Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Vi takknemlig erkjenner Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for å gi pIRS og pGGxZmAN2 konstruksjoner. Finansiell oppbacking for denne arbeide av det NSF plante-biotiske vekselsvirkningene program (støtte # 1758976 å P.Z.), det DOE tidlig karrieren forskning program (støtte # DE-SC0019178 å P.Z.), det DOE skjøt Genova off fellesskapet vitenskap program (støtte # CSP2568 å P.Z.), det NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Dean ' s mentorer Award Fellowship (til K.M.M.) er takknemlig erkjent.

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Bredere undersøkelse og anvendelse av diterpenoid naturlige produkter nødvendiggjør enkle, rimelige protokoller for å syntetisere og rense tilstrekkelige mengder ønskede forbindelser. Den raske økningen i antall tilgjengelige diterpenoid-metabolske enzymer fra et bredt spekter av arter gir nå en ekspansiv inventar for enzymatisk produksjon av diterpenoids ved hjelp av mikrobielle og plante-baserte vertssystemer. I tillegg gjør den modulære arkitekturen til mange diterpenoid trasé bruk av enzymer fra samme eller forskjellige arter i plug & Play ' Kombinatorisk engineering tilnærminger til å generere en rekke naturlige og nye natur-lignende diterpenoid naturlig produkter2,14,26,35.
E. coli er en foretrukket mikrobiell vert for naturlig produkt biosyntesen på grunn av sin robusthet, enkel skalerbarhet, begrenset kjemisk kompleksitet for redusert biprodukt forurensning, og vell av tilgjengelige verktøy for DNA-montering og uttrykk Optimalisering. I vår erfaring, plattformen er beskrevet her er godt egnet for produksjon av produktet gir av opptil flere hundre mg diterpene olefins og alkoholer, som er egnet for mange nedstrøms applikasjoner, inkludert de som foreslås her. Selv om det ikke møter industriell skala, kan produksjonsplattformen som beskrives her, tjene som grunnlag for videre vei, vert og gjæring optimalisering som har blitt demonstrert for relaterte diterpenoids som taxadiene og sclareol33 ,34. Over-uttrykk for rate-begrensende MVA eller MEP veien gener har blitt etablert for å overvinne yield-Begrensende faktorer for diterpenoid biosyntesen, slik som utilstrekkelig forløper forsyning og forløper Flux i konkurrerende trasé13, 32,33,39. Selv vist seg vellykket i flere studier, dårlig uttrykk og katalysator aktivitet av terpenoid-metabolsk eukaryote P450s og andre membran-bundet enzymer i E. coli er en sannsynlig begrensende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Bruk av Codon-optimalisert sekvenser og protein modifikasjoner, slik som fjerning av endoplasmatiske retikulum signal peptid eller innføring av et plastidial signal peptid, har vist seg nyttig å øke løselig P450 uttrykk14,38 ,49,50,53. Slike modifikasjoner ble også brukt for mikrobiell co-uttrykk for mais CYP71Z1839 brukes som et eksempel vei i denne studien. Protokollene beskrevet er basert på bruk av plasmider bærer en eller to gener per konstruere, alle under samme induserbart promoter. Der større-skala gen kombinasjoner er ønskelig, er det tilrådelig å bruke ulike tilgjengelige multi-genet kassetter eller gen stabling systemer for å redusere redusert transformasjon effektivitet og kultur vekst på grunn av bruk av flere plasmider og antibiotika13 .
Med den bredere tilgjengeligheten av genetikk og Genomics ressurser, anlegg vertssystemer også blitt stadig mer egnet for fremstilling av naturlige produkter. Fordelene inkluderer evne til planter for å produsere de nødvendige naturlige forløpere drevet av fotosyntese, og dermed muliggjør produkt dannelse uten behov for å supplere forløper molekyler54,55. N. benthamiana er allerede mye brukt for in vivo funksjonell karakterisering og Kombinatorisk uttrykk for terpenoid og andre naturlige produkt veier14,35,36,40 . Bemerkelsesverdige fordelene ved å bruke N. benthamiana som et vertssystem inkluderer den endogene produksjonen av diterpenoid forløpere, bruk av innfødte gen sekvenser, forenklet uttrykk for eukaryote P450s, enkel Kombinatorisk gen transformasjon (som separate antibiotika er ikke nødvendig for forbigående co-transformasjon), og enkel ekstraksjon av mål produkter fra blad materiale. Der det er nødvendig, kan diterpenoid produksjon forsterkes gjennom co-uttrykk for viktige MEP Pathway gener å øke forløperen Supply36,41. Begrensninger for skalerbar diterpenoid produksjon i N. benthamiana er mer komplekse i forhold til flytende mikrobielle kulturer på grunn av behovet for å generere tilstrekkelig plante biomasse, mer arbeidsintensiv produkt rensing fra kjemisk kompleks plante vev, og mulige uønskede metabolization av mål produkter gjennom, for eksempel, oksidasjon, glykosylering eller defosforylering av endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Imidlertid kan denne fremgangsmåten skaleres opp til mg produkt mengder ved å øke antall planter som brukes for agroinfiltration56.
Produktet utvinning og rensing protokoller beskrevet her er kompatible med E. coli og N. Benthamiana, samt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle vertssystemer, og gir en kostnadseffektiv tilnærming som er lett å satt opp i både biologi og kjemi laboratorier og krever ikke dyrt renseutstyr. Metabolitten ekstraksjon ved hjelp av en separatory trakt er velegnet for effektiv ekstraksjon og fase separasjon før kromatografiske rensing. Trakt størrelser kan lett justeres for å muliggjøre større kultur volumer og redusere eksperimentell tid som trengs for å trekke ut fra store kulturer. Vi fant bruk av en Heksan/etanol acetate gradient å være ideell for utpakking diterpenoids av ulike polaritet som demonstrert her for gruppen av dolabralexins som utgjør både hydrokarboner og oksygenert forbindelser (Figur 3). Avhengig av egenskapene til mål produkter, kan andre løsemiddel blandinger være fordelaktig. Løsemidler må imidlertid ikke blandbar med vann for å sikre vellykket ekstraksjon og fase separasjon ved hjelp av separatory trakt teknikk. I tillegg må produkttap gjennom fordampning tas hensyn til ved bruk av denne tilnærmingen for å produsere flyktige organiske forbindelser (VOC), for eksempel lavere molekylvekt mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografiske separasjon av diterpenoids av ulike nivåer av oksygenering bruke en større skala (~ 2 L) silica kolonne har vært fordelaktig i vår erfaring, siden det gir forbedret produkt separasjon og minimerer behovet for gjentakende rensing trinn ved bruk av mindre Kol onne volumer. Kolonne volumer og matriser kan justeres etter behov for ønsket kultur volum og type naturlig produkt. Renheten av mål produkter som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen er egnet for mange nedstrøms programmer, for eksempel bioactivity analyser eller for bruk i enzym aktivitet analyser. Men hvor høyere renhet nivåer er nødvendig, for eksempel strukturelle analyser via NMR, produktrenhet kan effektivt forsterkes av ytterligere rensing bruker (semi)-preparativ HPLC.
Denne protokollen er beskrevet her er optimalisert for produksjon av diterpenoid naturlige produkter, men kan også lett tilpasses til beslektede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produkt klasser bare ved å generere ønsket enzymet moduler for Kombinatorisk Expression14,57. Endringer i prosedyrene for uttrekking og rensing av produkter må imidlertid tas i betraktning for forbindelser med høyere volatilitet, for eksempel mono-og sesqui-terpenoider, eller høyere polaritet og funksjonell modifikasjon som et eksempel på glykosylering av mange triterpenoids, phenylpropanoids og andre naturlige produkt klasser.
Selv om industrielle plattformer for produksjon av naturlige produkter er tilgjengelige, protokollene beskrevet her tilbyr en billig, passelig verktøy som lett kan settes opp i de fleste laboratorier. Som demonstrert av produksjon av mais dolabralexins her og andre steder39, produktet mengder og renhet som kan oppnås ved hjelp av denne tilnærmingen er vanligvis tilstrekkelig til å lette ulike nedstrøms analyse og bruk, inkludert, men ikke begrenset til, ulike bioactivity studier, analyse av interaksjoner mellom organismer, så vel som for bruk som enzym underlag eller som start materiale for semi-syntese tilnærminger.

Diterpenoids utgjør en kjemisk mangfoldig gruppe på mer enn 12 000 hovedsakelig polysykliske 20-karbon naturprodukter som spiller kritiske roller i mange organismer1. Sopp og planter produserer det største mangfoldet av diterpenoids, men bakterier har også vist å danne bioaktive diterpenoids (se anmeldelser2,3,4,5). Forankret i sitt store strukturelle mangfold, diterpenoids tjene en rekke biologiske funksjoner. Noen få diterpenoids, slik som gibberellin veksthormoner, har viktige funksjoner i utviklingsprosesser5. Men flertallet av diterpenoids tjene som meglere av kjemiske forsvar og interorganismal interaksjoner. Blant disse, diterpene harpiks syrer i pest og patogen forsvar av bartrær og arter-spesifikke blandinger av antimikrobielle diterpenoids i store mat avlinger som mais (Zea Mays) og ris (oryza sativa) har vært mest omfattende studerte6,7. Disse bioactivities gir en rik kjemisk oppbevaringssted for kommersielle applikasjoner, og velg diterpenoids brukes som viktige legemidler, tilsetningsstoffer, lim, og andre bioprodukt av hverdagen moderne liv8,9 ,10. For å fremme forskning på naturlige mangfoldet og biologiske funksjoner av diterpenoids og til slutt fremme bredere kommersielle applikasjoner, er verktøy for kostnadseffektiv utarbeidelse av rene forbindelser nødvendig. Stor skala isolasjon fra plantemateriale har blitt etablert for et par diterpenoid bioprodukt, slik som diterpene harpiks syrer som produseres som et biprodukt av cellulose-og papirindustrien8. Men akkumulering av diterpenoids i bare spesifikke vev og under tett regulering av miljømessige stimuli ofte begrenser isolering av tilstrekkelige produkt mengder fra den naturlige produsent2. I tillegg hemmer den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids sin produksjon gjennom kjemisk syntese, selv om slike tilnærminger har vært vellykket i flere tilfeller11,12. Med tilgjengeligheten av avanserte genomisk og biokjemiske teknologier, har enzymatisk produksjonsplattformer fått økende oppmerksomhet for å produsere en rekke diterpenoid forbindelser (se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).
Alle terpenoider, inkludert diterpenoids, er avledet fra to isomere isoprenoid forløpere, isopentenyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (IPP) og dimethylallyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (DMAPP)19 som i sin tur dannes gjennom MEVALONAT (mva) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) veien. Terpenoid biosyntesen provenyet gjennom MEP veien i bakterier og MVA-veien i sopp, mens plantene har en cytosolic MVA og en plastidial MEP veien, med sistnevnte er den primære ruten mot diterpenoid formasjon20. Kondens av IPP og DMAPP ved prenyl transferases gir den sentrale 20-karbon forløperen til alle diterpenoids, geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (GGPP)20. Nedstrøms av GGPP formasjon, to enzym familier, terpen synthases (TPSs) og cytokrom P450 monooxygenases (P450s) i stor grad kontroll dannelsen av det store kjemiske mangfoldet av terpenoid metabolisme21,22. Diterpene synthases (diTPSs) katalysere begått carbocation-drevet syklisering og omorganisering av GGPP å danne ulike stereospecific bi-, Poly-, eller makro-syklisk Diterpene stillaser1,3,23, 24. Oksygenering og videre funksjonell dekorasjon av disse stillaser er så tilrettelagt av P450 enzymer og velg andre enzym familier22,25. TPSs og P450s vanligvis eksisterer som arter-spesifikke, multi-genet familier som kan danne modulære biosyntetiske nettverk, der kombinere ulike enzym moduler langs en felles blåkopi gjør dannelsen av et bredt spekter av forbindelser2, 26. den raske oppdagelsen av funksjonelt distinkte enzymer som opererer i modulære terpenoid trasé de siste årene har gitt ekspanderende muligheter for deres bruk som en allsidig deler liste for metabolske engineering av delvis eller fullstendig trasé i både mikrobielle og plante-baserte produksjonsplattformer. For eksempel, gjær (Saccharomyces cerevisiae) har vært brukt med hell til ingeniør multi-enzym trasé for fremstilling av terpenoid bioprodukt, slik som antimalariamidler stoffet Artemisinin27, sesquiterpenoid biodrivstoff bisabolene og far nesene28, men også velge diterpenoids29,30,31. På samme måte er det etablert Escherichia coli -plattformer for industriell skala produksjon for et par diterpenoid metabolitter, inkludert Taxol-forløperen taxadiene brukt som anti-kreft-stoff og diterpene alkohol, sclareol , brukt i duftbransjen13,32,33,34. Fremskritt innen genteknologi og transformasjon teknologier har også gjort anlegget vertssystemer stadig mer levedyktig for produksjon av plante naturprodukter9,14,35,36. Spesielt den nære tobakk slektning, Nicotiana benthamiana, har blitt en mye brukt chassis for terpenoid veien analyse og engineering, på grunn av den enkle Agrobacterium-mediert transformasjon av flere gen kombinasjoner , effektiv biosyntesen av endogene forløpere, og høy biomasse14,35,36.
Tegning på disse etablerte plattformene for terpenoid biosyntesen, beskriver vi her lett-å-bruke og kostnadseffektive metoder for enzymatisk produksjon av diterpenoids og rensing av enkelt forbindelser. De presenterte protokollene illustrerer hvordan E. coli og N. benthamiana plattformer konstruert for forbedret diterpenoid forløper biosyntesen kan utnyttes for Kombinatorisk uttrykk for ulike diTPSs og P450 enzymer for å generere ønskede diterpenoid forbindelser. Anvendelse av denne protokollen til å produsere og rense strukturelt forskjellige diterpenoids vises ved eksempel på spesialiserte diterpenoids fra mais (Zea Mays), kalt dolabralexins, endogene biosyntesen som rekrutterer to diTPS og en P450 Enzym. Rensing av ulike dolabralexins fra olefins til oksygenrikt derivater oppnås deretter ved å kombinere separatory trakt ekstraksjon med stor skala silika kolonne kromatografi og preparativ høytrykks væske kromatografi (HPLC). De beskrevne protokollene er optimalisert for produksjon av diterpenoids, men kan også lett tilpasses for relaterte terpenoid klasser, så vel som andre naturlige produkter som enzym ressurser er tilgjengelige. Forbindelser som produseres ved hjelp av denne tilnærmingen er egnet for ulike nedstrøms applikasjoner, inkludert men ikke begrenset til, strukturelle karakterisering via kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) analyse, bruk som underlag for enzym funksjonelle studier, og en rekke bioactivity analyser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoids danner en mangfoldig klasse av små molekyl naturlige produkter som er vidt distribuert over livets riker og har kritiske biologiske funksjoner i utviklingsmessige prosesser, interorganismal interaksjoner, og miljømessige tilpasning. På grunn av disse ulike bioactivities er mange diterpenoids også av økonomisk betydning som farmasøytiske produkter, tilsetningsstoffer, biodrivstoff og andre bioprodukt. Avanserte Genomics og biokjemiske tilnærminger har aktivert en rask økning i kunnskap om diterpenoid-metabolske gener, enzymer og trasé. Imidlertid forblir den strukturelle kompleksiteten i diterpenoids og den smale taksonomisk fordelingen av individuelle forbindelser i ofte bare en enkelt Art Begrensende faktorer for effektiv produksjon. Tilgjengeligheten av et bredere spekter av metabolske enzymer gir nå ressurser for å produsere diterpenoids i tilstrekkelig titers og renhet for å lette en dypere undersøkelse av denne viktige metabolitten gruppen. Tegning på etablerte verktøy for mikrobiell og plante-baserte enzym co-Expression, presenterer vi en lett operert og passelig protokoll for enzymatisk produksjon av diterpenoids i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensing av ønskede produkter via silika kromatografi og semi-preparativ HPLC. Ved hjelp av gruppen av mais (Zea Mays) dolabralexin diterpenoids som et eksempel, understreker vi hvordan modulære kombinasjoner av diterpene syntase (diTPS) og cytokrom P450 monooxygenase (P450) enzymer kan brukes til å generere ulike diterpenoid stillaser. Renset forbindelser kan brukes i ulike nedstrøms applikasjoner, slik som metabolitten strukturelle analyser, enzym struktur-funksjon studier, og in vitro og i planta bioactivity eksperimenter.

Skjematisk arbeidsflyt for diterpenoid produksjon ved hjelp av E. coli Figur 1 illustrerer den beskrevne arbeidsflyten for diterpenoid produksjon. Protokollen skissert her er tilpasset fra en tidligere beskrevet E. coli plattform for diterpenoid biosyntesen13,32 for bruk av større volum kulturer og rensing av ønskede diterpenoid produkter via silika kromatografi. For å demonstrere bruken av denne protokollen, brukte vi en nylig identifisert dolabralexin sti fra mais som består av to diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) og ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multi-funksjonell P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), og en cytokrom P450 reduktase (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). I korte trekk var E. coli BL21DE3-C41 kompetente celler pre-transformert med pCDFDuet: IRS og pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmider13,32. Den pCDFDuet: IRS plasmider inneholder nøkkel enzymer for diterpenoid forløper produksjon, inkludert 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat syntase (dxs), 1-deoxy-D-xylulose-5-fosfat reduktase (DXR), og isopentenyl uridindifosfatglukuronosyltransferase isomerase (Idi), og ble vist å øke diterpenoid formasjon i E. coli13. Den pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmider inneholder mais ENT-copalyl uridindifosfatglukuronosyltransferase syntase ZmAN2 og en GGPP syntase fra abies grandis. Enzymer katalyserende de engasjerte reaksjonene i dolabralexin biosyntesen ble deretter co-transformert som plasmider pET28b: ZmKSL4 og pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. For detaljer om sekvenser og plasmider konstruksjoner se MAFU et al. 201839.
En GC-MS kromatogram av de utpakkede enzymet produktene er vist i figur 3a, illustrerer dannelsen av tre dolabralexin forbindelser, nemlig dolabradiene (1,2 ± 0,25 mg/l kultur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l kultur), og epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L-kulturen) som kvantifisert basert på en standard kurve ved hjelp av diterpenoid sclareol. Sclareol ble brukt som referanse standard, på grunn av dens liknende struktur og kjemiske egenskaper sammenlignet med dolabralexins. Vanligvis observert mindre biprodukter inkluderer kloramfenikol, den indol derivater oxindol og indol-5-aldehyd, og forløperen geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase (GGPP) (Figur 3). Indol representerer vanligvis den primære biprodukt, men er ikke vist her, på grunn av sin oppbevaring tid kortere enn den innstilte løsemiddel forsinkelse på 7 min for å bevare integriteten til GC-MS instrument.
Skjematisk arbeidsflyt av diterpenoid produksjon ved hjelp av N. benthamiana Figur 4 viser en oversikt over uttrykket for dolabralexin Tien i N. benthamiana. For produktene som beskrives her, ble følgende konstruksjoner forvandlet separat til A. tumefaciens stamme GV3101: pLife33: P19 (uttrykker P19-genet som demper-protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Full-lengde native sekvenser av mais dolabralexin Pathway gener ble brukt i den binære T-DNA vektor pLife3341 med kanamycin motstand for forplantning i E. coli og A. tumefaciens. Co-uttrykk for oppstrøms terpenoid Pathway gener er valgfritt, siden forløperen geranylgeranyl uridindifosfatglukuronosyltransferase er endogenously dannet i N. benthamiana. Imidlertid har flere studier med hell ansatt slike tilnærminger for å øke diterpenoid formasjon i N. benthamiana14,36,41. Som illustrert i Figur 3, co-uttrykk vellykket produsert dolabradiene og 15, 16-epoxydolabrene. I motsetning til enzym co-uttrykk i E. coli, 15, 16-epoxydolabranol ble ikke oppdaget i metabolitten ekstrakter.
Tilstedeværelsen av 15, 16-epoxydolabrene i blad ekstrakter demonstrerte aktiviteten til CYP71Z18 i N. benthamiana. Som 15, 16-epoxydolabranol ble vist å være stabil etter ekstraksjon fra mikrobielle kulturer (Figur 3) samt etter isolering fra mais rot vev i tidligere studier39, synes det sannsynlig at det hydroksylerte produktet er glykosylert av endogene glycosyltransferases og senere sequestered i vacuole, rendering den utilgjengelige for ekstraksjon med organiske løsemiddel blandinger brukes her for ekstraksjon36,43,44,45 ,46. Lignende uønskede produkt modifikasjoner i forbindelse med Pathway Engineering i N. benthamiana har vært rapportert i tidligere studier47. Som vist for co-uttrykk i E. coli, forbigående uttrykk i N. benthamiana resulterer i ekstraksjon av flere biprodukter, inkludert lineær alkaner av ulik kjedelengde som basert på sammenligning til referanse massen Spectra databaser. Sammensatte titers Hentet fra blad materiale ble funnet å være i gjennomsnitt 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene og 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g tørt blad vev. Disse titers kan ikke sammenlignes direkte til E. coli co-Expression system gitt de forskjellige eksperimentelle satt ups.
Diterpenoid rensing Diterpenoid rensing ble oppnådd ved hjelp av silika kolonne kromatografi og påfølgende semi-preparativ HPLC. Metabolitten ekstrakter fra 12 L av grupperte E. coli kulturer ble renset ved hjelp av silica kolonne kromatografi å skille de tre fokal dolabralexin forbindelser (figur 3a). Silica kromatografi er ideell for å oppnå høy renhet av målet forbindelser, siden det gir enkel separasjon av diterpene olefins og oksygenrikt derivater, og lett fjerner de store miljøgifter, oxindol, som er beholdt på silica matrise ( Figur 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figur 1: arbeidsflyt for diterpenoid produksjon i E. coli og metabolitten rensing fra flytende bakterielle kulturer. Stiplede bokser viser valgfrie trinn der ekstra rensing er nødvendig. (A) representative bilde av utpakkede E. coli kultur ved hjelp av en separatory trakt. (B) representative bilde av metabolitten ekstrakt rensing ved hjelp av silica kromatografi.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figur 2: Dolabralexin biosyntetiske vei og gen konstruksjoner brukt i denne studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figur 3: GC-MS-resultater. Vist er representative GC-MS kromatogrammene av renset diterpenoid produkter innhentet ved hjelp av enzym co-Expression analyser i (A) E. coli og (B) N. benthamiana. Produkt-IDer er basert på sammenligninger til autentiske standarder og referanse massen Spectra av National Institute of Standards and Technology (NIST) masse Spectral bibliotek. 1, oxindol; 2, indol-5-aldehyd; 3, Pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, heksahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromophenyl] alkyltiokarbamid]-a-d-glucoside S, S-karbondioksid; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, Pyrrolo [1, 2-a] pyrazine-1, 4-Dione, heksahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 og 12, ukjent; 10, kloramfenikol; 11, 3, 7, 11, 15-tetramethyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figur 4: Diterpenoid produksjon i N. benthamiana. (A) arbeidsflyt av diterpenoid produksjon i N. benthamiana og metabolitten rensing fra blad materiale. (B) representative bilde av N. benthamiana planter klar for infiltrasjon eksperimenter, før beskjæring. (C) representative bilder av N. benthamiana planter etter beskjæring. (D) bilde av sprøyte-infiltrere blader. Mørkere områder har blitt infiltrere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Her presenterer vi lett å bruke protokoller for å produsere og rense diterpenoid metabolitter gjennom Kombinatorisk uttrykk for biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, etterfulgt av kromatografiske produkt Rensing. De resulterende metabolitter er egnet for ulike studier inkludert molekylær struktur karakterisering, enzym funksjonelle studier, og bioactivity analyser.

En tilpasningsvennlig tilnærming for enzymatisk produksjon og rensing av Diterpenoid naturlige produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Denne protokollen er egnet for å produsere rensede diterpenoider som kan brukes til ulike nedstrøms analyse og kan tilpasses for en rekke forskjellige metabolittmål. Den største fordelen med denne metoden er det en enkel og billig metode for å produsere mg mengder spesialiserte metabolitter. Ved å utveksle gener og enzymer som brukes til co-uttrykk, kan denne metoden endres for å produsere andre terpenoider, inkludert monoterpenoider og sesquiterpenoider, samt andre metabolittklasser som flavonoider.For diterpenoid metabolsk produksjon og transformasjon, begynn med å varme kjemisk kompetente E.coli-celler på is. Når kulturen har tint, legg til 25 mikroliter kompetente celler per konstruksjon til et kjølt 1,5 milliliter mikrorør og legg til 1 mikroliter av en 100 nanogram per mikroliterløsning av hver konstruksjon som brukes til kouttrykk. Inkuber blandingene på is i 30 minutter med skånsom blanding hvert 10.På slutten av inkubasjonen, varmesjokk celleblandingene på 42 grader celsius i ett minutt før du plasserer cellene tilbake på is i minst to minutter. Deretter legger du til 200 mikroliter på 37 grader celsius SOC medium til rørene. Og inkuber kulturene i en time ved 37 grader celsius og 200 rotasjoner per minutt.På slutten av inkubasjonen, tilsett ca 10 autoklaverte glassperler og 100 mikroliter celler til en 37 grader celsius oppvarmet lysogeny kjøttkraft agar plate med passende antibiotika. Og rist platen horisontalt med lokket på plass for å fordele cellene jevnt. Deretter trykker du forsiktig glassperlene i en avfallsbeholder og inkuberer platen ved 37 grader celsius over natten, belagt overflate ned.Neste dag, fjern platen fra inkubatoren. Tilsett 5 milliliter nylaget lysogeny buljongmed et passende antibiotika til en 15 milliliter sterilt glassrør med en plast pustende cap per planlagt 1 liter kultur, og bruk en pipet tips for å plukke individuelle forvandlet E.Coli kolonier fra agar plate. Tilsett en plukket koloni til hver av de tilberedte 15 milliliter rørene og hette hvert rør med den medfølgende pustende plasthetten.Deretter plasserer du de avgrensede E.coli små kulturene i en 37 grader celsius risting inkubator i 12 til 24 timer. Neste dag legger du til 100 milliliter 10x PBS til 900 milliliter fantastisk kjøttkraft i en 1 liter kolbe per liten kultur med passende antibiotika. Og legg kolbene på 37 grader celsius og 140 rotasjoner per minutt i ca 30 minutter.Når den fantastiske kjøttkraft er varm, legg hele 5 milliliter volum av hver inokulasjonskultur til en 1 liter kulturkolbe per kultur. Og legg kolbene i risting inkubatoren ved 140 rotasjoner per minutt i ca 3 timer. Når den optiske tettheten på 600 nanometer når 0,6, reduser temperaturen på inkubatoren til 16 grader celsius.Når inkubatoren er avkjølt, tilsett 1 milliliter av en molar IPTG, 1 milliliter nylaget 4 gram per liter riboflavin og 1 milliliter nylaget 150 gram per liter aminolevulinsyre til hver kultur. For diterpenoid produksjon, tilsett 25 milliliter av en molar natriumpyuvat til hver kultur for å sikre en tilstrekkelig forløperdannelse. Deretter inkubere kulturene ved 16 grader celsius og 140 rotasjoner per minutt i 72 timer, og legger til 25 milliliter natriumpyuvat daglig til de aktuelle kulturene.For metabolittseparasjon og rensing, fest en separattor trakt på et ringstativ i en røykhette. Og legg en avfallsbeholder under trakten. Hell 500 milliliter av en 50/50 løsning av etylacetat og hexanes i separatory trakten.Og legg til 500 milliliter av den forvandlede E.coli-co-uttrykkskulturen av interesse i trakten. Plasser glassproppen på trakten og rist trakten 5 til 10 ganger for å blande kulturen med ekstraksjonsløsemidlet, og åpne ofte spigoten mens trakten er opp ned og pek den inn i røykhetten for å degas trakten. Etter en andre runde med risting og avgassing som nettopp demonstrert, plasser trakten oppreist i ringstativet i omtrent ett minutt.Når det øverste løsemiddellaget har skilt seg fra vandig kulturlag, fjern proppen og tøm E.coli-laget i et avfallsbeger, og beholder løsningsmiddellaget i trakten. Gjenta deretter ekstraksjonen med de resterende 500 milliliter av kulturen ved hjelp av de samme 500 milliliter med løsemiddel som brukes til første ekstraksjon, før du drenerer oppløsningsvæsken som inneholder de ekstraherte metabolittene i en ren kolbe. Her vises vårt representative gasskromatografi-massespektrometrikromatramme av typiske ekstraherte enzymprodukter.Vanligvis observert mindre biprodukter inkluderer kloramfenikol og indol derivater oksydol og indol pivalaldehyd. Etter diterpenoid rensing via silika kolonne kromatografi, tre dolabralexin forbindelser kan oppnås, som kvantifisert basert på en standard kurve ved hjelp av diterpenoid sclareol. Silikakromatografi er ideell for å oppnå en høy renhet av målforbindelsene.Siden det muliggjør enkel fremstilling av diterpene olefiner og oksygenerte derivater og fjerner lett den store forurensende oksdolen, som beholdes på silikamatrisen. Videre kan co-uttrykket av terpenoid pathway gener brukes til å produsere diterpenoider i N.Benthamiana, noe som resulterer i produksjon av dolabradiene og 15, 16 epoxydolabrene. Løsemidlene som brukes under ekstraksjonen bør optimaliseres for de fysiske kjemiske egenskapene til metabolittene av interesse og må ikke blandes med vann for å opprettholde to forskjellige lag.Etter denne prosedyren kan rensede metabolitter brukes til nedstrøms analyse, inkludert strukturell analyse og antibiotikasyrer. Denne teknikken gjorde det mulig å oppdagelsen av nye diterpenoider, inkludert de som vises her, slik at disse metabolittene kunne analyseres for deres kjemiske struktur og nye biaktiviteter. Ta forholdsregler når du bruker organiske løsemidler i en separatoritrakt.Sørg alltid for å kaste biologisk avfall i henhold til laboratoriesikkerhetsstandardene dine.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produksjon og rensing

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid Ett-trinns Enzymatisk Syntese og All-vandig Rensing av Trehalose analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Utarbeidelse av Giant vesikler innkapsle mikrosfære ved sentrifugering av en vann-i-olje emulsjon

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilnærming for rensing av enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode for effektiv Refolding og rensing av Chemoreceptor Ligand bindende domene

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...