Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
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Ringraziamo con gratitudine il Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) per aver fornito i costrutti pIRS e pGGx-mAN2. Sostegno finanziario a questo lavoro da parte del NSF Plant-Biotic Interactions Program (grant 1758976 a P.z.), DOE Early Career Research Program (grant s- SC0019178 a P.z.), il DOE Joint Genome Community Science Program (concedere cSP2568 a P. Graduate Research Fellowship Program (a K.M.M.), e una borsa di studio Mentorship Award di UC Davis Dean (a K.M.M.) sono riconosciuti con gratitudine.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Un'indagine e un'applicazione più ampie dei prodotti naturali diterpenoidi richiedono protocolli semplici e poco costosi per sintetizzare e purificare quantità sufficienti di composti desiderati. Il rapido aumento del numero di enzimi diterpenoidi-metabolici disponibili da un'ampia gamma di specie fornisce ora un ampio inventario per la produzione enzimatica di diterpenoidi utilizzando sistemi di accoglienza microbici e vegetali. Inoltre, l'architettura modulare di molti percorsi diterpenoidi consente l'uso di enzimi della stessa specie o di specie diverse in approcci di ingegneria combinatori 'plug & play' per generare una serie di diterpenoidnaturali naturali naturali e nuove nature simili prodotti2,14,26,35.
E. coli è un ospite microbico preferito per la biosintesi naturale dei prodotti grazie alla sua robustezza, alla facilità di scalabilità, alla limitata complessità chimica per la riduzione della contaminazione da sottoprodotto e alla ricchezza di strumenti disponibili per l'assemblaggio e l'espressione del DNA Ottimizzazione. Nella nostra esperienza, la piattaforma qui descritta è adatta per la produzione di rese di prodotto fino a diverse centinaia di mg di olefin e alcoli diterpene, che è adatto per molte applicazioni a valle tra cui quelle proposte qui. Pur non rispettando la scala industriale, la piattaforma di produzione qui descritta può servire come base per ulteriori percorsi, host e ottimizzazione della fermentazione, come è stato dimostrato con successo per diterpenoidi correlati come taxadiene e sclareol33 ,34. È stata stabilita una sovraespressione dei geni del percorso MVA o MEP che limitano i tassi per superare i fattori di limitazione dei rendimenti per la biosintesi diterpenoide, come l'insufficiente offerta precursore e il flusso precursore in percorsi concorrenti13, 32,33,39. Anche se si è dimostrato di successo in diversi studi, scarsa espressione e attività catalitica di P450 trapenoidi-metabolici e altri enzimi legati alla membrana in E. coli è un probabile fattore limitante33,39 ,48,49,50,51,52. L'uso di sequenze ottimizzate per codone e modifiche proteiche, come la rimozione del peptide del segnale del reticolo endoplasmico o l'introduzione di un peptide segnale plastidiale, si sono dimostrate utili per aumentare l'espressione P450 solubile14,38 ,49,50,53. Tali modifiche sono state impiegate anche per la co-espressione microbica del mais CYP71-1839 utilizzato come percorso di esempio in questo studio. I protocolli descritti si basano sull'uso di plasmidi che trasportano uno o due geni per costrutto, tutti sotto lo stesso promotore inducibile. Laddove si desiderino combinazioni di geni su larga scala, è consigliabile utilizzare varie cassette multigeniche o sistemi di impilamento genico disponibili per mitigare l'efficienza di trasformazione ridotta e la crescita della coltura dovuta all'uso di plasmidi e antibiotici multipli13 .
Con la più ampia disponibilità di risorse genetiche e genomiche, anche i sistemi di ospiti delle piante diventano sempre più adatti alla produzione di prodotti naturali. I vantaggi includono la capacità delle piante di produrre i precursori naturali richiesti alimentati dalla fotosintesi, consentendo così la formazione del prodotto senza la necessità di integrare le molecole precursori54,55. N. benthamiana è già ampiamente utilizzato per la caratterizzazione funzionale in vivo e l'espressione combinatoria di terpenoide e altri percorsi di prodotto naturali14,35,36,40 . Notevoli vantaggi derivanti dall'utilizzo di N. benthamiana come sistema host includono la produzione endogena di precursori diterpenoidi, l'uso di sequenze geniche native, l'espressione semplificata dei P450 eucarici, la facilità di trasformazione genica combinatoria (come antibiotici separati non sono necessari per la co-trasformazione transitoria e la semplice estrazione di prodotti bersaglio dal materiale fogliare. Ove necessario, la produzione di diterpenoide può essere migliorata attraverso la co-espressione dei geni chiave del percorso MEP per aumentare l'offerta precursore36,41. I vincoli per la produzione scalabile di diterpenoide in N. benthamiana sono più complessi rispetto alle colture microbiche liquide a causa della necessità di generare biomassa vegetale sufficiente, la purificazione dei prodotti ad alta intensità di lavoro da complessi chimicamente tessuto vegetale, e possibile metabolizzazione indesiderata dei prodotti bersaglio attraverso, ad esempio, l'ossidazione, glicosilazione o dephosphorylation da enzimi endogeni36,43,44,45 ,46,47. Tuttavia, questa procedura può essere aumentata fino a quantità di prodotti mg aumentando il numero di piante utilizzate per l'agroinfiltrazione56.
I protocolli di estrazione e purificazione dei prodotti qui descritti sono compatibili con E. coli e N. benthamiana, così come S. cerevisiae e altri sistemi host vegetali o microbici, e forniscono un approccio conveniente che è facile da sia nei laboratori di biologia che in quelli di chimica e non richiede costose attrezzature di purificazione. L'estrazione dei metaboliti con un imbuto separatore è adatta per un'estrazione efficiente e la separazione di fase prima della purificazione cromatografica. Le dimensioni delle imbuto possono essere facilmente regolate per consentire volumi di coltura più grandi e ridurre il tempo sperimentale necessario per estrarre da colture di grandi dimensioni. Abbiamo trovato l'uso di un gradiente di acetato esagonale/etilico per essere ideale per l'estrazione diditerloidi di polarità diversa come dimostrato qui per il gruppo di dolabralexine che comprendono sia idrocarburi e composti ossigenati (Figura 3). A seconda delle proprietà dei prodotti di destinazione, altre miscele di solventi possono essere vantaggiose. Tuttavia, i solventi non devono essere miscibili con acqua per garantire il successo dell'estrazione e della separazione di fase utilizzando la tecnica dell'imbuto separatore. Inoltre, la perdita di prodotto attraverso l'evaporazione deve essere presa in considerazione quando si utilizza questo approccio per la produzione di composti organici volatili (VOC), come mono e sesqui-terpenoidi a basso peso molecolare e altri COV. La separazione cromatografica dei diterpenoidi di diversi livelli di ossigenazione utilizzando una colonna di silice su larga scala (2 L) è stata vantaggiosa nella nostra esperienza, poiché fornisce una migliore separazione del prodotto e riduce al minimo la necessità di purificazione iterativa quando si utilizzano volumi di colonne più piccoli. I volumi e le matrici delle colonne possono essere regolati in base alle esigenze per il volume di coltura desiderato e il tipo di prodotto naturale. La purezza dei prodotti target che possono essere raggiunti utilizzando questo protocollo è adatta a molte applicazioni a valle, come i saggi di bioattività o per l'uso in analisi dell'attività enzimatica. Tuttavia, laddove sono richiesti livelli di purezza più elevati, come le analisi strutturali tramite NMR, la purezza del prodotto può essere migliorata in modo efficiente mediante una purificazione aggiuntiva mediante HPLC (semi)-preparativo.
Questo protocollo qui descritto è stato ottimizzato per la produzione di prodotti naturali diterpenoidi, ma può anche essere facilmente personalizzato in base a mono-, sesqui e tri-terpenoidi correlati, così come ad altre classi di prodotti naturali semplicemente generando l'enzima desiderato moduli per l'espressione combinatoria14,57. Tuttavia, le modifiche delle procedure per l'estrazione e la purificazione dei prodotti devono essere prese in considerazione per i composti con maggiore volatilità, come mono e sesqui-terpenoidi, o una maggiore polarità e modifica funzionale come esemplificato da glicosilazione di molti triterpenoidi, fenilpropanoidi e altre classi di prodotti naturali.
Sebbene siano disponibili piattaforme su scala industriale per la fabbricazione di prodotti naturali, i protocolli qui descritti offrono uno strumento economico e personalizzabile che può essere facilmente impostato nella maggior parte dei laboratori. Come dimostrato dalla produzione di dolabralexine di mais qui e altrove39, le quantità di prodotto e la purezza che possono essere raggiunte utilizzando questo approccio sono in genere sufficienti per facilitare varie analisi e usi a valle, tra cui, ma non limitata a vari studi di bioattività, analisi delle interazioni tra organismi, nonché per l'uso come substrati enzimatici o come materiale di partenza per approcci di semisintesi.

I diterpenoidi costituiscono un gruppo chimicamente diversificato di oltre 12.000 prodotti naturali prevalentemente policiclici a 20 carbonio che svolgono ruoli critici in molti organismi1. Funghi e piante producono la più grande diversità di diterpenoidi, ma i batteri hanno anche dimostrato di formare diterpenoidi bioattivi (vedi recensioni2,3,4,5). Radicati nella loro vasta diversità strutturale, i diterpenoidi servono una moltitudine di funzioni biologiche. Alcuni diterpenoidi, come gli ormoni della crescita gibberellina, hanno funzioni essenziali nei processi di sviluppo5. Tuttavia, la maggior parte dei diterpenoidi servono come mediatori di difesa chimica e interazioni interorganismisali. Tra questi, gli acidi di resina diterpene nella difesa dei parassiti e agenti patogeni di alberi di conifere e miscele specifiche di specie di diterpenope antimicrobici nelle principali colture alimentari come il mais (zea mays) e il riso (Oryza sativa) sono stati più ampiamente studiato6,7. Queste bioattività forniscono un ricco archivio chimico per applicazioni commerciali, e diterpenoidi selezionati sono utilizzati come importanti prodotti farmaceutici, additivi alimentari, adesivi, e altri bioprodotti della vita moderna quotidiana8,9 ,10. Per far progredire la ricerca sulla diversità naturale e le funzioni biologiche dei diterpenoidi e, in ultima analisi, promuovere applicazioni commerciali più ampie, sono necessari strumenti per la preparazione efficiente in termini di costi dei composti puri. L'isolamento su larga scala dal materiale vegetale è stato stabilito per alcuni bioprodotti diterpenoidi, come gli acidi di resina diterpene che vengono prodotti come sottoprodotto dell'industria della cellulosa e della carta8. Tuttavia, l'accumulo di diterpenoidi solo in tessuti specifici e sotto stretta regolamentazione da parte di stimoli ambientali spesso limita l'isolamento di quantità sufficienti di prodotti dal produttore naturale2. Inoltre, la complessità strutturale dei diterpenoidi ostacola la loro produzione attraverso la sintesi chimica, anche se tali approcci hanno avuto successo in diversi casi11,12. Con la disponibilità di tecnologie genomiche e biochimiche avanzate, le piattaforme di produzione enzimatica hanno guadagnato sempre più attenzione per la produzione di una gamma di composti diterpenoidi (vedi recensioni13,14, 15,16,17,18).
Tutti i terpenoidi, compresi i diterpenoidi, sono derivati da due precursori isoprenoidi isomerici, il difosfato di istenil (IPP) e il difosfato didimioillalzato (DMAPP)19 che, a loro volta, si formano attraverso il mevalonato (MVA) o il percorso metiletritolo-5-fosfato (MEP). La biosintesi terpenoide procede attraverso il percorso MEP nei batteri e il percorso MVA nei funghi, mentre le piante possiedono un MVA citosolico e un percorso plastidiale MEP, con quest'ultimo che è il percorso primario verso la formazione di diterpenoide20. La condensazione di IPP e DMAPP da parte di transfersi prenyl produce il precursore centrale di 20 carbonio di tutti i diterpenoidi, geranilgeranil difosato (GGPP)20. A valle della formazione ggPP, due famiglie di enzimi, sintetisi terpene (TPS) e monossisisi P450 citoccherate (P450) controllano in gran parte la formazione della vasta diversità chimica del metabolismo terpenoide21,22. Le sinteasi diterpene (diTSP) catalizzano la ciclicizzazione e ilriarrangiamento di GGPP stereospecifici per formare vari scaffold stereotiformi bi-, poli-, o macro-ciclici 24. L'ossigenazione e l'ulteriore decorazione funzionale di questi scaffold è quindi facilitata da enzimi P450 e selezionare altre famiglie di enzimi22,25. I TSP e i P450 esistono comunemente come famiglie multigeniche specifiche per specie che possono formare reti biosintetiche modulari, dove la combinazione di diversi moduli enzimatici lungo un blueprint comune consente la formazione di un'ampia gamma di composti2, 26.La rapida scoperta di enzimi funzionalmente distinti che operano in percorsi terpenoidi modulari negli ultimi anni ha fornito opportunità di espansione per il loro utilizzo come elenco di parti versatili per l'ingegneria metabolica di percorsi parziali o completi in piattaforme di produzione microbiche e vegetali. Ad esempio, il lievito (Saccharomyces cerevisiae) è stato applicato con successo per progettare percorsi multienzimi per la produzione di bioprodotti terpenoidi, come il farmaco antimalarico artemisinina27, i biocarburanti sestantistici bisabolene e farnesene28, ma anche selezionare diterpenoidi29,30,31. Allo stesso modo, sono state create piattaforme escherichia coli ingegnerizzate per la produzione su scala industriale per alcuni metaboliti diterpenoidi, tra cui il taxadiene precursore Taxol usato come farmaco anti-cancro e l'alcol diterpene, sclareol , utilizzato nell'industria delle fragranze13,32,33,34. I progressi nell'ingegneria genetica e nelle tecnologie di trasformazione hanno anche reso i sistemi di accoglienza delle piante sempre più vitali per la produzione di prodotti naturali vegetali9,14,35,36. In particolare, la stretta parente tabaccosa, Nicotiana benthamiana, è diventata un telaio ampiamente utilizzato per l'analisi e l'ingegneria del percorso terpenoide, grazie alla facilità di trasformazionemediata di combinazioni geniche multiple , biosintesi efficiente dei precursori endogeni, e biomassa elevata14,35,36.
Attingendo a queste piattaforme consolidate per la biosintesi terpenoide, qui descriviamo metodi facili da usare ed efficienti in termini di costi per la produzione enzimatica di diterpenoidi e la purificazione dei singoli composti. I protocolli presentati illustrano come le piattaforme E. coli e N. benthamiana progettate per una maggiore biosintesi precursore di diterpenoide possono essere utilizzate per l'espressione combinatoria di diversi diTPe e P450 enzimi da generare composti diterpenoidi desiderati. L'applicazione di questo protocollo per produrre e purificare diterpenoidi strutturalmente diversi è dimostrata da esempio di diterpenoidi specializzati dal mais(zea mays),definite dolabralexine, biosintesi endogeniche di cui recluta due diTPS e un P450 enzima m. La purificazione di diverse dolabralexine che vanno dalle olepine ai derivati ossigenati viene quindi ottenuta combinando l'estrazione a imbuto separatore con la cromatografia a colonna silice su larga scala e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). I protocolli descritti sono ottimizzati per la produzione di diterpenoidi, ma possono anche essere facilmente adattati per le classi terpenoidi correlate, così come altri prodotti naturali per i quali sono disponibili risorse enzimatiche. I composti prodotti utilizzando questo approccio sono adatti per varie applicazioni a valle, tra cui, ma non solo, la caratterizzazione strutturale tramite l'analisi della risonanza magnetica nucleare (NMR), l'uso come substrati per studi funzionali enzimatici e una serie di bioattività.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

I diterpenoidi formano una classe diversificata di piccoli prodotti naturali molecolari che sono ampiamente distribuiti tra i regni della vita e hanno funzioni biologiche critiche nei processi di sviluppo, nelle interazioni interorganismiali e nell'adattamento ambientale. A causa di queste varie bioattività, molti diterpenoidi sono anche di importanza economica come prodotti farmaceutici, additivi alimentari, biocarburanti e altri bioprodotti. La genomica avanzata e gli approcci biochimici hanno permesso un rapido aumento della conoscenza dei geni diterpenoidi-metabolici, degli enzimi e delle vie. Tuttavia, la complessità strutturale dei diterpenoidi e la distribuzione tassonomica ristretta dei singoli composti in una sola specie rimangono fattori vincolanti per la loro produzione efficiente. La disponibilità di una più ampia gamma di enzimi metabolici fornisce ora risorse per la produzione di diterpenoidi in sufficiente titer e purezza per facilitare un'indagine più approfondita di questo importante gruppo di metaboliti. Attingendo a strumenti consolidati per la co-espressione enzimatica microbica e vegetale, presentiamo un protocollo facilmente gestibile e personalizzabile per la produzione enzimatica di diterpenoidi in Escherichia coli o Nicotiana benthamiana, e la purificazione dei prodotti desiderati tramite cromatografia in silice e HPLC semi-preparativo. Utilizzando come esempio il gruppo di mais(zea mays),gli enzimi della dolabralexina, evidenziano come possono essere utilizzate combinazioni modulari di synthasi diterpene (diTPS) e citocromo P450 monoosasi (P450) per generare diverse scaffold diterpenoidi. I composti purificati possono essere utilizzati in varie applicazioni a valle, come le analisi strutturali dei metaboliti, gli studi sulla struttura enzimatica e in vitro e negli esperimenti di bioattività vegetale.

Flusso di lavoro schematico per la produzione di diterpenoide con E. coli Figura 1 illustra il flusso di lavoro descritto per la produzione di diterpenoide. Il protocollo qui descritto è stato adattato da una piattaforma E. coli descritta in precedenza per la biosintesi diterpenoide13,32 perl'uso di colture di grandi volumi e la purificazione dei prodotti diterpenoidi desiderati tramite silice Cromatografia. Per dimostrare l'uso di questo protocollo, abbiamo utilizzato un percorso dolabralexin recentemente identificato dal mais che comprende due diStUS, smAN2 (M00001d029648) e .mKSL4 (m00001d032858), un P450 multifunzionale (CYP71 la riduzione (MCPR2, M00001d026483) (Figura 2). In breve, le celle competenti di E. coli BL21DE3-C41 sono state pre-trasformate con pCDFDuet:IRS e pACYC-Duet:GGPPS/ 'mAN2 plasmiche13,32. Il pCDFDuet: Plasmid contiene enzimi chiave per la produzione precursore diterpenoide, tra cui 1-deossiosa-D-xylulose-5-fosfato synthase (dxs), 1-deossiosa-D-xylulose-5-fosfato reductase (dxr) e isopentenyl isomerasi difosato (idi), ed è stato indicato per aumentare la formazione di diterpenoide in E. coli13. Il pLasmid pACYC-Duet:GGPPS/ smAN2 contiene il plasmaent-copalyl diphosphate synthase smAN2 e una synthase GGPP da Abies grandis. Gli enzimi che catalizzavano le reazioni commesse nella biosintesi della dolabralexina sono stati poi co-trasformati come plasmidi pET28b: Per informazioni dettagliate su sequenze e costrutti plasmidevedere Mafu et al.
Un cromatogramma GC-MS dei prodotti enzimatici estratti è illustrato nella figura 3A, che illustra la formazione di tre composti di dolabralexina, vale a dire dolabradiene (1,2 x 0,25 mg/L cultura), eposydolabrene (0,65 - 0,2 mg/L cultura), e epoxydolabranol (11.4 1,1 mg/l di coltura) come quantificato in base a una curva standard utilizzando lo sclareol diterpenoide. Sclareol è stato utilizzato come standard di riferimento, grazie alla sua struttura simile e alle proprietà chimiche rispetto alle dolabralexine. Tipicamente osservati sottoprodotti minori includono cloramfenicolo, i derivati indole oxindole e indole-5-aldeide, e il precursore geranilgeranil difosfato (GGPP) (Figura 3). Indole rappresenta comunemente il sottoprodotto primario, ma non è mostrato qui, a causa del suo tempo di ritenzione più breve rispetto al ritardo del solvente impostato di 7 min per preservare l'integrità dello strumento GC-MS.
Flusso di lavoro schematico della produzione di diterpenoide utilizzando N. benthamiana Figura 4 raffigura una panoramica dell'espressione del percorso dolabralexina in N. benthamiana. Per i prodotti qui descritti, i seguenti costrutti sono stati trasformati separatamente in ceppo A. tumefaciens GV3101: pLife33:p19 (esprimendo la proteina soppressore del silenziamento del gene p19), pLife33: Sequenze native a lunghezza intera dei geni della via di mais dolabralexin sono state utilizzate nel vettore binario T-DNA pLife3341 con resistenza alla kanamicina per la propagazione in E. coli e A. tumefaciens. La co-espressione dei geni della via terpenoide a monte è facoltativa, poiché il difosfato geranilgeranilo precursore è formato endogenamente in N. benthamiana. Tuttavia, diversi studi hanno impiegato con successo tali approcci per aumentare la formazione di diterpennoidi in N. benthamiana14,36,41. Come illustrato nella Figura 3, co-espressione ha prodotto con successo dolabradiene e 15,16-epoxydolabrene. A differenza della co-espressione enzimatica in E. coli, 15,16-epoxydolabranol non è stato rilevato negli estratti di metaboliti.
La presenza di 15,16-epoxydolabrene in estratti di foglie ha dimostrato l'attività di CYP71-18 in N. benthamiana. Come 15,16-epoxydolabranol è stato indicato per essere stabile dopo l'estrazione da colture microbiche (Figura 3) così come dopo l'isolamento dai tessuti della radice di mais negli studi precedenti39, sembra plausibile che il prodotto idrossilato è glicosylated da glicosileseree endogene e successivamente sequestrate nella vacuole, rendendolo inaccessibile all'estrazione con le miscele di solventi organici utilizzate qui per l'estrazione36,43,44,45 ,46. Simili modifiche indesiderate del prodotto nel contesto dell'ingegneria del percorso in N. benthamiana sono state riportate in studi precedenti47. Come mostrato per la co-espressione in E. coli, l'espressione transitoria in N. benthamiana determina l'estrazione di diversi sottoprodotti, inclusi gli alcani lineari di diversa lunghezza della catena in base al confronto con i database degli spettri di massa. I totienti composti estratti dal materiale fogliario sono stati trovati in media 2,4 s/- 0,5 mg di dolabradiene e 0,9 x/- 0,3 mg 15,16-epoxydolabrene per g tessuto a foglia secca. Questi titers non possono essere confrontati direttamente con il sistema di co-espressione E. coli dati i diversi allestimenti sperimentali.
Purificazione dei diterpenoidi La purificazione dei diterpenoidi è stata ottenuta utilizzando la cromatografia a colonna di silice e la successiva HPLC semi-preparativa. Estratti di metaboliti da 12 L di colture e. coli in pool sono stati purificati utilizzando la cromatografia a colonna di silice per separare i tre composti focali della dolabralexina (Figura 3A). La cromatografia della silice è ideale per ottenere un'elevata purezza dei composti bersaglio, poiché consente una semplice separazione delle ottolle olefisiche diterpene e dei derivati ossigenati, e rimuove facilmente il contaminante principale, l'ossindolo, che viene mantenuto sulla matrice di silice ( Figura 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per la produzione di diterpenoide in E. coli e purificazione dei metaboliti da colture batteriche liquide. Le scatole tratteggiate illustrano passaggi facoltativi in cui è necessaria una purificazione aggiuntiva. (A) Immagine rappresentativa della coltura E. coli estratta utilizzando un imbuto separatore. (B) Immagine rappresentativa della purificazione dell'estratto di metabolita mediante cromatografia di silice.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figura 2: Costrutti genici e di percorsi biosintetici di Dolabralexina utilizzati in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figura 3: risultati GC-MS. Sono mostrati cromatogrammi GC-MS di prodotti diterpenoidi purificati ottenuti utilizzando saggi di co-espressione enzimatica in (A) E. coli e (B) N. benthamiana. Le identificazioni dei prodotti si basano su confronti con standard autentici e spettri di massa di riferimento della biblioteca spettrale di massa del National Institute of Standards and Technology (NIST). 1, osindolo; 2, indole-5-aldeide; 3, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-(2-metilpropyl)-; 4, 6-O-Acetyl-1-[[4-bromophenyl]thio]-a-d-glucoside S,S-diossido; 5, dolabradiene; 6, 15,16-epoxydolabrene; 7, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15,16-epoxydolabranol; 9 e 12, sconosciuti; 10, clororamenico; 11, 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol; 13-16, alcani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figura 4: Produzione di diterpenoide in N. benthamiana. (A) Flusso di lavoro di produzione diterpenoide in N. benthamiana e purificazione dei metaboliti dal materiale fogliare. (B) Immagine rappresentativa delle piante N. benthamiana pronte per gli esperimenti di infiltrazione, prima della potatura. (C) Immagini rappresentative delle piante di N. benthamiana dopo la potatura. (D) Immagine di foglie infiltrate di siringhe. Le aree più scure sono state infiltrate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Qui presentiamo protocolli facili da usare per la produzione e la purificazione di metaboliti diterpenoidi attraverso l'espressione combinatoria di enzimi biosintetici in Escherichia coli o Nicotiana benthamiana, seguita da prodotto cromatografico Purificazione. I metaboliti risultanti sono adatti per vari studi, tra cui la caratterizzazione della struttura molecolare, gli studi funzionali degli enzimi e i saggi di bioattività.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Questo protocollo è adatto per la produzione di diterpenoidi purificati che possono essere utilizzati per diverse analisi a valle e possono essere personalizzati per una gamma di diversi bersagli metaboliti. Il vantaggio principale di questo metodo è che è un metodo semplice ed economico per produrre quantità di milligrammi di metaboliti specializzati. Scambiando i geni e gli enzimi utilizzati per la co-espressione, questo metodo può essere modificato per produrre altri terpenoidi, inclusi monoterpenoidi e sesquiterpenoidi, così come altre classi di metaboliti come i flavonoidi.Per la produzione e la trasformazione metabolica diterpenoide, iniziare riscaldando le cellule E.coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Quando la coltura si è scongelata, aggiungere 25 microlitri di cellule competenti per costrutto a un microtubo refrigerato da 1,5 millilitri e aggiungere 1 microlitro di una soluzione di 100 nanogrammi per microlitro di ogni costrutto utilizzato per la co-espressione. Incubare le miscele sul ghiaccio per 30 minuti con miscelazione delicata ogni 10 minuti raschiando i tubi attraverso un rack di microtubi.Alla fine dell'incubazione, scaldare le miscele cellulari a 42 gradi Celsius per un minuto prima di riposizionare le cellule sul ghiaccio per almeno altri due minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di 37 gradi Celsius SOC medio ai tubi. E incubare le colture per un'ora a 37 gradi celsius e 200 rotazioni al minuto.Al termine dell'incubazione, aggiungere circa 10 perline di vetro autoclavato e 100 microlitri di cellule a una piastra di agar di brodo di lisogenia riscaldata di 37 gradi Celsius con gli antibiotici appropriati. E agitare la piastra orizzontalmente con il coperchio in posizione per distribuire uniformemente le cellule. Quindi, toccare delicatamente le perline di vetro in un contenitore di rifiuti e incubare la piastra a 37 gradi celsius durante la notte, lato superficiale rivestito verso il basso.Il giorno dopo, rimuovere la piastra dall'incubatore. Aggiungere 5 millilitri di brodo di lisogenia appena preparato con gli antibiotici appropriati a un tubo di vetro sterile da 15 millilitri con un tappo traspirante in plastica per coltura pianificata da 1 litro e utilizzare una punta di pipetta per raccogliere singole colonie di E.Coli trasformate dalla piastra di agar. Aggiungere una colonia raccolta a ciascuno dei tubi da 15 millilitri preparati e cappucciare ogni tubo con il cappuccio di plastica traspirante di accompagnamento.Quindi, posizionare le piccole colture E.coli con il chiuso in un incubatore di scuotimento di 37 gradi Celsius per 12-24 ore. Il giorno dopo aggiungere 100 millilitri di 10x PBS a 900 millilitri di brodo formidabile in un pallone da 1 litro per piccola coltura con gli antibiotici appropriati. E posizionare i contenitori a 37 gradi Celsius e 140 rotazioni al minuto per circa 30 minuti.Quando il brodo formidabile è caldo, aggiungere l'intero volume di 5 millilitri di ogni coltura di inoculazione a un pallone da coltura da 1 litro per coltura. E posizionare i contenitori nell'incubatrice di scuotimento a 140 rotazioni al minuto per circa 3 ore. Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6, ridurre la temperatura dell'incubatore a 16 gradi Celsius.Una volta raffreddato l'incubatore, aggiungere 1 millilitro di un IPTG molare, 1 millilitro di 4 grammi per litro di riboflavina appena preparato e 1 millilitro di acido amminolevulinico appena preparato 150 grammi per litro ad ogni coltura. Per la produzione di diterpenoidi, aggiungere 25 millilitri di un piruvato di sodio molare ad ogni coltura per garantire una formazione precursore sufficiente. Quindi, incubare le colture a 16 gradi Celsius e 140 rotazioni al minuto per 72 ore, aggiungendo 25 millilitri di piruvato di sodio al giorno alle colture appropriate.Per la separazione e la purificazione dei metaboliti, fissare un imbuto separatore su un supporto ad anello in una cappa aspirante. E metti un contenitore di rifiuti sotto l'imbuto. Versare 500 millilitri di una soluzione 50/50 di acetato di etile ed esaani nell'imbuto separatore.E aggiungere 500 millilitri della cultura di co-espressione trasformata di E.coli di interesse nell'imbuto. Posizionare il tappo di vetro sull'imbuto e agitare l'imbuto da 5 a 10 volte per mescolare la coltura con il solvente di estrazione, aprendo frequentemente il rubinetto mentre l'imbuto è capovolto e puntarlo nella cappa dei fumi per degasare l'imbuto. Dopo un secondo giro di scuotimenti e degassamenti come appena dimostrato, posizionare l'imbuto in posizione verticale sul supporto dell'anello per circa un minuto.Quando lo strato superiore del solvente si è separato dallo strato di coltura acquosa, rimuovere il tappo e drenare lo strato di E.coli in un becher di scarto, mantenendo lo strato di solvente all'interno dell'imbuto. Quindi, ripetere l'estrazione con i restanti 500 millilitri della coltura utilizzando gli stessi 500 millilitri di solvente utilizzati per la prima estrazione, prima di drenare il solvente contenente i metaboliti estratti in un pallone pulito. Qui viene mostrato il nostro cromatogramma rappresentativo gascromatografia-spettrometria di massa dei tipici prodotti enzimatici estratti.I sottoprodotti minori comunemente osservati includono il cloramfenicolo e i derivati dell'indolo oxindole e indole pivalaldehyde. Dopo la purificazione del diterpenoide attraverso la cromatografia a colonna di silice, è possibile ottenere tre composti di dolabralexina, quantificati sulla base di una curva standard utilizzando lo sclareolo diterpenoide. La cromatografia silice è ideale per ottenere un'elevata purezza dei composti bersaglio.Poiché consente la semplice preparazione di olefine diterpene e derivati ossigenati e rimuove prontamente l'oxindolo contaminante maggiore, che viene trattenuto sulla matrice di silice. Inoltre, la co-espressione dei geni della via terpenoide può essere usata per produrre diterpenoidi in N.Benthamiana, con conseguente produzione di dolabradiene e 15, 16 epossidolabrene. I solventi utilizzati durante l'estrazione devono essere ottimizzati per le proprietà chimiche fisiche dei metaboliti di interesse e non devono essere miscelabili con acqua per mantenere due strati distinti.Seguendo questa procedura, i metaboliti purificati possono essere utilizzati per l'analisi a valle, comprese le analisi strutturali e gli acidi antibiotici. Questa tecnica ha permesso la scoperta di nuovi diterpenoidi, compresi quelli mostrati qui, permettendo a questi metaboliti di essere analizzati per la loro struttura chimica e nuove biattività. Prendere precauzioni quando si utilizzano solventi organici in un imbuto separatore.Assicurati sempre di smaltire i rifiuti biologici secondo i tuoi standard di sicurezza di laboratorio.

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