן, עקב זמן ההחזקה קצר יותר מאשר ההשהיה הממיסים של 7 דקות כדי לשמר את שלמות הכלי של GC-MS.
מבנה סכימטי של ייצור דיטרפנאיד באמצעות N. benthamiana איור 4 מתאר סקירה של הביטוי של השביל dolabralexin ב N. benthamiana. עבור המוצרים המתוארים כאן, המבנים הבאים השתנו בנפרד לתוך מאמץ GV3101: pLife33: p19 (ביטוי את הגן p19 השתקה חלבון מדכא ), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. רצפי מקורי באורך מלא של תירס dolabralexin מסלול גנים שימשו בינארי T-DNA וקטור pLife3341 עם התנגדות kanamycin להפצה ב -E. coli ו . tumefaciens. שיתוף ביטוי של הגנים מסלול טרפנאיד במעלה הזרם הוא אופציונלי, מאז geranylgeranyl בראש diphosphate נוצר באופן שורש ב N. benthamiana. עם זאת, מספר מחקרים המועסקים בהצלחה גישות כאלה כדי להגדיל את היווצרות diterpenoid ב N. benthamiana14,36,41. כפי שמודגם באיור 3, ביטוי משותף הפיק בהצלחה dolabradiene ו 15, 16-שמנת שמנת. שלא כמו ביטוי האנזים שיתוף ב- E. coli, 15, 16-האפוקסי שמלא זוהה בתמציות מטבוליט.
הנוכחות של 15, 16-שמני שמנת בתמציות עלים הפגינו את הפעילות של CYP71Z18 ב- N. benthamiana. כמו 15, 16-באפוקסי שקילה הוכח להיות יציב לאחר החילוץ מתרבויות מיקרוביאלית (איור 3), כמו גם לאחר בידוד מרקמות שורש תירס במחקרים קודמים39, נראה סביר כי המוצר הידרולכללי הוא גליסיליס על-ידי הגלימטיות אנדוגני ולאחר מכן בהפרדה בתוך החללים, עיבוד זה אינו נגיש לחילוץ עם תערובות ממיסים אורגני המשמשים כאן לחילוץ36,43,44,45 ,46. דומה שינויי מוצר בלתי רצויים בהקשר של הנדסת מסלול ב -N. benthamiana דווחו במחקרים קודמים47. כפי שמוצג לגבי ביטוי משותף ב -E. coli, ביטוי חולף ב-N. benthamiana התוצאות בהפקת של מספר לוואי, כולל alkanes ליניארי של שרשרת שונים כפי שהוא מבוסס על התייחסות למסדי נתונים ספקטרום מסה. מגדל תרכובת שחולצו מן החומר עלה נמצאו בממוצע 2.4 +/-0.5 mg dolabradiene ו 0.9 +/-0.3 mg 15, 16-באפוקסי לגרם ברקמת עלה יבש. מגדל אלה לא ניתן להשוות ישירות למערכת E. coli שיתוף ביטוי בהינתן מערכת ניסיוני שונים.
טיהור דיטרפנאיד טיהור diterpenoid הושג באמצעות כרומטוגרפיה של העמודה סיליקה ולאחר מכן למחצה הסדר. מטבוליט תמציות מ 12 ליטר של תרבויות E. coli במאגר היו מטוהרים באמצעות כרומטוגרפיה של העמודה סיליקה להפריד את שלושת תרכובות dolabralexin מוקד (איור 3a). סיליקה כרומטוגרפיה הוא אידיאלי להשגת טוהר גבוה של תרכובות היעד, כיוון שהוא מאפשר הפרדה פשוטה של הנגזרות של diterpene אולפינים ו חמצן, ובקלות מסיר את הזיהום העיקרי, oxindole, אשר נשמר על מטריצה סיליקה ( איור 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> איור 1: זרימת עבודה עבור ייצור diterpenoid ב -E. coli וטיהור מטבוליט מתרבויות בקטריאלי נוזלי. תיבות מקווקוות מתארות שלבים אופציונליים שבהם נדרש טיהור נוסף. (א) דמות ייצוגית של תרבות ה-coli המחולצות באמצעות משפך מופרדים. (ב) דמות מייצגת של טיהור מטבוליזם לחלץ באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> איור 2: המסלול הביוסינתטי Dolabralexin ו בנייה גנים המשמשים במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> איור 3: התוצאות של GC-MS. המוצג הם מייצגים GC-MS כרומאטוגרמות של מוצרי diterpenoid מטוהרים המתקבלים באמצעות אנזים שיתוף הביטוי בחני ב (א) E. coli ו (ב) נ. בנאמיאנה. שמות המוצרים מבוססים על השוואות לתקנים אותנטיים והתייחסות לספקטרום המסה של המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (נשים). 1, אוקדול; 2, אינדול 5-אלדהיד; 3, פירולו [1, 2-a] משושה-1, 4-dione, הקסהיהידרו-3-(2-מתילפרופיל)-; 4, 6-O-מרחריל -1-[4-ברומרופריל] thio]-א-ד-גלוקוסייד, S-דו-חמצני; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-אפוקסי; 7, פירולו [1, 2-a] משושה-1, 4-dione, הקסהיהידרו-3-(פנילמתיל)-; 8, 15, 16-אפוקסי-דולאבראנל; 9 ו -12, לא ידוע; 10, כלורמפאנקול; 11, 3, 7, 11, 15-טטרמתיל -2-hexadecen-1-ol; .13-16, אלקאנס <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> איור 4: ייצור דיטרפנאיד ב -N. benthamiana. (א) זרימת עבודה של ייצור diterpenoid ב N. benthamiana וטיהור מטבוליט מחומר עלה. (ב) דמות ייצוגית של N. benthamiana צמחים מוכן לניסויים חדירה, לפני גיזום. (ג) תמונות מייצגות של הצמחים של N. benthamiana לאחר גיזום. (ד) תמונה של מזרק-לחדור עלים. . אזורים אפלים החדרנו לחדרו <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

פרוטוקול זה מתאים לייצור diterpenoids מטוהרים שניתן להשתמש בהם לניתוח במורד הזרם שונה והוא יכול להיות מותאם אישית עבור מגוון רחב של מטרות מטבוליט שונות. היתרון העיקרי של שיטה זו היא שזו שיטה פשוטה וזולים לייצר כמויות מיליגרם של מטבוליטים מיוחדים. על ידי החלפת הגנים והאנזימים המשמשים לביטוי שותף, ניתן לשנות שיטה זו כדי לייצר טרפנואידים אחרים, כולל מונוטרפנואידים ו sesquiterpenoids, כמו גם מחלקות מטבוליט אחרות כגון פלבנואידים.עבור ייצור מטבולי diterpenoid וטרנספורמציה, להתחיל על ידי חימום תאי E.coli מוסמכים כימית על קרח. כאשר התרבות הפשירה, להוסיף 25 microliters של תאים מוכשרים לכל מבנה למיקרו-צינור 1.5 מיליליטר מקורר ולהוסיף 1 microliter של 100 ננוגרם לכל פתרון microliter של כל מבנה המשמש לביטוי שותף. הדגירה את תערובות על הקרח במשך 30 דקות עם ערבוב עדין כל 10 דקות על ידי גירוד הצינורות על פני מתלה microtube.בסוף הדגירה, החום מזעזע את תערובות התאים ב-42 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת לפני שהוא מניח את התאים בחזרה על הקרח למשך שתי דקות נוספות לפחות. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של 37 מעלות צלזיוס SOC בינוני לצינורות. ולהדקר את התרבויות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 200 סיבובים לדקה.בסוף הדגירה, מוסיפים כ -10 חמוזי זכוכית autoclaved ו 100 microliters של תאים אחד 37 מעלות צלזיוס חימם צלחת אגר מרק lysogeny עם האנטיביוטיקה המתאימה. ולנער את הצלחת אופקית עם המכסה במקום כדי לפזר את התאים באופן שווה. לאחר מכן, בעדינות להקיש על גם לתוך מיכל פסולת ולהדגר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה, צד משטח מצופה למטה.למחרת, הסר את הצלחת מהחרם. הוסף 5 מיליליטר של מדיום מרק lysogeny מוכן טרי עם האנטיביוטיקה המתאימה אחד 15 צינור זכוכית סטרילי מיליליטר עם כובע פלסטיק נושם לכל תרבות 1 ליטר מתוכנן, ולהשתמש קצה צינור לבחור בודדים טרנספורמציה E.Coli מושבות מצלחת אגר. הוסיפו מושבה אחת שנבחרה לכל אחד מ-15 הצינורות המוכנים של מיליליטר וכסו כל צינור עם מכסה הפלסטיק הנשום הנלווה.לאחר מכן, מניחים את התרבויות הקטנות E.coli כתרים ב 37 מעלות צלזיוס רועד אינקובטור במשך 12 עד 24 שעות. למחרת להוסיף 100 מיליליטר של 10x PBS ל 900 מיליליטר של מרק נהדר בבקבוק 1 ליטר לכל תרבות קטנה עם אנטיביוטיקה המתאימה. ומ מניחים את flasks ב 37 מעלות צלזיוס ו 140 סיבובים לדקה במשך כ 30 דקות.כאשר המרק הנהדר חם, מוסיפים את כל נפח 5 המיליליטר של כל תרבות חיסון לבקבוק תרבות אחד של 1 ליטר לתרבות. ומ מניחים את הבקבוקים באינקובטור הרועד ב-140 סיבובים לדקה במשך כ-3 שעות. כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.6, להפחית את הטמפרטורה של החממה ל 16 מעלות צלזיוס.לאחר החממה התקרר, להוסיף 1 מיליליטר של IPTG טוחן אחד, 1 מיליליטר של טרי מוכן 4 גרם לליטר ריבופלבין ו 1 מיליליטר של 150 גרם לליטר חומצה אמינו-לוולינית לכל תרבות. לייצור דיטרפנואידים, הוסיפו 25 מיליליטר של נתרן פירובט טוחן אחד לכל תרבות כדי להבטיח היווצרות מבשר מספקת. לאחר מכן, הדגירה את התרבויות ב 16 מעלות צלזיוס ו 140 סיבובים לדקה במשך 72 שעות, הוספת 25 מיליליטר של פירובט נתרן מדי יום לתרבויות המתאימות.להפרדה וטיהור מטבוליטים, יש לאבטח משפך מפריד על מעמד טבעת במכסה המנוע של האדים. ושים מיכל פסולת מתחת למשפך. יוצקים 500 מיליליטר של פתרון 50/50 של אתיל אצטט והקסאן לתוך המשפך המפריד.ולהוסיף 500 מיליליטר של תרבות הביטוי המשותף E.coli טרנספורמציה של עניין לתוך המשפך. מניחים את פקק הזכוכית על המשפך ומנערים את המשפך 5 עד 10 פעמים כדי לערבב את התרבות עם ממס החילוץ, לעתים קרובות פותחים את המשפך בעוד המשפך הפוך ומכוון אותו לתוך מכסה המנוע של האדים כדי לדגום את המשפך. לאחר סיבוב שני של רעידות ו degassing כפי שהוכח רק, מניחים את המשפך זקוף לעמוד הטבעת במשך כדקה אחת.כאשר שכבת הממס העליונה נפרדה משכבת התרבות המים, הסר את הפורק ורוקן את שכבת ה- E.coli לתוך מקור פסולת, תוך שמירה על שכבת הממס בתוך המשפך. לאחר מכן, לחזור על החילוץ עם הנותרים 500 מיליליטר של התרבות באמצעות אותם 500 מיליליטר של ממס המשמש לחילוץ הראשון, לפני ניקוז הממס המכיל את המטבוליטים שחולצו לתוך בקבוקון נקי. כאן מוצג כרומטוגרם הספקטרומטריה של כרומטוגרפיה גז-מסה מייצגת של מוצרי אנזימים טיפוסיים שחולצו.תוצרי לוואי קלים שנצפו בדרך כלל כוללים כלוראמפניקול ונגזרות אינדולה אוקסינדול ואינדול פיוואלדהיד. לאחר טיהור diterpenoid באמצעות כרומטוגרפיה עמוד סיליקה, שלוש תרכובות dolabralexin ניתן להשיג, כפי לכמת בהתבסס על עקומה סטנדרטית באמצעות sclareol diterpenoid. כרומטוגרפיה סיליקה הוא אידיאלי להשגת טוהר גבוה של תרכובות היעד.מאז זה מאפשר הכנה פשוטה של אולפינים diterpene ונגזרות מחומצן ומסיר בקלות את oxindole זיהום גדול, אשר נשמר על מטריצת סיליקה. כמו כן, הביטוי השותף של הגנים מסלול טרפנואיד יכול לשמש כדי לייצר diterpenoids ב N.Benthamiana, וכתוצאה מכך הייצור של dolabradiene ו 15, 16 אפוקסידולברן. הממסים המשמשים במהלך החילוץ צריך להיות אופטימיזציה עבור תכונות כימיות פיזיות של מטבוליטים של עניין ולא חייב להיות מעורב עם מים כדי לשמור על שתי שכבות נפרדות.בעקבות הליך זה, מטבוליטים מטוהרים יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח מבני וחומצות אנטיביוטיות. טכניקה זו אפשרה את הגילוי של diterpenoids הרומן, כולל אלה המוצגים כאן, המאפשר מטבוליטים אלה להיות מנותח עבור המבנה הכימי שלהם biactivies חדש. לנקוט אמצעי זהירות בעת שימוש בממסים אורגניים במשפך הפרדה.הקפד תמיד להיפטר מפסולת ביולוגית בהתאם לתקני הבטיחות במעבדה שלך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...