Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Мы с благодарностью признательны д-ру Рубену Петерсу (Университет штата Айова, США) за предоставление конструкций pIRS и pGGx-mAN2. Финансовая поддержка этой работы по NSF Завод-Биотические Взаимодействия Программа (грант 1758976 до П.З.), DOE Ранняя карьера научно-исследовательской программы (грант DE-SC0019178 до П.З.), DOE Объединенный институт генома Сообщества Научная программа (грант CSP2568 в П.З.), NSF Выпускник научно-исследовательской программы стипендий (к KMM), и UC Дэвис Дин Наставничество премии стипендий (к KMM) с благодарностью признали.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Более широкое исследование и применение дитерпеноидных натуральных продуктов требует простых, недорогих протоколов для синтеза и очистки достаточного количества желаемых соединений. Быстрое увеличение числа доступных дитерпеноидно-метаболических ферментов из широкого круга видов в настоящее время обеспечивает обширный инвентарь для ферментативного производства дитерпеноидов с использованием микробных и растительных систем хоста. Кроме того, модульная архитектура многих дитерпеноидных путей позволяет использовать ферменты одного и того же или разных видов в комбинаторных инженерных подходах «подключаться и играть» для создания массива природных и новых природных дитерпеноидов продукты2,14,26,35.
E. coli является предпочтительным микробным хостом для биосинтеза природного продукта из-за его надежности, легкости масштабируемости, ограниченной химической сложности для уменьшения загрязнения побочными продуктами, а также богатства доступных инструментов для сборки и экспрессии ДНК Оптимизации. По нашему опыту, платформа, описанная здесь, хорошо подходит для производства продукции, соотносящейся до нескольких сотен мг дитерпеновых олефинов и спиртов, которая подходит для многих приложений ниже по течению, включая те, которые предлагаются здесь. Хотя это и не соответствует промышленному масштабу, описанная здесь производственная платформа может служить основой для дальнейшей оптимизации пути, хозяина и ферментации, как это было успешно продемонстрировано для связанных дитерпеноидов, таких как таксадиен и склареол33 ,34. Чрезмерное выражение ограничения скорости MVA или MEP пути генов была успешно создана для преодоления факторов, ограничивающих урожайность для дитерпеноидов биосинтеза, таких как недостаточное предложение прекурсоров и прекурсор потока в конкурирующих путей13, 32,33,39. Хотя доказано успешное в нескольких исследованиях, плохое выражение и каталитической активности терпеноидов-метаболических эукариотических P450s и других мембранных ферментов в кишечной палочке является вероятным ограничивающим фактором33,39 ,48,49,50,51,52. Использование кодон-оптимизированных последовательностей и белковых модификаций, таких как удаление эндоплазмического пептида сигнала ретикулума или введение пептида пластидного сигнала, оказалось полезным для увеличения растворимого выражения P45014,38 ,49,50,53. Такие модификации были также использованы для микробного совместного выражения кукурузы CYP71'1839, используемой в качестве примера в данном исследовании. Описанные протоколы основаны на использовании плазмидов, несущих один или два гена на конструкцию, все под одним и тем же индуцируемым промоутером. В тех случаях, когда пожеланы более масштабные комбинации генов, желательно использовать различные доступные многогенные кассеты или системы укладки генов для смягчения снижения эффективности трансформации и роста культуры за счет использования нескольких плазмидов и антибиотиков13 .
С более широким наличием генетики и геномики ресурсов, завод принимающих систем также становятся все более пригодными для производства натуральных продуктов. Преимущества включают в себя способность растений производить необходимые природные прекурсоры питание от фотосинтеза, тем самым позволяя образование продукта без необходимости дополнять молекулы-предшественники54,55. Н. бентамиана уже широко используется для функциональной характеристики in vivo и комбинаторного выражения терпеноидов и других естественных продуктовых путей14,35,36,40 . Заметные преимущества использования N. benthamiana в качестве принимающей системы включают эндогенное производство дитерпеноидных прекурсоров, использование родовых генных последовательностей, упрощенное выражение эукариотических P450s, легкость комбинированной трансформации генов (как отдельные антибиотики не требуются для переходного со-трансформации, а также простого извлечения целевых продуктов из листового материала. Там, где это необходимо, производство дитерпеноидов может быть увеличено за счет совместного выражения ключевых генов MEP пути увеличить предложение прекурсоров36,41. Ограничения для масштабируемого производства дитерпеноидов в N. benthamiana являются более сложными по сравнению с жидкими микробными культурами из-за необходимости создания достаточной биомассы растений, более трудоемкой очистки продукта от химически сложных растительная ткань, и возможная нежелательная метаболизация целевых продуктов через, например, окисление, гликозилирование или дефосфорилирование эндогенными ферментами36,43,44,45 ,46,47. Тем не менее, эта процедура может быть масштабирована до мг количества продукции за счет увеличения числа растений, используемых для агроинфильтрации56.
Описанные здесь протоколы добычи и очистки продукции совместимы с E. coli и N. benthamiana,а также S. cerevisiae и другими системами растительного или микробного хозяина, и обеспечивают экономичный подход, который легко созданв как в биологических, так и в химических лабораториях и не требует дорогостоящего очистного оборудования. Извлечение метаболита с использованием сепараторной воронки хорошо подходит для эффективной добычи и фазового разделения до хроматографической очистки. Размеры воронки могут быть легко скорректированы, чтобы обеспечить большие объемы культуры и сократить экспериментальное время, необходимое для извлечения из крупных культур. Мы обнаружили, что использование градиента гексан/этилового ацетата идеально подходит для извлечения дитерпеноидов различной полярности, как показано здесь для группы долабралексинов, которые включают в себя как углеводородные, так и насыщенные кислородом соединения (Рисунок 3). В зависимости от свойств целевых продуктов, другие растворительные смеси могут быть выгодными. Тем не менее, растворители не должны быть неправильно с водой для обеспечения успешной добычи и фазового разделения с использованием техники сепараторной воронки. Кроме того, при использовании этого подхода для производства летучих органических соединений (ЛОС), таких как моно- и сески-терпеноиды и другие ЛОС, необходимо принимать во внимание потерю продукта путем испарения. Хроматографическое разделение дитерпеноидов различных уровней оксигенации с использованием более крупномасштабной кремнеземной колонки было выгодным в нашем опыте, так как оно обеспечивает улучшенное разделение продукта и сводит к минимуму необходимость итеративной очистки при использовании меньших объемов столбцов. Объемы и матрицы столбцов могут быть скорректированы по мере необходимости для желаемого объема культуры и типа натурального продукта. Чистота целевых продуктов, которые могут быть достигнуты с помощью этого протокола подходит для многих приложений ниже по течению, таких как анализы биоактивности или для использования в анализе активности ферментов. Однако там, где требуется более высокий уровень чистоты, например, структурный анализ через ЯМР, чистота продукта может быть эффективно усилена за счет дополнительной очистки с использованием (полу)-подготовки HPLC.
Этот протокол, описанный здесь, был оптимизирован для производства дитерпеноидных натуральных продуктов, но также может быть легко настроен на соответствующие моно-, сески- и три-терпеноиды, а также другие классы натуральных продуктов, просто генерируя желаемый фермент модули для комбинаторного выражения14,57. Однако изменения процедур извлечения и очистки продукции должны приниматься во внимание для соединений с повышенной волатильностью, таких как моно- и сески-терпеноиды, или более высокая полярность и функциональная модификация, о чем свидетельствует гликозилирование многих тритерпеноидов, фенилпропаноидов и других натуральных классов продукции.
Хотя промышленные платформы для производства натуральных продуктов доступны, описанные здесь протоколы предлагают недорогой, настраиваемый инструмент, который можно легко настроить в большинстве лабораторий. Как показано на производство кукурузы dolabralexins здесь и в других местах39, количество продукции и чистоты, которые могут быть достигнуты с помощью этого подхода, как правило, достаточно для облегчения различных ниже по течению анализа и использования, в том числе, но не ограничивается различными исследованиями биоактивности, анализом взаимодействий между организмами, а также для использования в качестве ферментных субстратов или в качестве исходного материала для подходов к полусинтезу.

Дитерпеноиды составляют химически разнообразную группу из более чем 12 000 преимущественно полициклических 20-углеродных натуральных продуктов, которые играют важную роль во многих организмах1. Грибы и растения производят наибольшее разнообразие дитерпеноидов, но бактерии также были показаны для формирования биологически активных дитерпенов (см. отзывы2,3,4,5). Укорененные в их обширном структурном разнообразии, дитерпеноиды служат множеством биологических функций. Несколько дитерпеноидов, таких как гормоны роста гиббереллина, имеют важные функции в процессах развития5. Однако большинство дитерпеноидов служат посредниками химической защиты и межорганизмовых взаимодействий. Среди них, дитерпен овых риз кислот в вредителей и патогенных защиты хвойных деревьев и видов конкретных смесей антимикробных дитерпенов в основных продовольственных культур, таких каккукуруза (Зея май)и риса (Oryza sativa) были наиболее широко изучали 6,7. Эти биодеятельности обеспечивают богатый химический хранилище для коммерческого применения, и выбрать дитерпеноиды используются в качестве важных фармацевтических препаратов, пищевых добавок, клеев и других биопродуктов повседневной современной жизни8,9 ,10. Для продвижения исследований по естественному разнообразию и биологическим функциям дитерпеноидов и, в конечном счете, содействия более широкому коммерческому применению необходимы инструменты для экономичной подготовки чистых соединений. Крупномасштабная изоляция от растительного материала была установлена для нескольких дитерпеноидных биопродуктов, таких как дитерпеновые кислоты, которые производятся в качестве побочного продукта целлюлозно-бумажной промышленности8. Однако накопление дитерпеноидов только в конкретных тканях и при жестком регулировании экологическими стимулами часто ограничивает изоляцию достаточных объемов продукции от натурального производителя2. Кроме того, структурная сложность дитерпеноидов затрудняет их производство через химический синтез, хотя такие подходы были успешными в нескольких случаях11,12. С наличием передовых геномных и биохимических технологий, ферментативные производственные платформы получили все большее внимание для производства целого ряда дитерпеноидных соединений (см. обзоры13,14, 15,16,17,18).
Все терпеноиды, в том числе дитерпеноиды, являются производными от двух изомерических изопреноидов прекурсоров, изопентенилодий дифосфата (IPP) и диметилаллилдилова дифосфата (DMAPP)19, которые, в свою очередь, образуются через мевалонат (MVA) или метилеритрититол-5-фосфат (MEP) путь. Терпеноидный биосинтез протекает через путь MEP в бактериях и пути MVA в грибах, тогда как заводы обладают цитозолиальной MVA и пластичным пути MEP, при последнем основной путь к образованию дитерпеноидов20. Конденсация IPP и DMAPP пренил-трансферазы дает центральный 20-углеродный предшественник для всех дитерпеноидов, геральгенанил дифосфата (GGPP)20. Вниз по течению формирования GGPP, два фермента семейства, терпене синтаза (TPSs) и цитохром P450 монооксигеназы (P450s) в значительной степени контролировать формирование огромного химического разнообразия терпеноидного метаболизма21,22. Diterpene синтаза (diTPSs) катализировать совершенные карбокации инициативе циклизации и перестановки GGPP для формирования различных стереоспецифических би-, поли-, или макро-циклические дьептена леса1,3,23, 24. Оксигенации и дальнейшего функционального украшения этих лесов затем облегчается P450 ферментов и выбрать другие ферменты семейства22,25. TPSs и P450s обычно существуют как видовые, многогенные семейства, которые могут образовывать модульные биосинтетические сети, где объединение различных ферментных модулей по общему плану позволяет формировать широкий спектр соединений2, 26. Быстрое открытие функционально различных ферментов, работающих в модульных терпеноидных путей в последние годы предоставило расширяющиеся возможности для их использования в качестве универсального списка частей для метаболического проектирования частичных или полных путей в как микробных, так и растительных производственных платформ. Например, дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) был успешно применен для разработки мультиферментных путей для производства терпеноидных биопродуктов, таких как противомалярийный препарат артемизинин27, сесквиторпеноид биотоплива бисаболен и фарнезен28, но и выбрать дитерпеноиды29,30,31. Аналогичным образом, инженерии Escherichia coli платформ для промышленного масштаба производства были созданы для нескольких метаболитов дитерпеноидов, в том числе таксатор таксадин Таксола используется в качестве противоракового препарата и дитерпена алкоголя, скореола , используется в парфюмерной промышленности13,32,33,34. Достижения в области генной инженерии и технологий трансформациитакже сделали системы растительных хост все более жизнеспособными для производства растительных натуральных продуктов9,14,35,36. В частности, близкий табачный родственник, Nicotiana benthamiana, стал широко используемым шасси для терпеноидного анализа пути и проектирования, благодаря простоте Agrobacterium-опосредованнойтрансформации нескольких комбинаций генов , эффективный биосинтез эндогенных прекурсоров, и высокая биомасса14,35,36.
Опираясь на эти установленные платформы для терпеноидного биосинтеза, мы описываем здесь простые в использовании и экономичные методы ферментативного производства дитерпеноидов и очистки отдельных соединений. Представленные протоколы иллюстрируют, как платформы E. coli и N. benthamiana, разработанные для усовершенствованного биосинтеза дитерпеноидов-прекурсоров, могут быть использованы для комбинированного выражения различных диПС и ферментов P450 для генерации желаемых дитерпеноидных соединений. Применение этого протокола для производства и очистки структурно различных дитерпеноидов показано на примере специализированных дитерпеноидов изкукурузы (Зея майс),называют долабралексины, эндогенный биосинтез которых набирает два diTPS и один P450 Фермента. Очистка различных долабралексинов, начиная от олефинов до оксигенированных производных, достигается путем объединения сепараторной воронки с крупномасштабной хроматографией кремнезема и препаративной жидкой хроматографией высокого давления (HPLC). Описанные протоколы оптимизированы для производства дитерпеноидов, но также могут быть легко адаптированы для связанных классов терпеноидов, а также других натуральных продуктов, для которых доступны ферментные ресурсы. Соединения, производимые с использованием этого подхода, подходят для различных приложений, включая, но не ограничиваясь, структурную характеристику с помощью анализа ядерного магнитного резонанса (ЯМР), использовать в качестве субстратов для функциональных исследований ферментов, а также ряд анализы биоактивности.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Дитерпеноиды образуют разнообразный класс малых молекул природных продуктов, которые широко распространены по всему царству жизни и имеют критические биологические функции в процессах развития, межорганизмовых взаимодействий и адаптации к окружающей среде. Из-за этих различных биоактивности, многие дитерпеноиды также имеют экономическое значение, как фармацевтические препараты, пищевые добавки, биотопливо и другие биопродукты. Усовершенствованные геномики и биохимические подходы позволили быстро расширить знания о дитерпеноидно-метаболических генах, ферментах и путях. Однако структурная сложность дитерпеноидов и узкое таксономическое распределение отдельных соединений зачастую только одного вида остаются сдерживающими факторами для их эффективного производства. Наличие более широкого спектра метаболических ферментов в настоящее время обеспечивают ресурсы для производства дитерпеноидов в достаточном количестве титеров и чистоты, чтобы облегчить более глубокое исследование этой важной группы метаболитов. Опираясь на установленные инструменты для микробного и растительного коэнзима совместного выражения, мы представляем легко управляемый и настраиваемый протокол для ферментативного производства дитерпенов в либо Escherichia coli или Nicotiana benthamiana, и очистка желаемых продуктов с помощью кремнезема хроматографии и полу-подготовки HPLC. Используя группу кукурузы(Зея май )dolabralexin дитерпенов в качестве примера, мы подчеркиваем, как модульные комбинации дитерпена синтаза (diTPS) и цитохром P450 монооксигеназы (P450) ферменты могут быть использованы для создания различных дитерпеноидных лесах. Очищенные соединения могут быть использованы в различных применениях вниз по течению, таких как метаболит структурный анализ, фермент структуры-функции исследований, а также в пробирке и в экспериментах по биоактивности стоек.

Схематический рабочий процесс для производства дитерпеноидов с использованием кишечной палочки Рисунок 1 иллюстрирует описанный рабочий процесс для производства дитерпеноидов. Протокол, изложенный здесь, был адаптирован из ранее описанной платформы E. coli для дитерпеноидного биосинтеза13,32 для использования культур большого объема и очистки желаемых дитерпеноидных продуктов через кремнезем Хроматографии. Чтобы продемонстрировать использование этого протокола, мы использовали недавно выявленный путь долабралексина из кукурузы, который состоит из двух диТпС, Зман2 (m00001d029648) и «mKSL4» (m00001d032858), многофункциональный P450 (CYP71'18, sm00001d01413444) и цитохром P450 редуктаза (mCPR2, mm00001d026483)(рисунок 2). Короче говоря, E. coli BL21DE3-C41 компетентные клетки были предварительно преобразованы с pCDFDuet:IRS и pACYC-Дуэт: GGPPS / ЗмАН2 плазмиды13,32. PCDFDuet:IRS plasmid содержит ключевые ферменты для производства дитерпеноидов-прекурсоров, в том числе 1-дезоксидно- D-ксилулоза-5-фосфат синтазы(dxs), 1-дезокси -D-xylulose-5-фосфат редуктазы (dxr), и изопентенил дифосфат изомеразы(иди),и было показано, что увеличение дитерпеноидобразования образования в e. coli13. PACYC-Дуэт:GGPPS / плазмид змАН2 содержит кукурузы ent-copalyl дифосфат синтаза ЗмАН2 и синетхазы GGPP от Abies grandis. Ферменты, катализирующих совершенные реакции в биосинтезе долабралексина, затем были преобразованы в плазмиды pET28b: «MKSL4» и pETDUET: «mCPR2/mCYP71»18. Для получения подробной информации о последовательности и плазмидных конструкций см. Mafu et al. 201839.
Хроматограмма гК-МС из извлеченных ферментных продуктов показана на рисунке 3A,иллюстрирующем образование трех соединений долабралексина, а именно долабрадина (1,2 х 0,25 мг/л культуры), эпоксидолабрена (0,65 х 0,2 мг/л культуры) и эпоксидолабранола (11,4) Культура 1,1 мг/л, как количественно на основе стандартной кривой с использованием дитерпеноидного склареола. Sclareol был использован в качестве эталона, из-за его сходной структуры и химических свойств по сравнению с dolabralexins. Обычно наблюдаемые незначительные побочные продукты включают хлорамфеникол, индол производные oxindole и индол-5-альдегид, и предшественник geranylgeranyl дифосфат (GGPP) (Рисунок 3). Indole обычно представляет собой первичный побочный продукт, но не отображается здесь, из-за его удержания времени короче, чем набор растворителя задержки 7 мин, чтобы сохранить целостность инструмента GC-MS.
Схематический рабочий процесс производства дитерпеноидов с использованием N. benthamiana На рисунке 4 изображен обзор выражения пути долабралексина в Н. Бентамиане. Для продуктов, описанных здесь, следующие конструкции были преобразованы отдельно в Штамм A. tumefaciens GV3101: pLife33:p19 (выражение белка супрессора гена p19 гена), pLife33: tmCYP71'18, pLife33: ЗмЯН2, pLife33: Полнометражные родные последовательности генов пути дольабролексина кукурузы использовались в двоичном векторе T-DNA pLife3341 с резистентностью канамицина для распространения в e. coli и A. tumefaciens. Совместное выражение вверх по течению терпеноидных генов не является обязательным, так как предшественник геранилгеранил дифосфат агеновидно формируется в N. benthamiana. Тем не менее, несколько исследований успешно использовали такие подходы для увеличения образования дитерпеноидов в N. benthamiana14,36,41. Как показано на рисунке 3, совместное выражение успешно производится долабрадин и 15,16-эпоксидолабрена. В отличие от ферментной коэкспрессии в кишечной палочке,15,16-эпоксидолабаннол не был обнаружен в экстрактах метаболита.
Наличие 15,16-эпоксидолабена в экстрактах листьев продемонстрировало активность CYP71-18 в Н. Бентамиане. Как 15,16-эпоксидолапронол было показано, что стабильный после извлечения из микробных культур(рисунок 3), а также после изоляции от корневых тканей кукурузы в предыдущих исследованиях39, кажется правдоподобным, что гидроксилированный продукт гликозилированных эндогенными гликозилтрансферазами и впоследствии секвестрированными в вакуолеле, делая его недоступным для извлечения с органическими растворительными смесями, используемыми здесь для извлечения36,43,44,45 ,46. Аналогичные нежелательные изменения продукта в контексте пути инженерных в N. benthamiana были зарегистрированы в предыдущих исследованиях47. Как показано для совместного выражения в E. coli, переходное выражение в N. benthamiana приводит к извлечению нескольких побочных продуктов, в том числе линейных алканов различной длины цепи, основанной на сравнении с базами данных с базовыми массами. Соединение титры, извлеченные из листового материала было установлено, что в среднем 2,4 й/- 0,5 мг долабратина и 0,9 й/- 0,3 мг 15,16-эпоксидолабен на г сухой ткани листьев. Эти титры не могут быть сопоставлены непосредственно с системой совместного выражения кишечной палочки, учитывая различные экспериментальные настройки.
Дитерпеноидная очистка Дитерпеноидная очистка была достигнута с помощью кварцевой колонки хроматографии и последующего полу-подготовки HPLC. Метаболит экстракты из 12 L объединенных культур кишечной палочки были очищены с помощью кремнезема колонки хроматографии, чтобы отделить три координационных соединений долабралексина(рисунок 3A). Силика хроматография идеально подходит для достижения высокой чистоты целевых соединений, так как она позволяет простое разделение дитерпена олефинов и оксигенированных производных, и легко удаляет основные загрязняющие веществ, оксиндол, который сохраняется на матрице кремнезема ( Рисунок 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс для производства дитерпеноидов в кишечной палочке и очистки метаболита из жидких бактериальных культур. Dashed коробки изображают дополнительные шаги, где требуется дополнительная очистка. (A) Представитель изображение извлеченных E. coli культуры с помощью сепараторной воронки. (B) Репрезентативное изображение очистки экстракта метаболита с использованием кремнезема хроматографии.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Долабралексин биосинтетических путей и генов конструкций, используемых в этом исследовании. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Результаты GC-MS. Показаны репрезентативные хроматограммы GC-MS очищенных дитерпеноидных продуктов, полученных с помощью ферментных коэкспрессионных анализов в(A) E. coli и (B) N. benthamiana. Идентификация продукции основана на сопоставлении с подлинными стандартами и эталонными масс-спектрами масс-спектральной библиотеки Национального института стандартов и технологий (NIST). 1, оксиндоле; 2, индол-5-альдегид; 3, Пирроло1,2-а-пиразин-1,4-дион, гексагидро-3-(2-метилпропил)-; 4, 6-O-Acetyl-1-4-бромофэнил-тио-а-д-глюкозид S,S-диоксид; 5, долабрадиен; 6, 15,16-эпоксидолабрена; 7, Пирроло1,2-а-пиразин-1,4-дион, гексагидро-3-(фенилметил)-; 8, 15,16-эпоксидолабранол; 9 и 12, неизвестно; 10, хлорамфеникол; 11, 3,7,11,15-тетраметил-2-гексадекен-1-ол; 13-16, алканы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Рисунок 4: Дитерпеноидноидное производство в Н. Бентамиане. (A) Рабочий процесс производства дитерпеноидов в N. benthamiana и метаболитной очистки из листового материала. . (B) Представитель изображение N. benthamiana растений, готовых к инфильтрации экспериментов, до обрезки. (C) Репрезентативные изображения растений Н. Бентамианы после обреза. (D) Изображение шприцев-проникших листьев. Темные районы были проникли. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Здесь мы представляем простой в использовании протоколы для производства и очистки метаболитов дитерпеноидов через комбинаторную экспрессию биосинтетических ферментов в Escherichia coli или Nicotiana benthamiana, за которым следует хроматографический продукт Очистки. Полученные метаболиты подходят для различных исследований, включая молекулярную структуру характеристики, ферментфункциональные исследования и анализы биоактивности.

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Этот протокол подходит для производства очищенных дитерпеноидов, которые могут быть использованы для различных анализов вниз по течению и могут быть настроены для целого ряда различных целей метаболита. Основным преимуществом этого метода является простой и недорогой способ получения миллиграммов специализированных метаболитов. Путем обмена генами и ферментами, используемыми для совместного выражения, этот метод может быть изменен для производства других терпеноидов, в том числе монотерпеноидов и сесквитерпеноидов, а также других классов метаболита, таких как флавоноиды.Для дитерпеноидов метаболического производства и трансформации, начните с потепления химически компетентных клеток E.coli на льду. Когда культура разморозится, добавьте 25 микролитров компетентных клеток на конструкцию в охлажденный микротрубок 1,5 миллилитров и добавьте 1 микролитр по 100 нанограмм на раствор микролитра каждой конструкции, используемой для совместного выражения. Инкубировать смеси на льду в течение 30 минут с нежным смешивания каждые 10 минут, соскоб труб через стойку микротрубки.В конце инкубации тепло шокирует клеточные смеси при температуре 42 градуса по Цельсию в течение одной минуты, прежде чем поместить клетки обратно на лед еще как минимум на две минуты. Затем добавьте к трубам 200 микролитров 37 градусов по Цельсию. И инкубировать культуры в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 200 вращений в минуту.В конце инкубации добавьте около 10 автоматических стеклянных бусин и 100 микролитров клеток к одному 37 градусам Цельсия, разогретому лизогенным бульоном агарной пластины с соответствующими антибиотиками. И встряхните пластину горизонтально с крышкой на месте, чтобы равномерно распределить клетки. Затем аккуратно коснитесь стеклянных бусин в мусорный контейнер и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию на ночь, покрытием поверхности вниз.На следующий день снимите тарелку с инкубатора. Добавьте 5 миллилитров свежеприготовленного лизогенного бульона среды с соответствующими антибиотиками в одну 15-миллилитровую стерильную стеклянную трубку с пластиковой дышащий крышкой на запланированный 1 литр культуры, и используйте наконечник трубы, чтобы выбрать отдельные преобразованные колонии E.Coli из агарной пластины. Добавьте одну выбранную колонию к каждой из подготовленных 15 миллилитровых трубок и крышка каждая трубка с сопровождающей дышащий пластиковый колпачок.Затем поместите ограниченные E.coli малых культур в 37 градусов по Цельсию встряхивания инкубатор в течение 12 до 24 часов. На следующий день добавить 100 миллилитров 10x PBS до 900 миллилитров потрясающего бульона в 1 литровую колбу на небольшую культуру с соответствующими антибиотиками. И поместите колбы на 37 градусов по Цельсию и 140 оборотов в минуту в течение примерно 30 минут.Когда потрясающий бульон теплый, добавьте весь 5 миллилитров объема каждой культуры прививки к одной 1 литровой культуре колбы на культуру. И поместите колбы в трясусь инкубатор на 140 оборотов в минуту в течение примерно 3 часов. Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигнет 0,6, снизить температуру инкубатора до 16 градусов по Цельсию.После того, как инкубатор остынет, добавьте 1 миллилитр одного молярного IPTG, 1 миллилитр свежеприготовленных 4 граммов на литр рибофлавина и 1 миллилитр свежеприготовленной 150 граммов на литр аминолевулиновой кислоты к каждой культуре. Для производства дитерпеноидов добавьте 25 миллилитров одного молярного пирувата натрия в каждую культуру, чтобы обеспечить достаточное образование прекурсоров. Затем инкубировать культуры при 16 градусах по Цельсию и 140 вращений в минуту в течение 72 часов, добавляя 25 миллилитров пирувата натрия ежедневно в соответствующие культуры.Для разделения и очистки метаболита закрепните сепараторную воронку на кольцевой пододинке в дымовом капоте. И поместите контейнер для отходов под воронку. Налейте 500 миллилитров 50/50 раствора этилового ацетата и гексан в сепаральную воронку.И добавить 500 миллилитров преобразованной культуры совместного выражения E.coli интереса в воронку. Поместите стеклянную пробку на воронку и встряхните воронку от 5 до 10 раз, чтобы смешать культуру с растворителем экстракции, часто открывая кран, в то время как воронка перевернута и навейте его в капот дыма, чтобы дегазать воронку. После второго раунда встряхивания и дегазаации, как только что продемонстрировано, поместите воронку вертикально в кольцо стоять около одной минуты.Когда верхний слой растворителя отделился от аквеозного слоя культуры, удалите пробку и слейте слой E.coli в стакан отходов, сохраняя слой растворителя в воронке. Затем повторите экстракции с оставшимися 500 миллилитров культуры, используя те же 500 миллилитров растворителя, используемых для первой экстракции, прежде чем слить растворитель, содержащий извлеченные метаболиты в чистую колбу. Здесь показана наша репрезентативная газохроматография-масс-спектрометрия хроматограммы типичных извлеченных ферментных продуктов.Обычно наблюдается незначительные побочные продукты включают хлорамфеникол и производные индола оксиндола и индола pivalaldehyde. После дитерпеноидной очистки с помощью кремнезема колонки хроматографии, три долабралексина соединений могут быть получены, как количественно на основе стандартной кривой с использованием дитерпеноидного sclareol. Крематография кремнезема идеально подходит для достижения высокой чистоты целевых соединений.Так как он позволяет простой препарат дитерпен олефинов и оксигенированных производных и легко удаляет основные загрязняют оксиндол, который сохраняется на кремнезема матрицы. Кроме того, совместное выражение генов терпеноидного пути может быть использовано для производства дитерпеноидов в N.Benthamiana, в результате чего производство долабрадиена и 15, 16 эпоксидолабрена. Растворители, используемые во время экстракции, должны быть оптимизированы для физических химических свойств метаболитов, представляющих интерес, и не должны смешиваться с водой для поддержания двух различных слоев.После этой процедуры, очищенные метаболиты могут быть использованы для анализа вниз по течению, в том числе структурного анализа и антибиотиков кислот. Этот метод позволил открытие новых дитерпеноидов, в том числе показанных здесь, что позволяет анализировать эти метаболиты для их химической структуры и новых биактивий. Примите меры предосторожности при использовании органических растворителей в сепараторной воронке.Всегда будьте уверены, чтобы избавиться от биологических отходов в соответствии с вашими стандартами безопасности лаборатории.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Быстрое Одношаговый ферментативный синтез и All-водный Очистка трегалозных Аналогов

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...