Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Vi erkänner tacksamt Dr Reuben Peters (Iowa State University, USA) för att tillhandahålla pIRS och pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiellt stöd för detta arbete av NSF växt-biotic interaktioner program (Grant # 1758976 till P.Z.), DOE Early karriär Research program (Grant # DE-SC0019178 till P.Z.), DOE gemensamma Genome Institute gemenskapen Science program (Grant # CSP2568 till P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship program (till K.M.M.), och en UC Davis Dean ' s mentorskap Award Fellowship (till K.M.M.) är tacksamt erkänt.

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Bredare undersökning och tillämpning av diterpenoida naturliga produkter kräver enkla, billiga protokoll för att syntetisera och rena tillräckliga mängder av önskade föreningar. Den snabba ökningen av antalet tillgängliga diterpenoid-metaboliska enzymer från ett brett spektrum av arter ger nu en expansiv inventering för enzymatisk produktion av diterpenoids med hjälp av mikrobiella och växtbaserade värdsystem. Dessutom, den modulära arkitekturen i många diterpenoida vägar möjliggör användning av enzymer från samma eller olika arter i "Plug & Play" kombinatorisk teknik metoder för att generera en rad naturliga och nya natur-liknande diterpenoida Natural produkter2,14,26,35.
E. coli är en rekommenderad mikrobiell värd för naturlig produkt biosyntes på grund av dess robusthet, lätthet av skalbarhet, begränsad kemisk komplexitet för minskad biprodukt förorening, och den rikedom av tillgängliga verktyg för DNA-montering och uttryck Optimering. Enligt vår erfarenhet, den plattform som beskrivs här är väl lämpad för att producera produkt avkastning på upp till flera hundra mg diterpen olefiner och alkoholer, som är lämplig för många nedströms tillämpningar inklusive de som föreslås här. Även om inte uppfyller industriell skala, den produktionsplattform som beskrivs här kan fungera som en grund för ytterligare väg, värd och jäsning optimering som har framgångsrikt visat för relaterade diterpenoids såsom taxadiene och Sclareol33 ,34. Överuttryck av hastighetsbegränsande MVA-eller MEP-utbildninggener har framgångsrikt etablerats för att övervinna avkastnings begränsande faktorer för diterpenoida biosyntes, såsom otillräcklig prekursorer tillgång och prekursor Flux i konkurrerande vägar13, 32,33,39. Även om det visat sig framgångsrikt i flera studier, dålig uttryck och katalytisk aktivitet av terpenoid-metabolisk eukaryotisk P450s och andra membran-bundna enzymer i E. coli är en sannolik begränsande faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Användning av Codon-optimerade sekvenser och proteinmodifikationer, såsom avlägsnande av endoplasmatiska Retikulum signal peptid eller införande av en plastidial signal peptid, har visat sig användbar för att öka lösliga P450-uttryck14,38 ,49,50,53. Sådana modifieringar användes också för det mikrobiella samuttrycket av majs CYP71Z1839 som användes som exempel väg i denna studie. De beskrivna protokollen bygger på användning av plasmider som transporterar en eller två gener per konstruktion, allt under samma inducerbara promotor. Om större gen kombinationer önskas, är det tillrådligt att använda olika tillgängliga multi-Gene kassetter eller gen stapling system för att minska minskad omvandling effektivitet och kultur tillväxt på grund av användning av flera plasmider och antibiotika13 .
Med den bredare tillgången på genetik och genomik resurser, växt värdsystem blir också allt mer lämpade för tillverkning av naturprodukter. Fördelar inkluderar förmågan hos växter att producera de nödvändiga naturliga prekursorer som drivs av fotosyntes, vilket möjliggör produkt bildning utan att behöva komplettera föregångare molekyler54,55. N. benthamiana används redan i stor utsträckning för in vivo funktionell karakterisering och kombinatoriskt uttryck av terpenoid och andra naturliga produkt vägar14,35,36,40 . Anmärkningsvärda fördelar med att använda N. benthamiana som värdsystem inkluderar endogena produktionen av diterpenoida prekursorer, användning av infödda gensekvenser, förenklat uttryck för eukaryota P450s, enkel kombinatorisk gen omvandling (som separata antibiotika krävs inte för övergående Co-Transformation), och enkel extraktion av målprodukter från blad material. Vid behov kan diterpenoida produktion förbättras genom Co-Expression av viktiga MEP-utbildninggener för att öka föregångaren Supply36,41. Begränsningar för skalbar diterpenoida produktion i N. benthamiana är mer komplexa jämfört med flytande mikrobiella kulturer på grund av behovet av att generera tillräcklig växtbiomassa, mer arbetsintensiva produkt rening från kemiskt komplexa växtvävnad, och eventuell oönskad metabolisering av målprodukter genom exempelvis oxidation, glykosylering eller Defosforylering av endogena enzymer36,43,44,45 ,46,47. Emellertid, detta förfarande kan skalas upp till mg produktkvantiteter genom att öka antalet växter som används för agroinfiltration56.
De protokoll för extraktion och rening av produkter som beskrivs här är kompatibla med E. coli och N. benthamiana, samt S. cerevisiae och andra växt-eller mikrobiella värdsystem, och ger ett kostnadseffektivt tillvägagångssätt som är lätt att inrättas i både biologi och kemi laboratorier och kräver inte dyr renings utrustning. Metaboliten extraktion med separatoritratten lämpar sig väl för effektiv extraktion och fasseparation före kromatografisk rening. Trattstorlekar kan lätt justeras för att möjliggöra större kultur volymer och minska experimentell tid som behövs för att extrahera från stora kulturer. Vi fann att användningen av en hexan/etylacetat lutning vara idealisk för extraktion diterpenoids av olika polaritet som visas här för den grupp av dolabralexins som omfattar både kolväten och syrade föreningar (figur 3). Beroende på egenskaperna hos målprodukter kan andra lösningsmedelsblandningar vara fördelaktiga. Lösningsmedel får dock inte vara blandbara med vatten för att säkerställa en lyckad extraktion och fasseparation med hjälp av separatorisk tratt teknik. Dessutom måste produktförlust genom avdunstning beaktas vid användning av denna metod för framställning av flyktiga organiska föreningar (VOC), såsom lägre molekylvikt mono-och Sesqui-terpenoider och andra VOC. Kromatografisk separation av diterpenoider av olika nivåer av syresättning med hjälp av en större skala (~ 2 L) kiseldioxid kolumn har varit fördelaktigt i vår erfarenhet, eftersom det ger förbättrad produkt separation och minimerar behovet av iterativ rening steg när du använder mindre kolumn volymer. Kolumn volymer och matriser kan justeras efter behov för önskad kultur volym och typ av naturprodukt. Renheten hos målprodukter som kan uppnås med hjälp av detta protokoll lämpar sig för många nedströmsapplikationer, såsom bioaktivitetsanalyser eller för användning i enzym aktivitetsanalys. Men där högre renhetsnivåer krävs, såsom strukturella analyser via NMR, kan produktens renhet förbättras effektivt genom ytterligare rening med hjälp av (semi)-Preparative HPLC.
Detta protokoll som beskrivs här har optimerats för produktion av diterpenoida naturliga produkter, men kan också lätt anpassas till relaterade mono-, sesqui-och Tri-terpenoider, samt andra naturliga produktklasser helt enkelt genom att generera den önskade enzym moduler för kombinatoriskt uttryck14,57. Ändringar av förfarandena för extraktion och rening av produkter måste dock beaktas för föreningar med högre volatilitet, såsom mono-och Sesqui-terpenoider, eller högre polaritet och funktionell modifiering som exemplifieras av glykosylering av många triterpenoider, fenylpropanoider och andra naturliga produktklasser.
Även industriell skala plattformar för tillverkning av naturliga produkter finns, de protokoll som beskrivs här erbjuder ett billigt, anpassningsbart verktyg som lätt kan inrättas i de flesta laboratorier. Som framgår av produktionen av majs dolabralexins här och på andra ställen39, de produktkvantiteter och renhet som kan uppnås med hjälp av denna metod är vanligtvis tillräckligt för att underlätta olika nedströms analys och användningsområden, inklusive, men inte begränsad till, olika bioaktivitet studier, analys av interaktioner mellan organismer, samt för användning som enzymsubstrat eller som utgångsmaterial för semi-syntesmetoder.

Diterpenoids omfattar en kemiskt varierande grupp av mer än 12 000 övervägande polycykliska 20-Carbon naturliga produkter som spelar kritiska roller i många organismer1. Svampar och växter producerar den största mångfalden av diterpenoids, men bakterier har också visat sig bilda bioaktiva diterpenoids (se recensioner2,3,4,5). Rotade i sin stora strukturella mångfald, diterpenoids tjäna en mängd biologiska funktioner. Några diterpenoids, såsom Gibberellin tillväxthormoner, har viktiga funktioner i utvecklingsprocesser5. Emellertid fungerar majoriteten av diterpenoids som medlare av kemiskt försvar och interorganismal växelverkan. Bland dessa, diterpen harts syror i Pest och patogen försvar av barrträd och artspecifika blandningar av antimikrobiella diterpenoids i större livsmedelsgrödor såsom majs (Zea mays) och ris (Oryza sativa) har varit mest omfattande studerade6,7. Dessa bio aktiviteter ger en rik kemisk databas för kommersiella tillämpningar, och välj diterpenoids används som viktiga läkemedel, livsmedelstillsatser, lim och andra bioprodukter i vardagen moderna livet8,9 ,10. För att främja forskning om den naturliga mångfalden och biologiska funktioner av diterpenoids och i slutändan främjar bredare kommersiella tillämpningar, verktyg för en kostnadseffektiv beredning av rena föreningar krävs. Storskalig isolering från växtmaterial har etablerats för några diterpenoida bioprodukter, såsom diterpen harts syror som produceras som en biprodukt av massa-och pappersindustrin8. Emellertid, ackumulering av diterpenoids i endast specifika vävnader och under stram reglering av miljömässiga stimuli begränsar ofta isolering av tillräckliga produktmängder från den naturliga producenten2. Dessutom hämmar den strukturella komplexiteten av diterpenoids sin produktion genom kemisk syntes, även om sådana metoder har varit framgångsrika i flera fall11,12. Med tillgången till avancerad genomisk och biokemisk teknik, enzymatiska produktionsplattformar har fått ökad uppmärksamhet för att producera en rad diterpenoida föreningar (se recensioner13,14, 15,16,17,18).
Alla terpenoider, inklusive diterpenoids, härrör från två isomeriska isoprenoidprekursorer, isopentenyldifosfat (IPP) och dimetylallyldifosfat (DMAPP)19 som i sin tur bildas genom Mevalonat (MVA) eller väg till metylerytritol-5-fosfat (MEP). Terpenoid biosyntes fortskrider genom MEP vägen i bakterier och MVA vägen i svampar, medan växterna besitter en cytosoliska MVA och en plastidial MEP väg, med den senare är den primära vägen mot diterpenoida formation20. Kondensation av IPP och DMAPP av av transferaser ger den centrala 20-Carbon föregångare till alla diterpenoids, geranylgeranyl Diphosphate (ggpp)20. Nedströms om ggpp-bildning, två enzym familjer, terpensynthaser (tpss) och cytokrom P450-monooxygenaser (P450s) kontrollerar till stor del bildandet av den stora kemiska mångfalden av terpenoid metabolism21,22. Diterpen syntaser (ditpss) katalysera den engagerade carbocation-driven cykliseringen och omplaceringen av ggpp att bilda olika stereospecifika bi-, Poly-, eller makro-cykliska diterpen ställningar1,3,23, 24. Syresättning och ytterligare funktionell dekoration av dessa ställningar sedan underlättas av P450-enzymer och välj andra enzym familjer22,25. TPSs och P450s finns vanligen som artspecifika, multi-Gene familjer som kan bilda modulära biosyntetiska nätverk, där kombinera olika enzymmoduler längs en gemensam skiss möjliggör bildandet av ett brett spektrum av föreningar2, 26. den snabba upptäckten av funktionellt distinkta enzymer verksamma i modulära terpenoid vägar under de senaste åren har gett expanderande möjligheter för deras användning som en mångsidig reservdelslista för metabolisk konstruktion av partiella eller kompletta vägar i både mikrobiella och växtbaserade produktionsplattformar. Till exempel, jäst (Saccharomyces cerevisiae) har tillämpats framgångsrikt att iscensätta flera enzym vägar för tillverkning av terpenoid bioprodukter, såsom malaria läkemedel Artemisinin27, den sesquiterpenoid biobränslen bisabolene och farnesene28, men också välja diterpenoids29,30,31. Likaså, konstruerade Escherichia coli plattformar för industriell skala tillverkning har fastställts för några diterpenoida metaboliter, inklusive Taxol föregångare taxadiene används som ett läkemedel mot cancer och diterpen alkohol, Sclareol , används inom doftindustrin13,32,33,34. Framstegen inom genteknik och omvandlingsteknik har också gjort växt värdsystem allt mer livskraftiga för produktion av vegetabiliska naturprodukter9,14,35,36. I synnerhet den nära tobak släkting, Nicotiana benthamiana, har blivit ett allmänt använt chassi för terpenoid väg analys och ingenjörskonst, på grund av den lätthet av Agrobacterium-medierad omvandling av flera gen kombinationer , effektiv biosyntes av endogena prekursorer och hög biomassa14,35,36.
Genom att rita på dessa etablerade plattformar för terpenoid biosyntes, beskriver vi här lättanvända och kostnadseffektiva metoder för enzymatisk produktion av diterpenoids och rening av enstaka föreningar. De presenterade protokollen illustrerar hur E. coli och N. benthamiana -plattformar konstruerade för förbättrad diterpenoida-prekursor-biosyntes kan utnyttjas för kombinatoriska uttryck av olika Ditpss-och P450-enzymer för att generera önskade diterpenoida föreningar. Tillämpning av detta protokoll för att producera och rena strukturellt olika diterpenoids visas genom exempel på specialiserade diterpenoids från majs (Zea mays), kallas dolabralexins, endogena biosyntes som rekryterar två diken och en P450 Enzym. Rening av olika dolabralexins allt från olefiner till syrenerade derivat uppnås sedan genom att kombinera separatorisk tratt utvinning med storskalig kiselkolonnkromatografi och förberedande högtrycks vätskekromatografi (HPLC). De beskrivna protokollen är optimerade för produktion av diterpenoids, men kan också lätt anpassas för relaterade terpenoid klasser, liksom andra naturliga produkter för vilka enzym resurser finns tillgängliga. Föreningar som framställs med denna metod lämpar sig för olika nedströms tillämpningar, inklusive men inte begränsat till, strukturell karakterisering via kärnmagnetisk resonans (NMR) analys, användning som substrat för enzym funktionella studier, och en rad bioaktivitetsanalyser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoids bildar en mångsidig klass av små molekyler naturliga produkter som är spridda över livets riken och har kritiska biologiska funktioner i utvecklingsprocesser, interorganismal interaktioner, och miljöanpassning. På grund av dessa olika bio aktiviteter, många diterpenoids är också av ekonomisk betydelse som läkemedel, livsmedelstillsatser, biobränslen, och andra bioprodukter. Avancerad genomik och biokemiska metoder har möjliggjort en snabb ökning av kunskapen om diterpenoid-metaboliska gener, enzymer och vägar. Men den strukturella komplexiteten av diterpenoids och den smala taxonomiska fördelningen av enskilda föreningar i ofta bara en enda art förblir begränsande faktorer för sin effektiva produktion. Tillgängligheten av ett bredare spektrum av metaboliska enzymer ger nu resurser för att producera diterpenoids i tillräckliga titrar och renhet för att underlätta en djupare undersökning av denna viktiga metabolitgrupp. På grundval av etablerade verktyg för mikrobiellt och växtbaserat enzym Co-Expression presenterar vi ett lättmanövrerad och anpassningsbart protokoll för enzymatisk produktion av diterpenoider i antingen Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, och rening av önskade produkter via kiselkromatografi och semi-Preparative HPLC. Använda gruppen av majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoids som ett exempel, vi belyser hur modulära kombinationer av diterpen syntas (diken) och cytokrom P450 monooxygenas (P450) enzymer kan användas för att generera olika diterpenoida ställningar. Renade föreningar kan användas i olika nedströms applikationer, såsom metabolit strukturella analyser, enzym struktur-funktion studier, och in vitro-och i planta bioaktivitet experiment.

Schematiskt arbetsflöde för diterpenoida produktion med E. coli Figur 1 illustrerar det beskrivna arbetsflödet för diterpenoida produktion. Det protokoll som beskrivs här har anpassats från en tidigare beskrivna E. coli plattform för diterpenoida biosyntes13,32 för användning av större volym kulturer och rening av önskade diterpenoida produkter via kiseldioxid Kromatografi. För att demonstrera användningen av detta protokoll använde vi en nyligen identifierad dolabralexin-väg från majs som består av två diTPSs, ZmAN2 (Zm00001d029648) och ZmKSL4 (Zm00001d032858), en multifunktionell P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) och en cytokrom P450- reduktas (ZmCPR2, Zm00001d026483) (figur 2). I korthet var E. coli BL21DE3-C41 kompetenta celler föromvandlade med pcdfduet: IRS och pacyc-Duet: ggpps/ZmAN2 plasmider13,32. Den pCDFDuet: IRS plasmid innehåller viktiga enzymer för diterpenoida prekursorer produktion, inklusive 1-deoxy-D-Xylulose-5-fosfat syntas (DXS), 1-deoxy-D-Xylulose-5-fosfat reduktas (DXR), och isopentenyl Diphosphate Isomerase (IDI), och visade sig öka diterpenoida bildning i E. coli13. Den pACYC-Duet: GGPPS/ZmAN2 plasmid innehåller majs ENT-copalyl Diphosphate syntas ZmAN2 och en ggpp syntas från Abies grandis. Enzymer som katalyserar de engagerade reaktionerna i dolabralexin-biosyntes var då samomvandlade som plasmider pET28b: ZmKSL4 och pETDUET: ZmCPR2/ZmCYP71Z18. För detaljer om sekvenser och plasmid konstruktioner se mafu et al. 201839.
En GC-MS kromatogram av de extraherade enzym produkterna visas i figur 3asom illustrerar bildandet av tre dolabralexin-föreningar, nämligen dolabradien (1,2 ± 0,25 mg/l-kultur), epoxydolabrene (0,65 ± 0,2 mg/l-kultur) och epoxydolabranol (11,4 ± 1,1 mg/L kultur) som kvantifieras baserat på en standardkurva med hjälp av diterpenoida Sclareol. Sclareol användes som en referensstandard, på grund av dess liknande struktur och kemiska egenskaper jämfört med dolabralexins. Vanligtvis observerade mindre biprodukter inkluderar kloramfenikol, indol derivat oxindole och indol-5-aldehyd, och föregångaren geranylgeranyl Diphosphate (GGPP) (figur 3). Indole representerar vanligen den primära biprodukten, men visas inte här, på grund av dess retentionstid kortare än den inställda lösningsmedels fördröjningen på 7 min för att bevara integriteten hos GC-MS-instrumentet.
Schematiskt arbetsflöde för diterpenoida produktion med hjälp av N. benthamiana Figur 4 visar en översikt över uttrycket av dolabralexin-vägen i N. benthamiana. För de produkter som beskrivs här, omformades följande konstruktioner separat i A. tumefaciens stam GV3101: pLife33: P19 (som uttrycker P19 genen som tystas suppressor protein), PLife33: ZmCYP71Z18, PLife33: ZmAN2, PLife33: ZmKSL4. Fullängds infödda sekvenser av majs dolabralexin Pathway gener användes i den binära T-DNA-vektorn pLife3341 med kanamycin resistens för förökning i E. coli och A. tumefaciens. Co-Expression av uppströms terpenoid Pathway gener är frivilligt, eftersom föregångaren geranylgeranyl Diphosphate är endogent bildas i N. benthamiana. Emellertid, flera studier har framgångsrikt använt sådana metoder för att öka diterpenoida bildandet i N. benthamiana14,36,41. Som illustreras i figur 3producerade Co-Expression framgångsrikt dolabradiene och 15, 16-epoxydolabrene. Till skillnad från enzym Co-Expression i E. coli, var 15, 16-epoxydolabranol inte detekteras i metabolit extrakt.
Förekomst av 15, 16-epoxydolabrene i blad extrakt visat aktiviteten hos CYP71Z18 i N. benthamiana. Eftersom 15, 16-epoxydolabranol visades vara stabil efter extraktion från mikrobiella kulturer (figur 3) samt efter isolering från majs rot vävnader i tidigare studier39, förefaller det rimligt att den hydroxylerade produkten är glykosylerat av endogena glykosyltransferaser och därefter beslagtagna i vacuole, vilket gör den otillgänglig för extraktion med blandningar av organiska lösningsmedel som används här för extraktion36,43,44,45 ,46. Liknande oönskade produktändringar i samband med vägteknik i N. benthamiana har rapporterats i tidigare studier47. Som visas för co-Expression i E. coli, övergående uttryck i N. benthamiana resulterar i utvinning av flera biprodukter, inklusive linjära alkaner av olika kedjelängd som bygger på jämförelse med referensmassa Spectra databaser. Sammansatta titrar utvinns ur blad material befanns vara i genomsnitt 2,4 +/-0,5 mg dolabradiene och 0,9 +/-0,3 mg 15, 16-epoxydolabrene per g torr bladvävnad. Dessa titrar kan inte jämföras direkt med co-Expression-systemet E. coli givet de olika experimentella uppställningar.
Diterpenoid rening Diterpenoid rening uppnåddes med hjälp av kiselkolonnkromatografi och efterföljande semi-Preparative HPLC. Metaboliten extrakt från 12 L av poolade E. coli kulturer renades med hjälp av kiselkolonnkromatografi att separera de tre fokala dolabralexin föreningar (figur 3a). Kiselkromatografi är idealisk för att uppnå hög renhet av mål föreningarna, eftersom det möjliggör enkel separation av diterpen olefiner och syrade derivat, och lätt avlägsnar det stora föroreningar, oxindole, som behålls på kiseldioxid matris ( Figur 3a).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Figur 1: arbetsflöde för diterpenoida produktion i E. coli och metabolit rening från flytande bakteriekulturer. Streckade rutor avbildar valfria steg där ytterligare rening krävs. (A) representativ bild av extraherad E. coli -kultur med en separatorisk tratt. (B) representativ bild av metaboliten extrakt rening med hjälp av kiselkromatografi.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Figur 2: Dolabralexin biosyntetisk väg och gen konstruktioner som används i denna studie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Figur 3: GC-MS resultat. Visas är representativa GC-MS kromatogram av renade diterpenoida produkter som erhållits med hjälp av enzym Co-Expression-analyser i (a) E. coli och (B) N. benthamiana. Produkt identifieringar baseras på jämförelser med autentiska standarder och referensmassa spektra av det nationella institutet för standarder och teknik (NIST) Mass spektralbibliotek. 1, oxindole; 2, indol-5-aldehyd; 3, pyrrolo [1,2-a] pyrazin-1,4-Dione, hexahydro-3-(2-metylpropyl)-; 4, 6-O-acetyl-1-[[4-bromofenyl] Thio]-a-d-glukosid S, S-dioxid; 5, dolabradiene; 6, 15, 16-epoxydolabrene; 7, pyrrolo [1,2-a] pyrazin-1,4-Dione, hexahydro-3-(fenylmetyl)-; 8, 15, 16-epoxydolabranol; 9 och 12, okänd; 10, kloramfenikol; 11, 3, 7, 11, 15-tetrametyl-2-hexadecen-1-OL; 13-16, alkaner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Figur 4: Diterpenoid produktion i N. benthamiana. (A) arbetsflöde av diterpenoida produktion i N. benthamiana och metabolit rening från blad material. Brepresentativ bild av N. benthamiana -plantor som är redo för infiltrations experiment, före beskärning. Crepresentativa bilder av N. benthamiana -växter efter beskärning. (D) bild av sprutinfiltrerade löv. Mörkare områden har infiltrerats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Här presenterar vi lättanvända protokoll för framställning och rening av diterpenoida metaboliter genom kombinatoriska uttryck av biosyntetiska enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, följt av kromatografisk produkt Rening. De resulterande metaboliterna är lämpliga för olika studier inklusive molekylär struktur karakterisering, enzym funktionella studier, och bioaktivitet analyser.

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Detta protokoll är lämpligt för att producera renade diterpenoider som kan användas för olika nedströmsanalyser och som kan anpassas för en rad olika metabolitmål. Den största fördelen med denna metod är det är en enkel och billig metod för att producera milligram mängder av specialiserade metaboliter. Genom att utbyta de gener och enzymer som används för co-expression, kan denna metod modifieras för att producera andra terpenoider, inklusive monoterpenoider och sesquiterpenoids, liksom andra metabolit klasser såsom flavonoider.För diterpenoid metabolisk produktion och omvandling, börja med att värma kemiskt kompetenta E.coli celler på is. När kulturen har tinat, tillsätt 25 mikroliter kompetenta celler per konstruktion till en kyld 1,5 milliliter microtube och tillsätt 1 mikroliter av en 100 nanogram per mikroliter lösning av varje konstruktion som används för co-uttryck. Inkubera blandningarna på is i 30 minuter med skonsam blandning var 10:e minut genom att skrapa rören över ett mikrorörsställ.I slutet av inkubationen, värme chock cellblandningarna vid 42 grader celsius i en minut innan de placerar cellerna tillbaka på is i minst två minuter. Därefter lägger du till 200 mikroliter på 37 grader celsius SOC-medium till rören. Och inkubera kulturerna i en timme vid 37 grader celsius och 200 rotationer per minut.I slutet av inkubationen, tillsätt cirka 10 autoklaverade glaspärlor och 100 mikroliter celler till en 37 grader celsius värms lysogeny buljong agar platta med lämpliga antibiotika. Och skaka plattan horisontellt med locket på plats för att jämnt fördela cellerna. Sedan försiktigt knacka glaspärlorna i en avfallsbehållare och inkubera plattan på 37 grader celsius över natten, belagda ytan nedåt.Nästa dag, ta bort plattan från inkubatorn. Tillsätt 5 milliliter nyberedda lysogeny buljong medium med lämpliga antibiotika till en 15 milliliter sterilt glasrör med en plast andas mössa per planerad 1 liters kultur, och använda en pipet spets för att plocka enskilda omvandlas E.Coli kolonier från agar plattan. Tillsätt en plockad koloni till var och en av de förberedda 15 milliliter rör och locket varje rör med den medföljande andas plastlock.Placera sedan de utjämnade E.coli-småkulturerna i en 37 grader celsius skakinkubator i 12 till 24 timmar. Nästa dag lägga 100 milliliter av 10x PBS till 900 milliliter av fantastisk buljong i en 1 liters kolv per liten kultur med lämpliga antibiotika. Och placera kolvarna på 37 grader varmt och 140 rotationer per minut i cirka 30 minuter.När den fantastiska buljongen är varm, tillsätt hela 5 milliliter volym av varje inokulering kultur till en 1 liters odling kolv per kultur. Och placera kolvarna i skakinkubatorn på 140 rotationer per minut i cirka 3 timmar. När den optiska densiteten vid 600 nanometer når 0,6, minska temperaturen på inkubatorn till 16 grader celsius.När inkubatorn har svalnat, tillsätt 1 milliliter av en molar IPTG, 1 milliliter nyberedda 4 gram per liter riboflavin och 1 milliliter nyberedda 150 gram per liter aminolevulinsyra till varje kultur. För diterpenoid produktion, tillsätt 25 milliliter av en molar natriumpyuvat till varje kultur för att säkerställa en tillräcklig föregångare bildning. Sedan, inkubera kulturerna vid 16 grader celsius och 140 rotationer per minut i 72 timmar, lägga till 25 milliliter natriumpyuvat dagligen till lämpliga kulturer.För metabolitseparering och rening, säkra en separatorisk tratt på ett ringstativ i en draghuva. Och placera en avfallsbehållare under tratten. Häll 500 milliliter av en 50/50 lösning av etylacetat och hexanes i separeringstratten.Och lägg till 500 milliliter av den förvandlade E.coli co-expression kultur av intresse i tratten. Placera glasproppen på tratten och skaka tratten 5 till 10 gånger för att blanda kulturen med extraktionslösningsmedlet, öppna ofta tappen medan tratten är upp och ner och rikta den in i rökhuven för att avgasa tratten. Placera tratten upprätt i ringstativ i ungefär en minut efter en andra skakning och avgasning som precis visats.När det översta lösningsmedelsskiktet har separerat från vattenodlingsskiktet, ta bort proppen och dränera E.coli-skiktet i en avfallsbägare, behålla lösningsmedelsskiktet i tratten. Upprepa sedan extraktionen med de återstående 500 milliliter av odlingen med samma 500 milliliter lösningsmedel som användes för den första extraktionen, innan det lösningsmedel som innehåller de extraherade metaboliterna töms i en ren kolv. Här visas våra representativa gaskromatografi-masspektrometrikromatogram av typiska extraherade enzymprodukter.Vanligt observerade mindre biprodukter inkluderar kloramfenikol och indol derivaten oxindol och indol pivalaldehyd. Efter diterpenoid rening via kiseldioxidkolonnkromatografi kan tre dolabralexinföreningar erhållas, som kvantifierade utifrån en standardkurva med hjälp av diterpenoiden sclareol. Kiselkromatografi är idealisk för att uppnå en hög renhet av målföreningarna.Eftersom det möjliggör enkel beredning av diterpenolefiner och syresatt derivat och lätt tar bort de stora förorena oxindol, som behålls på kiseldioxid matris. Vidare kan co-expression av terpenoid väg gener användas för att producera diterpenoider i N.Benthamiana, vilket resulterar i produktionen av dolabradiene och 15, 16 epoxydolabrene. De lösningsmedel som används under extraktionen bör optimeras för de fysikaliska kemiska egenskaperna hos de metaboliter som är av intresse och får inte kunna blandas med vatten för att bibehålla två distinkta skikt.Efter detta förfarande kan rena metaboliter användas för analys nedströms, inklusive strukturanalys och antibiotikasyror. Denna teknik möjliggjorde upptäckten av nya diterpenoider, inklusive de som visas här, vilket gör att dessa metaboliter kan analyseras för sin kemiska struktur och nya biaktiva. Vidta försiktighetsåtgärder vid användning av organiska lösningsmedel i en separata tratt.Var alltid noga med att göra sig av med biologiskt avfall enligt dina labsäkerhetsstandarder.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Snabb ett steg Enzymatisk syntes och All-vatten Rening av trehalos analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion och rening av en terapeutisk antikropp

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Framställning av Giant vesiklar inkapslande mikrosfärer genom centrifugering av en vatten-i-olja-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet metoden för rening av enzymatiskt aktiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analys för fosforylering och mikrotubuli bindande tillsammans med lokalisering av Tau-Protein i kolorektal cancerceller

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...