Name: a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

Biz minnetle Dr Reuben Peters (Iowa State University, ABD) pIRS ve pGGxZmAN2 yapıları sağlamak için kabul ediyoruz. NSF Bitki-Biyotik Etkileşimler Programı (1758976'dan P.Z.'ye hibe, DOE Erken Kariyer Araştırma Programı (grant# DE-SC0019178 to P.Z.), DOE Joint Genome Institute Community Science Program (grant# CSP2568 to P.Z.), NSF tarafından bu çalışma için mali destek Lisansüstü Araştırma Bursu Programı (K.M.M.'ye) ve UC Davis Dean'in Mentorluk Ödülü Bursu (K.M.M.'ye) minnetle kabul edilmektedir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Diterpenoid doğal ürünlerin daha geniş bir şekilde araştırılması ve uygulanması, istenilen bileşiklerin yeterli miktarda sentezlemek ve arındırmak için basit, ucuz protokoller gerektirir. Mevcut diterpenoid-metabolik enzimlerin çok çeşitli türlerin indeki hızlı artış, mikrobiyal ve bitki bazlı konak sistemleri kullanılarak diterpenoidlerin enzimatik üretimi için geniş bir envanter sağlamaktadır. Buna ek olarak, birçok diterpenoid yolların modüler mimarisi doğal ve yeni doğa benzeri diterpenoid doğal bir dizi oluşturmak için 'tak & çalıştır' kombinatoryal mühendislik yaklaşımları aynı veya farklı türlerden enzimlerin kullanımını sağlar ürünler2,14,26,35.
E. coli sağlamlığı, ölçeklenebilirlik kolaylığı, azaltılmış yan ürün kontaminasyonu için sınırlı kimyasal karmaşıklık ve DNA montajı ve ekspresyonu için kullanılabilir araçların zenginliği nedeniyle doğal ürün biyosentezi için tercih edilen bir mikrobiyal konaktır. Optimizasyonu. Deneyimlerimizde, burada açıklanan platform, burada önerilenler de dahil olmak üzere birçok downstream uygulamaları için uygundur diterpene olefins ve alkoller, birkaç yüz mg kadar ürün verimleri üretmek için uygundur. Endüstriyel ölçekte karşılanmamakla birlikte, burada açıklanan üretim platformu, taksonen ve sclareol 33 gibi ilgili diterpenoidler için başarıyla gösterildiği gibi daha fazla yol, ev sahibi ve fermantasyon optimizasyonu için bir temel olarak hizmet verebilir33 ,34. Oran sınırlayıcı MVA veya MEP yol genlerinin aşırı ekspresyonu, diterpenoid biyosentez için verim sınırlayıcı faktörlerin üstesinden gelmek için başarıyla kurulmuştur, örneğin rakip yollara yetersiz öncül kaynağı ve öncül akısı gibi13, 32,33,39. Çeşitli çalışmalarda başarılı olduğu kanıtlansa da, terpenoid-metabolik ökaryotik P450'lerin ve E. coli'deki diğer membrana bağlı enzimlerin zayıf ekspresyonu vekatalitik aktivitesi muhtemel bir sınırlayıcı faktördür33,39 ,48,49,50,51,52. Endoplazmik retikulum sinyal peptidin inkişası veya plastidial sinyal peptidin getirilmesi gibi kodon için optimize edilmiş dizilerin ve protein modifikasyonlarının kullanımı, çözünür P450 ekspresyonunu artırmak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır14,38 ,49,50,53. Bu çalışmada örnek bir yol olarak kullanılan cyp71Z1839'un mikrobiyal ortak ekspresyonu için de bu tür değişiklikler kullanılmıştır. Açıklanan protokoller, yapı başına bir veya iki gen taşıyan plazmidlerin kullanımına dayanmaktadır, hepsi de aynı indükleyici altında. Daha büyük ölçekli gen kombinasyonlarının istendiği durumlarda, çoklu plazmid ve antibiyotiklerin kullanımı nedeniyle azaltılmış dönüşüm verimliliğini ve kültür büyümesini azaltmak için çeşitli mevcut çoklu gen kasetlerinin veya gen istifleme sistemlerinin kullanılması tavsiye edilir13 .
Genetik ve genomik kaynakların daha geniş kullanılabilirliği ile, bitki konak sistemleri de giderek doğal ürünlerin üretimi için uygun hale gelir. Avantajları fotosentez tarafından desteklenmektedir gerekli doğal öncüleri üretmek için bitkilerin yeteneği, böyleceöncümoleküller54,55takviyesi gerek kalmadan ürün oluşumunu sağlayan içerir. N. benthamiana zaten yaygın olarak in vivo fonksiyonel karakterizasyonu ve terpenoid ve diğer doğal ürün yollarının kombinatoryal ekspresyonu için kullanılır14,35,36,40 . N. benthamiana'yı ana sistem olarak kullanmanın önemli avantajları arasında diterpenoid öncüllerinin endojen üretimi, yerli gen dizilerinin kullanımı, ökaryotik P450'lerin basitleştirilmiş ekspresyonu, kombinatoryal gen dönüşümünün kolaylığı (as geçici eş dönüşüm için ayrı antibiyotikler gerekli değildir) ve yaprak malzemeden hedef ürünlerin basit çıkarılması. Gerektiğinde, diterpenoid üretim öncül kaynağı artırmak için anahtar MEP yolu genlerinin ortak ifade yoluyla geliştirilebilir36,41. N. benthamiana'da ölçeklenebilir diterpenoid üretimi için kısıtlamalar, kimyasal kompleksten daha fazla emek yoğun ürün arınması, yeterli bitki biyokütlesi, daha fazla emek yoğun ürün saflaştırma sıyrık mikrobiyal kültürlere göre daha karmaşıktır. bitki dokusu ve hedef ürünlerin olası istenmeyen metabolizasyonu, örneğin, oksidasyon, glikozilasyon veya defosforilasyon endojen enzimler tarafından36,43,44,45 ,46,47. Ancak, bu işlem tarımsal filtrasyon için kullanılan bitki sayısı artırılarak mg ürün miktarlarına kadar ölçeklendirilebilir56.
Burada açıklanan ürün çıkarma ve arıtma protokolleri E. coli ve N. benthamiana, s. cerevisiae ve diğer bitki veya mikrobiyal konak sistemleri ile uyumludur ve kolay bir maliyet-etkin bir yaklaşım sağlar hem biyoloji hem de kimya laboratuvarlarında kurulmuş ve pahalı arıtma ekipmanı gerektirmez. Ayırıcı huni kullanarak metabolit ekstraksiyonu, kromatografik saflaştırma öncesinde verimli ekstraksiyon ve faz ayırma için uygundur. Huni boyutları, daha büyük kültür hacimleri için izin vermek ve büyük kültürlerden ayıklamak için gereken deneysel süreyi azaltmak için kolayca ayarlanabilir. Hem hidrokarbon hem de oksijenli bileşikleri oluşturan dolabralexin grubu için gösterildiği gibi farklı polaritediterpenoidleri ayıklamak için ideal bir heksan/etil asetat gradyan kullanımı bulduk(Şekil 3). Hedef ürünlerin özelliklerine bağlı olarak, diğer çözücü karışımları avantajlı olabilir. Ancak, ayırıcı huni tekniği kullanılarak başarılı ekstraksiyon ve faz ayırma sağlamak için çözücüler su ile yanlış olmamalıdır. Buna ek olarak, buharlaşma yoluyla ürün kaybı, düşük molekül ağırlıklı mono- ve sesqui-terpenoids ve diğer VOCs gibi uçucu organik bileşikler (VOCs) üretmek için bu yaklaşımı kullanırken dikkate alınmalıdır. Daha büyük ölçekli (~2 L) silika kolonu kullanarak farklı oksijenleme seviyelerindeki diterpenoidlerin kromatografik olarak ayrılması, geliştirilmiş ürün ayrıştırma sağladığı ve yinelemeli saflaştırma ihtiyacını en aza indirdiği için deneyimimizde avantajlı olmuştur. daha küçük sütun birimleri kullanırken adımlar. Kolon hacimleri ve matrisler istenilen kültür hacmi ve doğal ürün türü için gerektiği gibi ayarlanabilir. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen hedef ürünlerin saflığı, biyoaktivite tahlilleri veya enzim aktivitesi analizlerinde kullanım gibi birçok alt akım uygulaması için uygundur. Ancak, NMR üzerinden yapılan yapısal analizler gibi daha yüksek saflık düzeylerinin gerekli olduğu durumlarda, ürün saflığı (yarı)-preparatif HPLC kullanılarak ek arıtma ile verimli bir şekilde geliştirilebilir.
Burada açıklanan bu protokol diterpenoid doğal ürünlerin üretimi için optimize edilmiştir, ama aynı zamanda kolayca ilgili mono-, sesqui- ve tri-terpenoids yanı sıra diğer doğal ürün sınıfları sadece istenilen enzim üreterek özelleştirilebilir kombinatoryal ekspresyon modülleri14,57. Ancak, mono ve sesqui-terpenoidler veya daha yüksek polarite ve fonksiyonel modifikasyon gibi daha yüksek uçuculuğa sahip bileşikler için ürün çıkarma ve saflaştırma prosedürlerinde yapılan değişiklikler dikkate alınmalıdır. birçok triterpenoidler glikozilasyon, fenilpropanoidler, ve diğer doğal ürün sınıfları.
Doğal ürünlerin üretimi için endüstriyel ölçekli platformlar mevcut olmasına rağmen, burada açıklanan protokoller kolayca çoğu laboratuvarda kurulabilir ucuz, özelleştirilebilir bir araç sunuyoruz. Burada ve başka bir yerde mısır dolabralexins üretimi gösterildiği gibi39, bu yaklaşım kullanılarak elde edilebilir ürün miktarları ve saflık genellikle dahil olmak üzere çeşitli downstream analizi ve kullanımları kolaylaştırmak için yeterlidir, ancak değil sınırlı, çeşitli biyoaktivite çalışmaları, organizmalar arasındaki etkileşimlerin analizi, hem de enzim substratları olarak kullanmak için ya da yarı-sentez yaklaşımları için başlangıç malzemesi olarak.

Diterpenoidler 12.000'den fazla kimyasal olarak çeşitli bir grup oluşur ağırlıklı olarak polisiklik 20-karbon doğal ürünler birçok organizmalar da kritik rol oynamaktadır1. Mantarlar ve bitkiler diterpenoidlerin en büyük çeşitliliği üretmek, ancak bakteriler de biyoaktif diterpenoidler oluşturmak için gösterilmiştir (değerlendirmeleri bakınız2,3,4,5). Kökleri geniş yapısal çeşitliliklerine dayanan diterpenoidler çok sayıda biyolojik fonksiyona hizmet ederler. Gibberellin büyüme hormonları gibi birkaç diterpenoids, gelişimsel süreçlerde temel fonksiyonlara sahip5. Ancak, diterpenoidlerin çoğunluğu kimyasal savunma ve organizmalar arası etkileşimlerin arabulucuları olarak hizmet vermektedir. Bunlar arasında, kozalaklı ağaçların haşere ve patojen savunma sındaki diterpene reçine asitleri ve mısır (Zea mays)ve pirinç(Oryza sativa)gibi büyük gıda ürünlerinde antimikrobiyal diterpenoidlerin türe özgü karışımları en yaygın olarak 6,7okudu . Bu biyoaktiviteler ticari uygulamalar için zengin bir kimyasal depo sağlar ve belirli diterpenoidler önemli ilaçlar, gıda katkı maddeleri, yapıştırıcılar ve günlük modern yaşamın diğer biyoürünleri olarak kullanılır8,9 ,10. Diterpenoidlerin doğal çeşitliliği ve biyolojik işlevleri üzerine araştırmayı ilerletmek ve sonuçta daha geniş ticari uygulamaları teşvik etmek için, saf bileşiklerin uygun maliyetli hazırlanması için araçlar gereklidir. Posa ve kağıtendüstrisininbir yan ürünü olarak üretilen diterpene reçine asitler gibi birkaç diterpenoid biyoürünler için bitki materyalinden büyük ölçekli izolasyon oluşturulmuştur. Ancak, sadece belirli dokularda diterpenoidlerin birikimi ve çevre uyaranları tarafından sıkı düzenleme altında genellikle doğal üretici den yeterli ürün miktarlarının izolasyon sınırlar2. Buna ek olarak, diterpenoidlerin yapısal karmaşıklığı kimyasal sentez yoluyla üretim engeller, bu tür yaklaşımlar çeşitli durumlarda başarılı olmasına rağmen11,12. Gelişmiş genomik ve biyokimyasal teknolojilerin kullanılabilirliği ile, enzimatik üretim platformları diterpenoid bileşikleri bir dizi üretmek için artan dikkat kazanmıştır (değerlendirmeleri 13 bakınız13,14, 15,16,17,18).
Diterpenoidler de dahil olmak üzere tüm terpenoidler, iki izorik izoprenoid öncülleri türetilmiştir, izopentenil difosfat (IPP) ve dimetildil difosfat (DMAPP)19, sırayla, mevalonat (MVA) veya oluşur methylerythritol-5-fosfat (MEP) yolu. Terpenoid biyosentez bakterilerde MEP yolu ve mantarlarda MVA yolu ile ilerler, bitkiler bir sitosolik MVA ve plastidial MEP yolu sahip ise, ikincisi diterpenoid oluşumuna doğru birincil yol olmak20. Prenyl transferazları ile IPP ve DMAPP yoğuşması tüm diterpenoidler, geranylgeranyl difosfat (GGPP)20merkezi 20 karbon öncüsü verir. GGPP oluşumunun downstream, iki enzim aileleri, terpen synthases (TPSs) ve sitokrom P450 monooksijenazlar (P450s) büyük ölçüde terpenoid metabolizmasının geniş kimyasal çeşitliliğin oluşumunu kontrol21,22. Diterpen synthases (diTPSs) kararlı karbocation odaklı siklizasyon ve ggpp yeniden düzenlenmesi katalize çeşitli stereospesifik bi-, poli- veya makro-siklik diterpen iskeleler1,3,23, 24. yıl. Oksijenasyon ve bu iskelelerin daha fonksiyonel dekorasyon sonra P450 enzimleri tarafından kolaylaştırılmış ve diğer enzim aileleri seçin22,25. TPSs ve P450s yaygın olarak türlere özgü olarak var, modüler biyosentetik ağlar oluşturabilirsiniz çok genli aileler, ortak bir plan boyunca farklı enzim modülleri birleştirerek bileşiklerin geniş bir yelpazede oluşumunu sağlar2, 26- Son yıllarda modüler terpenoid yollarda faaliyet gösteren işlevsel olarak farklı enzimlerin hızlı keşfi, kısmi veya tam yolların metabolik mühendisliği için çok yönlü bir parça listesi olarak kullanımları için genişleyen fırsatlar sağlamıştır hem mikrobiyal hem de bitki bazlı üretim platformları. Örneğin, maya(Saccharomyces cerevisiae) terpenoid biyoürünlerin üretimi için çok enzimli yollar mühendisi başarıyla uygulanmıştır, antimalarial ilaç artemisinin gibi27, sesquiterpenoid biyoyakıt bisabolene ve farnesene28, ama aynı zamanda diterpenoidsseçin 29,30,31. Aynı şekilde, endüstriyel ölçekli üretim için tasarlanmış Escherichia coli platformları birkaç diterpenoid metabolitleri için kurulmuştur, Taxol öncütakteri taksonen bir anti-kanser ilaç ve diterpen alkol olarak kullanılan dahil, sclareol , koku sektöründe kullanılan13,32,33,34. Genetik mühendisliği ve dönüşüm teknolojilerindeki gelişmeler de bitki konak sistemleri giderek bitki doğal ürünler9,14,35,36üretmek için uygun hale getirmiştir. Özellikle, yakın tütün akrabası, Nicotiana benthamiana, terpenoid yol analizi ve mühendislik için yaygın olarak kullanılan bir şasi haline gelmiştir, Agrobacteriumkolaylığı nedeniyle -birden fazla gen kombinasyonları aracılı dönüşüm , endojen öncüllerin verimli biyosentezi, ve yüksek biyokütle14,35,36.
Terpenoid biyosentez iÃ§in bu kurulan platformlardan yola Ã§Ä±karÄ±larak, burada diterpenoidlerin enzimatik Ã1/4retimi ve tek bileşiklerin arÄ±nmasÄ± iÃ§in kullanÄ±labilir ve maliyet etkin lÃ1/4ksler kullanÄ±lÄ±yor. Sunulan protokoller, gelişmiş diterpenoid öncül biyosentez için tasarlanmış E. coli ve N. benthamiana platformlarının farklı diTPS'lerin ve P450 enzimlerinin kombinatoryal ekspresyonunda nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. istenilen diterpenoid bileşikler. Yapısal olarak farklı diterpenoidler üretmek ve arındırmak için bu protokolün uygulanması mısır(Zea mays),dolabralexins, endojen biyosentez olarak adlandıran uzman diterpenoidler örneği ile gösterilir hangi acemi iki diTPS ve bir P450 Enzim. Olefinlerden oksijenli türevlerine kadar farklı dolabalexinlerin saflaştırılması, daha sonra ayırıcı huni ekstraksiyonunun büyük ölçekli silika sütun kromatografisi ve preparatif yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile birleştirilmesiyle elde edilir. Açıklanan protokoller diterpenoidüretimi için optimize edilmiştir, ancak ilgili terpenoid sınıfları ve enzim kaynaklarının mevcut olduğu diğer doğal ürünler için de kolayca uyarlanabilir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen bileşikler, nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi ile yapısal karakterizasyon, enzim fonksiyonel çalışmalar için substrat olarak kullanılması ve biyoaktivite tahlilleri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1020 Trays</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-FLHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-500g</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Tech Square Pot</td>
			<td>McConkey Wholesale Grower&#39;s Supply</td>
			<td>JMCTS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5977 Extractor XL MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7890B GC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial yeast extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>BK-2001-015B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap, 9 mm blue screw, PFTE</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5185-5820</td>
			<td>GC vial cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-532</td>
			<td>Carb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50247423</td>
			<td>Chlor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography column</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>CL-0015-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear humidity dome</td>
			<td>Greenhouse Megastore</td>
			<td>CN-DOME</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColiRollers Plating Beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71013</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Mortars</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961A</td>
			<td>mortar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoorsTek Porcelain Pestles</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-961-5A</td>
			<td>pestle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50981039</td>
			<td>Aminoleuvolinic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A962-4</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E1454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Falcon tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Disposable Cuvettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td>cuvette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-541</td>
			<td>microtube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H292-4 (CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP-5MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19091S-433</td>
			<td>GC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inlet adapter</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>AD-0006-003</td>
			<td>glass inlet adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1755-100</td>
			<td>IPTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9065</td>
			<td>Kan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-798</td>
			<td>breathable test tube lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Acros</td>
			<td>223210010</td>
			<td>MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506-500g</td>
			<td>MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food</td>
			<td>Miracle-Gro</td>
			<td>2756810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.746.0001</td>
			<td>tissue mill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Fernbach culture flask</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z360236</td>
			<td>2.8 L flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick I26</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1324-0000</td>
			<td>Shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotiana benthamiana seed</td>
			<td>USDA Germplasm Repository</td>
			<td>Accession TW16</td>
			<td>N. benthamiana</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60442</td>
			<td>C41-DE3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M wrapping film</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S37440</td>
			<td>Parafilm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-9541</td>
			<td>KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P288-3</td>
			<td>Dipotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex disposable culture tubes, rimless</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS9944516</td>
			<td>test tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate Acid Sodium Salt</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368477</td>
			<td>Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort Ring Stands</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>ST00</td>
			<td>ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0744-250g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7382</td>
			<td>Rif</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotovap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sand, 50-70 mesh particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>274739-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC241660010</td>
			<td>silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5271-3</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SS266-1</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>501368607</td>
			<td>Spec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squibb Separatory Funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-1060-006</td>
			<td>Separatory funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine Mix #1</td>
			<td>Sungro Horticulture</td>
			<td></td>
			<td>Potting soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>21-402-902</td>
			<td>microtube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triangle funnel</td>
			<td>CTechGlass</td>
			<td>FN-0035</td>
			<td>funnel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP14212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td>GC vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>visible spectrophotometer, V-1200</td>
			<td>VWR</td>
			<td>634-6000P</td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-C18</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-202</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>990967-905</td>
			<td>HPLC column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a customizable approach for the enzymatic production and purification of diterpenoid natural products

Diterpenoidler, yaşam krallıkları arasında yaygın olarak dağıtılan ve gelişimsüreçlerinde, organizmalar arası etkileşimlerde ve çevresel adaptasyonda kritik biyolojik işlevlere sahip olan çeşitli küçük moleküllü doğal ürünler sınıfı oluştururlar. Bu çeşitli biyoaktiviteler nedeniyle, birçok diterpenoidler de ilaç, gıda katkı maddeleri, biyoyakıt ve diğer biyoürünler gibi ekonomik öneme sahiptir. Gelişmiş genomik ve biyokimyasal yaklaşımlar diterpenoid-metabolik genler, enzimler ve yollar bilgisinde hızlı bir artış sağlamıştır. Ancak, diterpenoidlerin yapısal karmaşıklığı ve tek tek bileşiklerin dar taksonomik dağılımı genellikle sadece tek bir tür verimli üretim için kısıtlayıcı faktörler olmaya devam etmektedir. Metabolik enzimlerin daha geniş bir yelpazede durumu şimdi yeterli titre ve saflık taditerpenoidler üretmek için bu önemli metabolit grubunun daha derin bir araştırma kolaylaştırmak için kaynak sağlar. Mikrobiyal ve bitki bazlı enzim ko-ekspresyonu için yerleşik araçlardan yararlanılarak, Escherichia coli veya Nicotiana benthamiana'daditerpenoidlerin enzimatik üretimi için kolay işletilen ve özelleştirilebilir bir protokol salıyoruz ve silika kromatografisi ve yarı preparatif HPLC ile istenilen ürünlerin saflaştırılması. Örnek olarak mısır(Zea mays)dolabralexin diterpenoids grubunu kullanarak, farklı diterpenoid iskeleler oluşturmak için diterpen synthase (diTPS) ve sitokrom P450 monooksijenaz (P450) enzimlerinin modüler kombinasyonlarının nasıl kullanılabileceğini vurguluyoruz. Saflaştırılmış bileşikler, metabolit yapısal analizleri, enzim yapısı-fonksiyon çalışmaları, in vitro ve planta biyoaktivite deneyleri gibi çeşitli downstream uygulamalarında kullanılabilir.

E. coli kullanarak diterpenoid üretimi için şematik iş akışı Şekil 1, diterpenoid üretimi için açıklanan iş akışını göstermektedir. Burada özetlenen protokol, daha büyük hacimli kültürlerin kullanımı ve istenilen diterpenoid ürünlerin silika yoluyla saflaştırılması için daha önce tanımlanmış bir E. coli platformundan uyarlanmıştır13,32 Kromatografi. Bu protokolün kullanımını göstermek için, mısırdan yeni tanımlanmış ve iki diTPS'den oluşan bir dolabralexin yolu kullandık. ZmAN2 (Zm00001d029648) ve ZmKSL4 (Zm0001d032858), çok fonksiyonlu bir P450 (CYP71Z18, Zm00001d014134) ve sitokrom P450 redüktaz (ZmCPR2, Zm00001d026483) (Şekil 2). Kısacası, E. coli BL21DE3-C41 yetkili hücreler pCDFDuet:IRS ve pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 plazmidler13,32ile önceden dönüştürülmüştür. PCDFDuet:IRS plazmid diterpenoid öncül üretimi için anahtar enzimler içerir, dahil olmak üzere 1-deoksi-D-ksilüloz-5-fosfat synthase (dxs), 1-deoksi-D-xylulose-5-fosfat redüktaz (dxr), ve isopentenil difosfat isomerase (idi), ve E. coliditerpenoid oluşumunu artırmak için gösterilmiştir13. PACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 plazmid mısır ent-copalyl difosfat synthase ZmAN2 ve Abies grandisbir GGPP synthase içerir. Dolabralexin biyosentezinde işlenen reaksiyonları katalize eden enzimler daha sonra plazmidp28b:ZmKSL4 ve pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z1Z18 olarak birlikte dönüştürüldü. Diziler ve plazmid yapıları hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.
Çıkarılan enzim ürünlerinin GC-MS kromatogramı Şekil 3A'dagösterilmiştir, üç dolabralexin bileşiğinin oluşumunu gösteren, yani dolabradiene (1.2 ± 0.25 mg/L kültür), epoksidolabrene (0.65 ± 0.2 mg/L kültür) ve epoksidolabranol (11.4 ± 1.1 mg/L kültür) diterpenoid sclareol kullanılarak standart bir eğriye göre ölçülür. Sclareol, dolabralexinlere göre benzer yapısı ve kimyasal özellikleri nedeniyle referans standart olarak kullanılmıştır. Tipik olarak gözlenen küçük yan ürünler kloramfenikol, indole türevleri oksindole ve indole-5-aldehit ve öncüger geranylgeranyl difosfat (GGPP)(Şekil 3)içerir. Indole genellikle birincil yan ürünü temsil eder, ancak GC-MS cihazının bütünlüğünü korumak için belirlenen çözücü gecikmesi 7 dk'dan daha kısa tutma süresi nedeniyle burada gösterilmez.
N. benthamiana kullanarak diterpenoid üretimin şematik iş akışı Şekil 4 N. benthamianadolabralexin yolu ifadesinin bir bakış gösteriş . Burada açıklanan ürünler için, aşağıdaki yapılar ayrı ayrı A. tumefaciens zorlanma GV3101 dönüştürüldü: pLife33:p19 (p19 gen susturucu bastırıcı protein ifade), pLife33:ZmCYP71Z18, pLife33:ZmAN2, pLife33:ZmKSL4. E. coli ve A. tumefaciens'te kanamisin direnci ile ikili T-DNA vektörp Life3341'de mısır dolabralexin yolgenlerinin tam uzunlukta yerli dizileri kullanıldı. Öncül geranylgeranyl difosfat endojen N. benthamiana oluşur beri upstream terpenoid yol genlerinin co-ekspresyonu isteğe bağlıdır. Ancak, çeşitli çalışmalar başarıyla N. benthamiana14 diterpenoid oluşumunu artırmak için bu tür yaklaşımlar istihdam var14,36,41. Şekil 3'tegösterildiği gibi, ortak ifade dolabradiene ve 15,16-epoksidolabrene başarıyla üretilir. E. colienzim ko-ekspresyonunun aksine, metabolit ekstrelerinde 15,16-epoksidolabranol saptanmadı.
Yaprak ekstrelerinde 15,16-epoksidolabrene varlığı N. benthamianaCYP71Z18 aktivitesini gösterdi. 15,16-epoksidolabranol mikrobiyal kültürlerden çıkarma sonra istikrarlı olduğu gösterilmiştir(Şekil 3) yanı sıra önceki çalışmalarda mısır kökü dokularından izolasyon sonra39, hidroksilileli ürün glikozile olduğu makul görünür endojen glikoziltransferazlar tarafından ve daha sonra vakuol de tecrit, ekstraksiyon için burada kullanılan organik çözücü karışımları ile ekstraksiyon için erişilemez hale36,43,44,45 ,46. N. benthamiana yol mühendisliği bağlamında benzer istenmeyen ürün modifikasyonları önceki çalışmalarda bildirilmiştir47. E. coli'deortak ifade için gösterildiği gibi, N. benthamiana'da geçici ifade, referans kütle spektrum veritabanlarıile karşılaştırıldığında farklı zincir uzunluğundaki lineer alkanlar da dahil olmak üzere çeşitli yan ürünlerin çıkarılmasıyla sonuçlanır. Yaprak materyalinden elde edilen bileşik titrelerin ortalama 2.4 +/- 0.5 mg dolabradiene ve 0.9 +/- 0.3 mg 15.16-epoksidolabrene g kuru yaprak dokusu başına olduğu saptandı. Bu titreler, farklı deneysel kurulumlar göz önüne alındığında doğrudan E. coli ko-ekspresyon sistemi ile karşılaştırılamaz.
Diterpenoid arıtma Diterpenoid arıtma silika kolon kromatografisi ve sonraki yarı preparatif HPLC kullanılarak sağlandı. Havuzlu E. coli kültürlerinin 12 L'sinden metabolit özleri, üç fokal dolabralexin bileşiğinin ayrılması için silika kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır (Şekil 3A). Silika kromatografisi hedef bileşiklerin yüksek saflıkta elde etmek için idealdir, diterpen etekfinler ve oksijenli türevlerin basit ayrılmasını sağlar beri, ve kolayca büyük kirletici kaldırır, oksindole, hangi silika matris üzerinde tutulur ( Şekil 3A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg"> Şekil 1: E. coli'de diterpenoid üretimi için iş akışı ve sıvı bakteri kültürlerinden metabolit saflaştırma. Kesik kutular, ek arınma gerektiren isteğe bağlı adımları betimlemektedir. (A) Ayrıştırıcı bir huni kullanarak çıkarılan E. coli kültürünün temsili görüntüsü. (B) Silika kromatografisi kullanılarak metabolit ekstresinin saflaştırılmasının temsili görüntüsü.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg"> Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan dolabralexin biyosentetik yol ve gen yapıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg"> Şekil 3: GC-MS sonuçları. Gösterilen (A) E. coli ve (B) N. benthamianaenzim ko-ekspresyon tahlilleri kullanılarak elde edilen saflaştırılmış diterpenoid ürünlerin temsili GC-MS kromatogramlar vardır . Ürün tanımlamaları, Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü (NIST) kütle spektral kütüphanesinin otantik standartları ve referans kütle spektrumları ile karşılaştırmalara dayanmaktadır. 1, öküzdole; 2, indole-5-aldehit; 3, Pyrrolo[1,2-a]pirrazin-1,4-dione, heksahidro-3-(2-metilpropil)-; 4, 6-O-Asetil-1-[[4-bromofenil]tio]-a-d-glucoside S,S-dioksit; 5, dolabradiene; 6, 15,16-epoksidolabrene; 7, Pyrrolo[1,2-a]pirrazin-1,4-dione, heksahidro-3-(fenilmetil)-; 8, 15,16-epoksidolabranol; 9 ve 12, bilinmiyor; 10, kloramfenikol; 11, 3,7,11,15-tetrametil-2-heksadecen-1-ol; 13-16, alkanlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg"> Şekil 4: N. benthamiana'da diterpenoid üretimi. (A) N. benthamiana'da diterpenoid üretiminin iş akışı ve yaprak materyalinden metabolit saflaştırma.( B) N. benthamiana bitkilerinin budama dan önce sızma deneylerini yapmaya hazır temsili görüntüsü. (C) Budama sonrası N. benthamiana bitkilerinin temsili görüntüleri. (D) Şırıngasız yaprakların görüntüsü. Daha karanlık bölgelere sızıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products at JoVE.com

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Bu protokol, farklı downstream analizi için kullanılabilecek saflaştırılmış diterpenoidler üretmek için uygundur ve farklı metabolit hedefleri bir dizi için özelleştirilebilir. Bu yöntemin ana avantajı özel metabolitleri miligram miktarlarda üretmek için basit ve ucuz bir yöntemdir. Co-ekspresyon için kullanılan gen ler ve enzimler değiş tokuş ederek, bu yöntem monoterpenoidler ve sesquiterpenoidler de dahil olmak üzere diğer terpenoidler üretmek için değiştirilebilir, flavonoidler gibi diğer metabolit sınıfları.Diterpenoid metabolik üretim ve dönüşüm için, kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerinin buz üzerinde ısınma ile başlar. Kültür çözüldüğünde, soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikrotüp için yapı başına 25 mikrolitre yetkin hücre ekleyin ve birlikte ifade için kullanılan her yapının mikrolitre çözeltisi başına 100 nanogram 1mikrolitre ekleyin. Bir mikrotüp raf boyunca tüpler kazıyarak nazik karıştırma ile 30 dakika buz üzerinde karışımları kuluçka.Kuluçka sonunda, ısı en az iki dakika daha buz geri yerleştirerek önce bir dakika için 42 santigrat derece hücre karışımları şok. Daha sonra, tüplere 37 santigrat derece SOC orta 200 mikrolitre ekleyin. Ve kültürleri 37 derece ve dakikada 200 dönüşle bir saat kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, yaklaşık 10 otoklaved cam boncuk ve 100 mikrolitre hücre ekleyin bir 37 santigrat derece uygun antibiyotikler ile lysogeny suyu agar plaka ısıtılır. Ve hücreleri eşit dağıtmak için yerine kapak ile yatay olarak plaka sallayın. Daha sonra, yavaşça bir atık konteyner içine cam boncuk dokunun ve bir gecede 37 derece santigrat plaka kuluçka, kaplamalı yüzey tarafı aşağı.Ertesi gün, tabağı kuvözden çıkarın. Planlanan 1 litrelik kültür başına plastik bir nefes kap ile bir 15 mililitre steril cam tüp uygun antibiyotikler ile taze hazırlanmış lysogeny suyu orta 5 mililitre ekleyin ve agar plaka bireysel dönüştürülmüş E.Coli kolonileri almak için bir pipet ucu kullanın. Hazırlanan 15 mililitrelik tüplerin her birine bir koloni ekleyin ve her tüpü eşlik eden nefes alabilen plastik kapakla kaplayın.Sonra, 12 ila 24 saat boyunca kuvöz sallayarak 37 derece santigrat kapaklı E.coli küçük kültürler yerleştirin. Ertesi gün uygun antibiyotikler ile küçük kültür başına 1 litrelik şişe de müthiş suyu 900 mililitre 10x PBS 100 mililitre ekleyin. Ve şişeleri 37 santigrat derecede ve dakikada 140 dönüşte yaklaşık 30 dakika yerleştirin.Müthiş suyu sıcak olduğunda, kültür başına bir 1 litrelik kültür şişesi için her aşılama kültürünün tüm 5 mililitre hacmi ekleyin. Ve yaklaşık 3 saat boyunca dakikada 140 rotasyonlar sallayarak inkübatör de şişeleri yerleştirin. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6'ya ulaştığında, kuvöz sıcaklığını 16 dereceye düşürün.Kuvöz soğuduktan sonra, her kültüre 1 mililitre azı iptg, 1 mililitre taze hazırlanmış 4 litre riboflavin ve 1 mililitre taze hazırlanmış 150 gram litre aminolevulinik asit ekleyin. Diterpenoid üretimi için, yeterli bir öncül oluşumunu sağlamak için her kültüre bir azı dişi sodyum pirüuvat 25 mililitre ekleyin. Daha sonra kültürleri 72 saat boyunca dakikada 16 derece ve 140 dönüşle kuluçkaya yatırın ve uygun kültürlere günlük 25 mililitre sodyum pirüvat ekler.Metabolit ayırma ve arınma için, duman kaputundaki bir halka standına ayırıcı bir huniyi sabitlayın. Ve huninin altına bir atık kabı yerleştirin. 500 mililitre etil asetat ve heksanların 50/50 çözeltisini ayırın.Ve dönüştürülmüş E.coli ortak ifade kültürünü huniye 500 mililitre ekleyin. Cam durdurucuyu huniye yerleştirin ve huniyi çıkarma çözücüsüyle karıştırmak için huniyi 5 ila 10 kez sallayın, huni baş aşağı yken sık sık musluğu açarak ve huniyi gazdan arındırmak için duman kaputuna doğru çevirin. Sallayarak ve gaz giderme ikinci bir tur sonra sadece gösterildiği gibi, yaklaşık bir dakika boyunca halka standında huni dik yerleştirin.Üst çözücü tabakası sulu kültür tabakasından ayrıldığında, durdurucu çıkarın ve e.coli tabakasını bir atık kabına boşaltın, huni içindeki çözücü tabakasını koruyun. Daha sonra, ayıklanmış metabolitleri içeren çözücünün temiz bir şişeye boşaltılmadan önce, ilk ekstraksiyon için kullanılan aynı 500 mililitre çözücükullanılarak kültürün kalan 500 mililitresini kullanarak ekstraksiyonu tekrarlayın. Burada tipik çıkarılan enzim ürünlerinin temsili gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kromatrometrisi kromatografisi gösterilmiştir.Yaygın olarak gözlenen küçük yan ürünler kloramfenikol ve indole türevleri oksindole ve indole pivalaldehit içerir. Silika kolon kromatografisi ile diterpenoid saflaştırma sonra, üç dolabralexin bileşikleri elde edilebilir, diterpenoid sclareol kullanarak standart bir eğri dayalı olarak ölçülür. Silika kromatografisi hedef bileşiklerin yüksek saflıkta elde etmek için idealdir.Diterpen etekfinlerin ve oksijenli türevlerin basit hazırlanmasını sağladığından ve silika matrisinde tutulan büyük kontamine öküzdole'u kolayca ortadan kaldırır. Ayrıca, terpenoid yol genlerinin co-ekspresyonu N.Benthamiana diterpenoids üretmek için kullanılabilir, dolabradiene üretimi ile sonuçlanan ve 15, 16 epoksidolabrene. Ekstraksiyon sırasında kullanılan çözücüler, ilgi çeken metabolitlerin fiziksel kimyasal özellikleri için optimize edilmeli ve iki farklı katmanı korumak için su ile karıştırılmamalıdır.Bu prosedürü takiben, saflaştırılmış metabolitler, yapısal analiz ve antibiyotik asitler de dahil olmak üzere downstream analizi için kullanılabilir. Bu teknik, burada gösterilenler de dahil olmak üzere yeni diterpenoidlerin keşfini sağlayarak bu metabolitlerin kimyasal yapıları ve yeni biactivies için analiz edilmesine olanak sağladı. Ayırıcı bir hunide organik çözücüler kullanırken önlem alın.Biyolojik atıkları her zaman laboratuvar güvenlik standartlarınıza göre bertaraf edin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...