Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
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Agradecemos al Dr. Reuben Peters (Universidad Estatal de Iowa, EE. UU.) por proporcionar las construcciones pIRS y pGGxZmAN2. Apoyo financiero para este trabajo por el Programa de Interacciones Planta-Bióticas de la NSF (subvención 1758976 a P.Z.), el Programa de Investigación de Carrera Temprana del DOE (subvención DE-SC0019178 a P.Z.), el Programa conjunto de ciencias comunitarias del Instituto del Genoma de la DOE (subvención CSP2568 a P.Z.), el NSF El Programa de Becas de Investigación de Posgrado (a K.M.M.), y una Beca de Premio Mentoría de UC Davis Dean (a K.M.M.) son reconocidos con gratitud.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una investigación y aplicación más amplia de los productos naturales diterpenoides requiere protocolos simples y económicos para sintetizar y purificar cantidades suficientes de compuestos deseados. El rápido aumento en el número de enzimas diterpenoides-metabólicas disponibles de una amplia gama de especies ahora proporciona un inventario expansivo para la producción enzimática de diterpenoides utilizando sistemas de huésped microbianos y vegetales. Además, la arquitectura modular de muchas vías dterpenoides permite el uso de enzimas de la misma o diferentes especies en enfoques de ingeniería combinativa 'plug & play' para generar una variedad de naturales y nuevos diterpenoides naturales productos2,14,26,35.
E. coli es un huésped microbiano preferido para la biosíntesis de productos naturales debido a su robustez, facilidad de escalabilidad, complejidad química limitada para la contaminación por subproductos reducidos y la riqueza de herramientas disponibles para el montaje y la expresión de ADN Optimización. En nuestra experiencia, la plataforma descrita aquí es adecuada para producir rendimientos de productos de hasta varios cientos de mg de olefinas y alcoholes diterpenos, lo que es adecuado para muchas aplicaciones posteriores, incluidas las propuestas aquí. Aunque no cumple con la escala industrial, la plataforma de producción descrita aquí puede servir como base para la optimización de la vía, el huésped y la fermentación, como se ha demostrado con éxito para los ditepenoides relacionados como taxadiono y sclareol33 ,34. Se ha establecido con éxito la sobreexpresión de genes de vía MVA o MEP que limitan la tasa para superar los factores que limitan el rendimiento de la biosíntesis diterpenoides, como el suministro insuficiente de precursores y el flujo de precursores en las vías competidoras13, 32,33,39. Aunque se ha demostrado que tiene éxito en varios estudios, la mala expresión y la actividad catalítica de los P450 eucariotas terpenoides-metabólicos y otras enzimas unidas a la membrana en E. coli es un factor limitante probable33,39 ,48,49,50,51,52. El uso de secuencias optimizadas para codón y modificaciones proteicas, como la eliminación del péptido de señal retírica endoplasmática o la introducción de un péptido de señal plastidial, han demostrado ser útiles para aumentar la expresión P450 soluble14,38 ,49,50,53. Estas modificaciones también se emplearon para la coexpresión microbiana del maíz CYP71Z1839 utilizado como vía de ejemplo en este estudio. Los protocolos descritos se basan en el uso de plásmidos que transportan uno o dos genes por construcción, todos bajo el mismo promotor inducible. Cuando se desean combinaciones de genes a mayor escala, es aconsejable utilizar varios casetes multigenes disponibles o sistemas de apilamiento de genes para reducir la eficiencia de transformación y el crecimiento del cultivo debido al uso de plásmidos múltiples y antibióticos13 .
Con la mayor disponibilidad de recursos genéticos y genómicos, los sistemas de acogida de plantas también se vuelven cada vez más adecuados para la fabricación de productos naturales. Las ventajas incluyen la capacidad de las plantas para producir los precursores naturales requeridos alimentados por la fotosíntesis, permitiendo así la formación de productos sin la necesidad de complementar las moléculas precursoras54,55. N. benthamiana ya es ampliamente utilizado para la caracterización funcional in vivo y la expresión combinatoria de terpenoides y otras vías de producto natural14,35,36,40 . Las ventajas notables de utilizar N. benthamiana como sistema anfitrión incluyen la producción endógena de precursores diterpenoides, el uso de secuencias genéticas nativas, la expresión simplificada de P450 eucariotas, la facilidad de transformación genética combinatoria (como no se requieren antibióticos separados para la cotransformación transitoria) y la extracción simple de productos diana del material de la hoja. Cuando sea necesario, la producción de diterpenoides puede mejorarse mediante la coexpresión de genes clave de la vía del MEP para aumentar la oferta de precursores36,41. Las restricciones para la producción de diterpenoides escalables en N. benthamiana son más complejas en comparación con los cultivos microbianos líquidos debido a la necesidad de generar suficiente biomasa vegetal, una purificación de productos más intensiva en mano de obra a partir de productos químicamente complejos tejido vegetal, y posible metabolización no deseada de los productos diana a través, por ejemplo, de la oxidación, glicosilación o desfosforilación por enzimas endógenas36,43,44,45 ,46,47. Sin embargo, este procedimiento se puede escalar hasta cantidades de productos mg aumentando el número de plantas utilizadas para la agroinfiltración56.
Los protocolos de extracción y purificación de productos descritos aquí son compatibles con E. coli y N. benthamiana,así como con S. cerevisiae y otros sistemas de acogida de plantas o microbianos, y proporcionan un enfoque rentable que es fácil de en laboratorios de biología y química y no requiere costosos equipos de purificación. La extracción de metabolitos mediante un embudo separador es adecuada para la extracción eficiente y la separación de fases antes de la purificación cromatográfica. Los tamaños de embudo se pueden ajustar fácilmente para permitir volúmenes de cultivo más grandes y reducir el tiempo experimental necesario para extraer de grandes cultivos. Encontramos que el uso de un gradiente de acetato de hexano/etil es ideal para extraer diterpenoides de diferente polaridad como se ha demostrado aquí para el grupo de dolabralexinas que comprenden tanto hidrocarburos como compuestos oxigenados (Figura 3). Dependiendo de las propiedades de los productos objetivo, otras mezclas de disolventes pueden ser ventajosas. Sin embargo, los disolventes no deben ser miscibles con agua para garantizar una extracción y separación de fase sin éxito utilizando la técnica de embudo separador. Además, debe tenerse en cuenta la pérdida de producto a través de la evaporación al utilizar este enfoque para producir compuestos orgánicos volátiles (COV), como los mono- y sesqui-terpenoides de menor peso molecular y otros COV. La separación cromatográfica de los ditadrenalinoides de los diferentes niveles de oxigenación utilizando una columna de sílice a mayor escala (2 L) ha sido ventajosa en nuestra experiencia, ya que proporciona una mejor separación del producto y minimiza la necesidad de purificación iterativa pasos al utilizar volúmenes de columna más pequeños. Los volúmenes de columnas y matrices se pueden ajustar según sea necesario para el volumen de cultivo deseado y el tipo de producto natural. La pureza de los productos de destino que se pueden lograr utilizando este protocolo es adecuada para muchas aplicaciones posteriores, como ensayos de bioactividad o para su uso en análisis de actividad enzimática. Sin embargo, cuando se requieren niveles de pureza más altos, como análisis estructurales a través de RMN, la pureza del producto puede mejorarse eficientemente mediante una purificación adicional utilizando HPLC (semi)-preparativo.
Este protocolo descrito aquí ha sido optimizado para la producción de productos naturales diterpenoides, pero también se puede personalizar fácilmente a mono-, sesqui- y tri-terpenoides relacionados, así como otras clases de productos naturales simplemente generando la enzima deseada módulos para la expresión combinatoria14,57. Sin embargo, las modificaciones de los procedimientos de extracción y purificación de productos deben tenerse en cuenta para los compuestos con mayor volatilidad, como los mono- y los sesqui-terpenoides, o una mayor polaridad y modificación funcional como lo ejemplifican glicosilación de muchos triterpenoides, fenilpropanoides, y otras clases de productos naturales.
Aunque las plataformas a escala industrial para la fabricación de productos naturales están disponibles, los protocolos descritos aquí ofrecen una herramienta económica y personalizable que se puede configurar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Como lo demuestra la producción de dolabralexinas de maíz aquí y en otros lugares39, las cantidades de productos y la pureza que se pueden lograr utilizando este enfoque son típicamente suficientes para facilitar diversos análisis y usos posteriores, incluyendo, pero no varios estudios de bioactividad, análisis de interacciones entre organismos, así como para su uso como sustratos enzimáticos o como material de partida para enfoques de semisíntesis.

Los diterpenoides comprenden un grupo químicamente diverso de más de 12.000 productos naturales predominantemente policíclicos de 20 carbonos que desempeñan un papel crítico en muchos organismos1. Los hongos y las plantas producen la mayor diversidad de ditrenoides, pero también se ha demostrado que las bacterias forman diterpenoides bioactivos (ver comentarios2,3,4,5). Arraigados en su vasta diversidad estructural, los ditrinoides cumplen una multitud de funciones biológicas. Algunos diterpenoides, como las hormonas de crecimiento gibberellin, tienen funciones esenciales en los procesos de desarrollo5. Sin embargo, la mayoría de los ditrenoides sirven como mediadores de defensa química e interacciones interorganismos. Entre ellos, los ácidos de resina de diterpeno en la defensa de plagas y patógenos de árboles de coníferas y mezclas específicas de especies de diterpenoides antimicrobianos en los principales cultivos alimentarios como el maíz (Zea mays) y el arroz (Oryza sativa) han sido más extensamente estudiado6,7. Estas bioactividades proporcionan un rico repositorio químico para aplicaciones comerciales, y algunos diterpenoides se utilizan como productos farmacéuticos importantes, aditivos alimentarios, adhesivos y otros bioproductos de la vida moderna cotidiana8,9 ,10. Para avanzar en la investigación sobre la diversidad natural y las funciones biológicas de los ditirinoides y, en última instancia, promover aplicaciones comerciales más amplias, se requieren herramientas para la preparación rentable de compuestos puros. Se ha establecido un aislamiento a gran escala del material vegetal para algunos bioproductos diterpenoides, como los ácidos de resina diterpeno que se producen como subproducto de la industria de la pulpa y el papel8. Sin embargo, la acumulación de ditrenoides sólo en tejidos específicos y bajo estricta regulación por estímulos ambientales a menudo limita el aislamiento de cantidades suficientes de productos del productor natural2. Además, la complejidad estructural de los ditrenoides dificulta su producción a través de la síntesis química, aunque tales enfoques han tenido éxito en varios casos11,12. Con la disponibilidad de tecnologías genómicas y bioquímicas avanzadas, las plataformas de producción enzimáticas han ganado cada vez más atención por producir una gama de compuestos diterpenoides (ver comentarios13,14, 15,16,17,18).
Todos los terpenoides, incluidos los dterpenoides, se derivan de dos precursores isoprenoides isoprenoides isoprenoides, difosfato de isopentenil (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) 19 que, a su vez, se forman a través del mevalonato (MVA) o el difosfato de dimetilalloilo (DMAPP) 19 que, a su vez, se forman a través del mevalonato (MVA) o el difosfato de dimetilallol (DMAPP) 19 que, a su vez, se forman a través del mevalonato (MVA) o el difosfato de dimetilalilo (DMAPP) 19 que, a su vez, se forman a través del mevalonato (MVA) o el difosfato de dimetilalilo (DMAPP)19 que, a su vez, se forman a través del mevalona metileritol-5-fosfato (MEP) vía. La biosíntesis terpenoides procede a través de la vía MEP en bacterias y la vía MVA en hongos, mientras que las plantas poseen un MVA citosólico y una vía mePA plastidial, siendo esta última la vía primaria hacia la formación de diterpenoides20. La condensación de IPP y DMAPP por transferencias de prenilo produce el precursor central de 20 carbonos a todos los ditrenoides, difosfato de geranilgeranil (GGPP)20. Aguas abajo de la formación de GGPP, dos familias de enzimas, tensiasas terpenos (TPS) y monooxigenasas del citocromo P450 (P450s) controlan en gran medida la formación de la vasta diversidad química del metabolismo terpenoides21,22. Las diterpenos sintasas (diTPS) catalizan la ciclación y reorganización comprometidas impulsadas por la carbocación de GGPP para formar varios andamios de diterpeno bicíclicos, policíclicos o macrocíclicos estereoespecíficos1,3,23, 24. La oxigenación y la decoración funcional de estos andamios es facilitada por las enzimas P450 y seleccionar otras familias de enzimas22,25. Los TPS y los P450 suelen existir como familias multigenéticas específicas de especies que pueden formar redes biosintéticas modulares, donde la combinación de diferentes módulos enzimáticos a lo largo de un plano común permite la formación de una amplia gama de compuestos2, 26. El rápido descubrimiento de enzimas funcionalmente distintas que operan en vías terpenoides modulares en los últimos años ha proporcionado oportunidades crecientes para su uso como una lista de piezas versátiles para la ingeniería metabólica de vías parciales o completas en plataformas de producción microbianas y vegetales. Por ejemplo, la levadura (Saccharomyces cerevisiae) se ha aplicado con éxito para diseñar vías multienzimas para la fabricación de bioproductos terpenoides, como el fármaco antipalúdico artemisinina27, los biocombustibles sesquiterpenoides bisaboleno y farnesene28,pero también seleccionar diterpenoides29,30,31. Del mismo modo, se han establecido plataformas Escherichia coli diseñadas para la fabricación a escala industrial para algunos metabolitos diterpenoides, incluyendo el taxaénide precursor Taxol utilizado como droga contra el cáncer y el alcohol diterpeno, sclareol , utilizado en la industria de fragancias13,32,33,34. Los avances en la ingeniería genética y las tecnologías detransformación también han hecho que los sistemas de acogida de plantas sean cada vez más viables para la producción de productos naturales de plantas9,14,35,36. En particular, el pariente cercano del tabaco, Nicotiana benthamiana, se ha convertido en un chasis ampliamente utilizado para el análisis de la vía terpenoides y la ingeniería, debido a la facilidad de agrobacterium-mediada transformación de múltiples combinaciones de genes , biosíntesis eficiente de precursores endógenos, y alta biomasa14,35,36.
Basándonos en estas plataformas establecidas para la biosíntesis terpenoides, aquí describimos métodos fáciles de usar y rentables para la producción enzimática de ditpenoides y la purificación de compuestos únicos. Los protocolos presentados ilustran cómo las plataformas E. coli y N. benthamiana diseñadas para la biosíntesis de precursores diterpenoides mejoradas se pueden utilizar para la expresión combinatoria de diferentes diTPS y enzimas P450 para generar compuestos diterpenoides deseados. La aplicación de este protocolo para producir y purificar ditrinoides estructuralmente diferentes se muestra con el ejemplo de ditrenoides especializados de maíz (Zea mays), dolabralexinas, biosíntesis endógena de los cuales recluta dos diTPS y un P450 Enzima. La purificación de diferentes dolabralexinas que van desde olefinas hasta derivados oxigenados se logra combinando la extracción de embudo separadora con cromatografía de columna de sílice a gran escala y cromatografía líquida de alta presión preparativa (HPLC). Los protocolos descritos están optimizados para la producción de ditrenoides, pero también se pueden adaptar fácilmente para las clases de terpenoides relacionados, así como otros productos naturales para los que hay recursos enzimáticos disponibles. Los compuestos producidos con este enfoque son adecuados para diversas aplicaciones posteriores, incluyendo pero no limitado a, caracterización estructural a través de análisis de resonancia magnética nuclear (RMN), uso como sustratos para estudios funcionales enzimáticos, y una gama de ensayos de bioactividad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Los ditrinoides forman una clase diversa de productos naturales de moléculas pequeñas que se distribuyen ampliamente por los reinos de la vida y tienen funciones biológicas críticas en procesos de desarrollo, interacciones interorganismos y adaptación ambiental. Debido a estas diversas bioactividades, muchos ditpioides también son de importancia económica como productos farmacéuticos, aditivos alimentarios, biocombustibles y otros bioproductos. La genómica avanzada y los enfoques bioquímicos han permitido un rápido aumento en el conocimiento de genes diterpenoides-metabólicos, enzimas y vías. Sin embargo, la complejidad estructural de los ditrenoides y la distribución taxonómica estrecha de compuestos individuales en a menudo sólo una sola especie siguen siendo factores restrictivos para su producción eficiente. La disponibilidad de una gama más amplia de enzimas metabólicas ahora proporciona recursos para producir diterpenoides en suficientes tetas y pureza para facilitar una investigación más profunda de este importante grupo metabolito. Basándonos en herramientas establecidas para la coexpresión enzimática microbiana y vegetal, presentamos un protocolo fácilde de operar y personalizable para la producción enzimática de diterpenoides en Escherichia coli o Nicotiana benthamiana,y la purificación de los productos deseados a través de cromatografía de sílice y HPLC semipreparativo. Utilizando el grupo de maíz (Zea mays) diterpenoides dolabralexina como ejemplo, destacamos cómo las combinaciones modulares de diterpenosinas (diTPS) y citocromo P450 monooxigenasa (P450) enzimas se pueden utilizar para generar diferentes andamios diterpenoides. Los compuestos purificados se pueden utilizar en diversas aplicaciones posteriores, como análisis estructurales de metabolitos, estudios de la estructura enzimática-función, y experimentos in vitro y en bioactividad de planta.

Flujo de trabajo esquemático para la producción de diterpenoides utilizando E. coli La figura 1 ilustra el flujo de trabajo descrito para la producción de diterpenoides. El protocolo descrito aquí ha sido adaptado de una plataforma e. coli previamente descrita para la biosíntesis diterpenoides13,32 para el uso de cultivos de mayor volumen y la purificación de los productos diterpenoides deseados a través de sílice Cromatografía. Para demostrar el uso de este protocolo, utilizamos una vía de dolabralexina recientemente identificada a partir de maíz que comprende dos diTPS, ZmAN2 (Zm00001d029648) y ZmKSL4 (Zm00001d032858), un P450 multifuncional (CYP71Z18, Zm00001d014134), un cyto P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), un cyto P450 multifuncional), un cyto P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134), un cromato P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) y un cromato P4500) reductasa (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Figura 2). En resumen, las células competentes de E. coli BL21DE3-C41 se transformaron previamente con los plásmidos pCDFDuet:IRS y pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN213,32. El plásmido pCDFDuet:IRS contiene enzimas clave para la producción de precursores diterpenoides, incluyendo 1-deoxy-D-xillosa-5-fosfato sintasa (dxs), 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductasa (dxr), y isopentenyl difosfato isomerasa (idi), y se demostró que aumenta la formación de diterpenoides en E. coli13. El plásmido pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 contiene el maíz ent-colyl difosfato sintasa ZmAN2 y una ggPP sintasa de Abies grandis. Las enzimas que catalizaban las reacciones cometidas en la biosíntesis de dolabralexina se transformaron entonces como plásmidos pET28b:ZmKSL4 y pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Para obtener más información sobre las secuencias y las construcciones de plásmidos, véase Mafu et al. 201839.
En la Figura 3Ase muestra un cromatograma GC-MS de los productos enzimáticos extraídos, que ilustra la formación de tres compuestos de dolabralexina, a saber, dolabradieno (1,2 x 0,25 mg/L de cultivo), epoxidolhana (0,65 x 0,2 mg/L de cultivo) y epoxydolabranol (11,4 • 1,1 mg/L de cultivo) cuantificados sobre la base de una curva estándar utilizando el sclareol diterpenoide. Sclareol se utilizó como un estándar de referencia, debido a su estructura similar y propiedades químicas en comparación con dolabralexinas. Los subproductos menores observados típicamente incluyen cloranfenicol, los derivados indole oxindole e indole-5-aldehído, y el precursor de difosfato de geranilgeranil (GGPP)(Figura 3). Indole representa comúnmente el subproducto primario, pero no se muestra aquí, debido a su tiempo de retención más corto que el retardo de disolvente establecido de 7 min para preservar la integridad del instrumento GC-MS.
Flujo de trabajo esquemático de la producción ditepenoide utilizando N. benthamiana La Figura 4 representa una visión general de la expresión de la vía de dolabralexina en N. benthamiana. Para los productos descritos aquí, las siguientes construcciones se transformaron por separado en cepa A. tumefaciens GV3101: pLife33:p19 (expresando la proteína supresora de silenciamiento del gen p19), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. Se utilizaron secuencias nativas de longitud completa de los genes de la vía de dolabralexina de maíz en el vector binario T-DNA pLife3341 con resistencia a la kanamicina para su propagación en E. coli y A. tumefaciens. La co-expresión de genes de vía terpenoides aguas arriba es opcional, ya que el precursor difosfato de geranylgeranyl se forma endógenamente en N. benthamiana. Sin embargo, varios estudios han empleado con éxito tales enfoques para aumentar la formación de diterpenoides en N. benthamiana14,36,41. Como se ilustra en la Figura 3,la coexpresión produjo con éxito dolabradieno y 15,16-epoxydolabrene. A diferencia de la coexpresión enzimática en E. coli,15,16-epoxydolabranol no se detectó en extractos de metabolitos.
Presencia de 15,16-epoxydolabrene en extractos de hojas demostró la actividad de CYP71Z18 en N. benthamiana. Como 15,16-epoxydolabranol se demostró que era estable después de la extracción de cultivos microbianos (Figura 3), así como después del aislamiento de los tejidos radiculares de maíz en estudios anteriores39, parece plausible que el producto hidroxilado es glucosilado por glicoseltransferasas endógenas y posteriormente secuestrado en la vacuola, haciéndola inaccesible a la extracción con las mezclas de disolvente orgánico utilizadas aquí para la extracción36,43,44,45 ,46. Modificaciones similares del producto no deseado en el contexto de la ingeniería de caminos en N. benthamiana se han divulgado en estudios anteriores47. Como se muestra para la coexpresión en E. coli, la expresión transitoria en N. benthamiana da como resultado la extracción de varios subproductos, incluyendo alcanos lineales de diferente longitud de cadena como se basa en la comparación con las bases de datos de espectros de masa de referencia. Se encontró que los valoradores compuestos extraídos del material de la hoja eran en promedio 2,4 +/- 0,5 mg de dolabradieno y 0,9 +/- 0,3 mg 15,16-epoxydolabren por g tejido de hoja seca. Estos lanzadores no se pueden comparar directamente con el sistema de coexpresión de E. coli dadas las diferentes configuraciones experimentales.
Purificación ditidinoides La purificación de diterpenoides se logró utilizando cromatografía de columna de sílice y posterior HPLC semipreparativo. Los extractos de metabolito de 12 L de cultivos agrupados de E. coli se purificaron utilizando cromatografía de columna de sílice para separar los tres compuestos focales de dolabralexina(Figura 3A). La cromatografía de sílice es ideal para lograr una alta pureza de los compuestos objetivo, ya que permite una separación sencilla de las olefinas diterpenos y los derivados oxigenados, y elimina fácilmente el contaminante principal, el oxidante, que se retiene en la matriz de sílice ( Figura 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para la producción de diterpenoides en E. coli y purificación de metabolitos de cultivos bacterianos líquidos. Las cajas discontinuas representan pasos opcionales en los que se requiere purificación adicional. (A) Imagen representativa del cultivo extraído de E. coli utilizando un embudo separador. (B) Imagen representativa de la purificación del extracto de metabolito mediante cromatografía de sílice.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figura 2: La vía biosintética de Dolabralexina y las construcciones genéticas utilizadas en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figura 3: Resultados de GC-MS. Se muestran cromatogramas GC-MS representativos de productos diterpenoides purificados obtenidos mediante ensayos de coexpresión enzimática en (A) E. coli y (B) N. benthamiana. Las identificaciones de productos se basan en comparaciones con estándares auténticos y espectros de masa de referencia de la biblioteca espectral de masas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST). 1, oxidante; 2, indole-5-aldehyde; 3, Pyrrolo[1,2-a]pirazina-1,4-dione, hexahydro-3-(2-methylpropyl)-; 4, 6-O-acetil-1-[[4-bromofenil]thio]-a-d-glucósido S,S-dióxido; 5, dolabradieno; 6, 15,16-epoxydolabrene; 7, Pyrrolo[1,2-a]pirazina-1,4-dione, hexahydro-3-(phenylmethyl)-; 8, 15,16-epoxydolabranol; 9 y 12, desconocido; 10, cloramphenicol; 11, 3,7,11,15-tetrametil-2-hexadecen-1-ol; 13-16, alcanes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figura 4: Producción de diterpenoides en N. benthamiana. (A) Flujo de trabajo de la producción de diterpenoides en N. benthamiana y purificación de metabolitos a partir del material de la hoja. (B) Imagen representativa de las plantas de N. benthamiana listas para experimentos de infiltración, antes de la poda. (C) Imágenes representativas de las plantas de N. benthamiana después de la poda. (D) Imagen de las hojas infiltradas en jeringas. Las áreas más oscuras han sido infiltradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Aquí presentamos protocolos fáciles de usar para producir y purificar metabolitos diterpenoides a través de la expresión combinatoria de enzimas biosintéticas en Escherichia coli o Nicotiana benthamiana,seguido según el producto cromatográfico Purificación. Los metabolitos resultantes son adecuados para diversos estudios, incluyendo caracterización de la estructura molecular, estudios funcionales enzimáticos y ensayos de bioactividad.

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Este protocolo es adecuado para la producción de diterpenoides purificados que se pueden utilizar para diferentes análisis aguas abajo y se pueden personalizar para una gama de diferentes objetivos de metabolitos. La principal ventaja de este método es que es un método simple y barato para producir cantidades de miligramos de metabolitos especializados. Mediante el intercambio de los genes y enzimas utilizados para la coexpresión, este método se puede modificar para producir otros terpenoides, incluyendo monoterpenoides y sesquiterpenoides, así como otras clases de metabolitos como flavonoides.Para la producción metabólica diterpenoides y la transformación, comience por calentar las células de E. coli químicamente competentes sobre hielo. Cuando el cultivo se haya descongelado, añada 25 microlitros de células competentes por construcción a un microtubo refrigerado de 1,5 mililitros y añada 1 microlitro de 100 nanogramos por solución de microlitro de cada construcción utilizada para la coexpresión. Incubar las mezclas sobre hielo durante 30 minutos con una mezcla suave cada 10 minutos raspando los tubos a través de un portatubos.Al final de la incubación, el calor impacta las mezclas celulares a 42 grados centígrados durante un minuto antes de volver a colocar las células sobre hielo durante al menos dos minutos más. A continuación, agregue 200 microlitros de 37 grados centígrados de SOC medio a los tubos. E incubar las culturas durante una hora a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto.Al final de la incubación, agregue aproximadamente 10 cuentas de vidrio autoclaves y 100 microlitros de células a una placa de agar de caldo de égeni calentada de 37 grados centígrados con los antibióticos apropiados. Y agitar la placa horizontalmente con la tapa en su lugar para distribuir uniformemente las células. Luego, toque suavemente las cuentas de vidrio en un contenedor de residuos e incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche, recubiertas de lado de la superficie hacia abajo.Al día siguiente, retire la placa de la incubadora. Agregue 5 mililitros de medio de caldo de égenido recién preparado con los antibióticos apropiados a un tubo de vidrio estéril de 15 mililitros con una tapa transpirable de plástico por cultivo planificado de 1 litro, y utilice una punta de pipeteo para recoger colonias individuales transformadas de E. Coli de la placa de agar. Agregue una colonia escogida a cada uno de los tubos de 15 mililitros preparados y tape cada tubo con la tapa de plástico transpirable que lo acompaña.Luego, coloque los pequeños cultivos de E. coli en una incubadora de temblores de 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas. Al día siguiente añadir 100 mililitros de 10x PBS a 900 mililitros de caldo excelente en un matraz de 1 litro por pequeño cultivo con los antibióticos adecuados. Y coloque los matraces a 37 grados centígrados y 140 rotaciones por minuto durante aproximadamente 30 minutos.Cuando el caldo es excelente, agregue todo el volumen de 5 mililitros de cada cultivo de inoculación a un matraz de cultivo de 1 litro por cultivo. Y coloque los matraces en la incubadora de agitación a 140 rotaciones por minuto durante aproximadamente 3 horas. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,6, reduzca la temperatura de la incubadora a 16 grados centígrados.Una vez que la incubadora se haya enfriado, añadir 1 mililitro de un IPTG molar, 1 mililitro de riboflavina recién preparado y 1 mililitro de 150 gramos por litro recién preparado a cada cultivo. Para la producción de diterpenoides, añadir 25 mililitros de un piruvato de sodio molar a cada cultivo para asegurar una formación de precursor suficiente. Luego, incubar los cultivos a 16 grados centígrados y 140 rotaciones por minuto durante 72 horas, añadiendo 25 mililitros de piruvato de sodio diariamente a los cultivos apropiados.Para la separación y purificación de metabolitos, asegure un embudo separador sobre un soporte de anillo en una campana de humo. Y coloque un contenedor de residuos debajo del embudo. Vierta 500 mililitros de una solución 50/50 de acetato de etilo y hexanos en el embudo separador.Y añade 500 mililitros de la cultura de coexpresión transformada de E.coli de interés en el embudo. Coloque el tapón de vidrio en el embudo y agite el embudo de 5 a 10 veces para mezclar el cultivo con el disolvente de extracción, abriendo con frecuencia el espiga mientras el embudo está boca abajo y apunte hacia la campana de humo para desgasar el embudo. Después de una segunda ronda de temblores y desgasificación como se acaba de demostrar, coloque el embudo erguido en el soporte del anillo durante aproximadamente un minuto.Cuando la capa de disolvente superior se haya separado de la capa de cultivo acuoso, retire el tapón y drene la capa E.coli en un vaso de residuos, conservando la capa de disolvente dentro del embudo. A continuación, repita la extracción con los 500 mililitros restantes del cultivo utilizando los mismos 500 mililitros de disolvente utilizados para la primera extracción, antes de drenar el disolvente que contiene los metabolitos extraídos en un matraz limpio. Aquí, se muestra nuestro cromatografía de gases representativo-espectrometría de masas cromatograma de productos típicos de enzimas extraídas.Los subproductos menores comúnmente observados incluyen cloramphenicol y los derivados indol oxindole y pivalaldehído indol. Después de la purificación de diterpenoides a través de la cromatografía de columna de sílice, se pueden obtener tres compuestos de dolabralixina, cuantificados en función de una curva estándar utilizando el esclareol diterpenoides. La cromatografía de sílice es ideal para lograr una alta pureza de los compuestos diana.Dado que permite la preparación simple de olefinas diterpenas y derivados oxigenados y elimina fácilmente el principal oxindole contaminante, que se conserva en la matriz de sílice. Además, la coexpresión de los genes de la vía terpenoides se puede utilizar para producir diterpenoides en N.Benthamiana, lo que resulta en la producción de dolabradiene y 15, 16 epoxydolabe. Los disolventes utilizados durante la extracción deben optimizarse para las propiedades químicas físicas de los metabolitos de interés y no deben mezclarse con agua para mantener dos capas distintas.Después de este procedimiento, los metabolitos purificados se pueden utilizar para el análisis posterior, incluyendo análisis estructurales y ácidos antibióticos. Esta técnica permitió el descubrimiento de nuevos diterpenoides, incluidos los que se muestran aquí, permitiendo que estos metabolitos fueran analizados por su estructura química y nuevas biactividades. Tome precauciones cuando utilice disolventes orgánicos en un embudo separador.Asegúrese siempre de desechar los residuos biológicos de acuerdo con las normas de seguridad de su laboratorio.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rápida de un solo paso Síntesis enzimática y All-Purificación acuosa de trehalosa Análogos

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Un enfoque Facile y eficiente para la producción de micelas reticuladas reversible disulfuro

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

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Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...