Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من برنامج البحوث (NRF- 2015M3A9E7029172) من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي.

1. التمهيدي استراتيجية التصميم
<ol><li>تصميم مواد أولية لإدخال الجينات ذات الأهمية في pBiT1.1-C [TK/LgBiT]، pBiT2.1-C [TK/SmBiT]، pBiT1.1-N [TK/LgBiT] وpBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.</li>
	<li>حدد واحدًا على الأقل من هذه المواقع الثلاثة كواحد من اثنين من إنزيمات التقييد الفريدة اللازمة للاستنساخ الاتجاهي نظرًا لوجود codon توقف في الإطار ي...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

باستخدام الطريقة المعروضة هنا، يمكن رصد التفاعلات بين أي GPCR وβ-arrestin1/2 في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي باستخدام هذا الفحص المكمّل الهيكلي GPCR-β-arrestin. في هذا الصدد، تمكنا من مراقبة التفاضلة β-arrestin التجنيد بين isoforms بيتا-arrestin اثنين من قبل GLP-1r (A prototypical فئة B GPCR)، لاحظنا أيضا تفكك مستقبلات بيتا-ar...

تمثل GPCRs الهدف من ما يقرب من 35٪ من الأدوية الحالية في السوق1،2 وفهم واضح للأدوية لها أمر بالغ الأهمية في تطوير الأدوية العلاجية الجديدة3. واحدة من الجوانب الرئيسية في اكتشاف المخدرات GPCR، لا سيما خلال تطوير الناهضات المتحيزة هو توصيف ligands جديدة نحو مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات4 وبيتا-arrestin التفاعلات مع البروتينات الربابية الأخرى مثل كما clathrin5.
وقد تم توثيق أن إشارات تعتمد على β-arrestin يلعب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية مثل اضطراب ثنائي القطب, الاكتئاب الكبير, والفصام6 وأيضا الآثار الجانبية الشديدة في بعض الأدوية مثل المورفين7.
الأساليب الحالية المستخدمة لرصد هذه التفاعلات عادة لا تمثل المستويات الذاتية الفعلية للبروتينات في الدراسة، في بعض الحالات أنها تظهر إشارة ضعيفة، وتبييض الصور واعتمادا على GPCR قد يكون من الصعب من الناحية الفنية لإعداد8. هذا الفحص التكامل الهيكلي الجديد يستخدم ناقلات المروج التعبير المنخفض من أجل تقليد المستويات الفسيولوجية الذاتية ويوفر حساسية عالية بالمقارنة مع الأساليب الحالية9. باستخدام هذا النهج، كان من الممكن بسهولة توصيف مستقبلات Galanin-β-arrestin € وأيضا β-arrestin2-clathrin التفاعلات10. ويمكن استخدام هذه المنهجية على نطاق واسع إلى أي GPCR ذات أهمية خاصة حيث β-arrestins تلعب وظيفة فسيولوجية رئيسية أو إشاراتها ذات الصلة في بعض الأمراض.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

التفاعلات بين مستقبلات G-البروتين المقترنة (GPCRs) وβ-arrestins هي عمليات حيوية مع الآثار الفسيولوجية ذات أهمية كبيرة. حاليا، فإن توصيف الأدوية الجديدة نحو تفاعلاتها مع β-arrestins وغيرها من البروتينات السيتوسية هو قيمة للغاية في مجال اكتشاف المخدرات GPCR لا سيما خلال دراسة الآلام المتحيزة GPCR. هنا، نعرض تطبيق تحليل استكمال الهيكلية رواية لرصد بدقة مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. هذه الطريقة بسيطة ودقيقة ويمكن أن تمتد بسهولة إلى أي GPCR ذات أهمية، وأيضا لديها ميزة أنه يتغلب على التفاعلات غير محددة بسبب وجود المروج التعبير منخفضة موجودة في كل نظام ناقلات. يوفر هذا التحليل التكامل الهيكلي السمات الرئيسية التي تسمح برصد دقيق ودقيق للتفاعلات مستقبلات بيتا-arrestin، مما يجعلها مناسبة في دراسة الآلام المتحيزة من أي نظام GPCR، فضلا عن GPCR c-terminus 'الفسفورية رموز ' مكتوبة من قبل مختلف GPCR-kinases (GRKs) والتعديلات ما بعد الترجمة من arrestins التي استقرار أو زعزعة استقرار مجمع مستقبلات بيتا-arrestin.

باستخدام الإجراء المعروض هنا، تم رصد التفاعلات بين GPCR نموذجي واثنين من isoforms β-arrestin. تم إجراء الجلوكاجون مثل مستقبلات الببتيد (GLP-1r) المنشآت باستخدام التمهيديات التي تحتوي على مواقع تقييد إنزيم NheI وEcoRI واستنساخها في ناقلات pBiT1.1-C [TK/LgBiT] و pBiT2.1-C [TK/SmBiT] بينما في حالة بيتا-arrestins، كان اثنان من ناقلا...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

التفاعلات GPCR-β-arrestin هي حقل الناشئة في اكتشاف المخدرات GPCR. ومن الضروري وضع أساليب دقيقة ودقيقة وسهلة الإعداد لرصد هذه التفاعلات في النظم الحية. نعرض فحص اكمبية هيكلية لمراقبة تفاعلات GPCR-β-arrestin في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي، ويمكن توسيعه إلى أي GPCR.

رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

هذا البروتوكول له تأثير كبير في مجال اكتشاف المخدرات والتنمية، وخاصة في تطوير الأدوية الجديدة، الأولى في الدرجة الأولى مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على أي نظام GPCR ، واستخدامها للحصول على معلومات دقيقة حول علم الصيدلة المستقبلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. الآثار المترتبة على هذه التقنية ترتبط ارتباطا وثيقا العلاجات الجديدة وخاصة عندما بيتا arrestins ذات الصلة.وتشمل هذه مستقبلات opiod في الألم ومستقبلات الدوبامين في الفصام. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في العديد من مجالات البحث العلمي الطبي من علم الأعصاب إلى أمراض القلب والرمون. PCR مظاهرة من طريقتنا مهم، لأنه يسمح لتقديم عرض مفصل للخطوات الحاسمة في البروتوكول، والتي لن تكون ممكنة مع النشر التقليدي.تبدأ بتصميم التمهيدي لإدخال الجينات التي تهم ناقلات pBiT. نظرا لوقف codon inframe يقسم موقع الاستنساخ المتعدد ، حدد واحدا على الأقل من ثلاثة مواقع باعتبارها واحدة من اثنين من الإنزيمات تقييد فريدة من نوعها اللازمة للاستنساخ الاتجاهي. راجع المخطوطة للحصول على تسلسلات النيوكليوتيدات لترميز بقايا الرابط ودمجها في ال التمهيديات.لpBiT1.1-C وpBiT2.1-C تأكد من أن التمهيدي إلى الأمام يحتوي على كودون ATG وتسلسل إجماع كوزاك قوية. لpBiT1.1-N وpBiT2.1-N تأكد من أن التمهيدي العكسي يحتوي على كودون وقف. استخدام التمهيديات المصممة لتضخيم الحمض النووي إدراج جين الفائدة.الجمع بين الكواشف PCR وفقا لتوجيهات المخطوطات، مع التأكد من استخدام البوليميراز DNA عالية الدقة لتقليل الطفرات. برنامج الحرارية والبدء في رد الفعل. بعد الانتهاء من PCR، هضم المنتج في رد فعل الهضم 50 ميكرولتر.في أنبوب 1.5 ملليلتر، والجمع بين 12 ميكرولترات من الماء المقطر، وخمسة ميكرولترات من المناسبة 10X تقييد الهضم العازلة، و 30 ميكرولترات من المنتج PCR. ثم إضافة 1.5 ميكرولترات من كل إنزيم تقييد. دوامة التفاعل خليط.واحتضان بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية. إعداد رد فعل الثاني لهضم بلازميد المتلقي. في أنبوب 1.5 ملليلتر، والجمع بين 23 ميكرولترات من الماء، وخمسة microliters من المناسبة 10X تقييد الهضم العازلة، 15 ميكرولترات من البلازميد المتلقي، و 1.5 ميكرولترات من كل إنزيم تقييد.مزيج لفترة وجيزة الأنبوب. واحتضان بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية. في اليوم التالي للاستنساخ والتحول، اختر ثلاثة إلى 10 مستعمرات بكتيرية فردية ونقلها إلى ملليلتر واحد من متوسطة LB مع الأمبيسيلين.احتضان الخلايا لمدة ست ساعات. ثم نقل 200 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى خمسة ملليلتر من متوسطة LB الطازجة مع الأمبيسيلين. احتضان الثقافة في 37.5 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، عزل البلازميد مع مجموعة مصغرة الإعدادية تنقية الحمض النووي. شاشة البلازميد المنقى لنجاح الربط مع PCR. قبل يوم واحد من عملية الانتقال، بذور الخلايا على بولي-L-ليسين المغلفة 96-جيدا لوحة باستخدام متوسطة النسر Dulbecco المعدلة تكملها مع مصل الأبقار الجنين 10٪، 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين G، و 100 ميكرولتر لكل ملليلتر من بكتيرياtomycin.فقط إضافة الخلايا إلى 60 الآبار الداخلية لتقليل احتمالية التدرج الحراري عبر لوحة وحافة الآثار من التبخر. أضف 200 ميكرولترات من المياه المقطرة المعقمة إلى الآبار الخارجية الـ 36، و150 ميكرولترات في المساحات بين الآبار. ثم احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في اليوم التالي، قم بإجراء عملية نقل باستخدام ما مجموعه 100 نانوجرام الحمض النووي. قم بإعداد أربعة مجموعات مختلفة من البلازميد وفقًا لتوجهات المخطوطات. باستخدام 20 ميكرولترات من تعديل النسر وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المخزن مع HEPES، و 0.3 ميكرولترات من كاشف الدهون transfection في البئر.إضافة 20 ميكرولترات من مُكشف نقل الدهون وخليط الحمض النووي لكل بئر، وخلط الطبق في دوائر لمدة 10 ثوانٍ. احتضان لوحة في 37.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. تحديث الوسيطة.واحتضان لمدة 24 ساعة أخرى. بعد الحضانة ، وpirate المتوسطة وإضافة 100 microliters من تعديل النسر وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المخزنة مع HEPES إلى كل بئر. السماح للطبق لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.وفي الوقت نفسه، إعداد الركيزة furimazine من خلال الجمع بين حجم واحد من الركيزة 100X مع 19 مجلدات من LCS تخفيف العازلة، وخلق مخزون 5X لخلط مع خلية ثقافة المتوسطة. عندما تكون الخلايا جاهزة، أضف 25 ميكرولترات من المخزون إلى كل بئر، واخلط الطبق بلطف لمدة 10 ثوانٍ. ثم قياس الإنارة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الإشارة.لتجارب مع إضافة ligand، وإعداد حل 13.5X ligand في وسائل الإعلام الأساسية المعدلة النسر المخزنة مع HEPES، وإضافة 10 ميكرولترس في البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم اخلطي الطبق باليد أو مع شاكر مداري. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لدراسة التفاعلات بين GPCR النماذجية واثنين من بيتا arrestin isoforms.تم فحص أربعة تركيبات مختلفة من البلازميد، وتم اختيار واحدة مع أعلى إشارة مضيئة لإجراء المزيد من التجارب. تم تحديد قيم EC50 لكل شكل من أشكال الإيزوفورمات الإزداحية من بيتا،باستخدام منحنيات استجابة الجرعة، والتي تم الحصول عليها من الاستجابة القصوى لكل تركيز من الدراسات الحركية. من المهم للغاية أن تولي اهتمامًا خاصًا عند تصميم الـ PCR التمهيدية.تطوير الثوابت الصحيحة أمر ضروري لنجاح هذه المقايسات. بعد هذه المنهجية، سوف تكون قادرة على رصد مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات، فضلا عن التفاعلات مستقبلات مع البروتينات السيتوسوليك الأخرى. ستساعد هذه المنهجية على الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجال علم الصيدلة GPCR من خلال دراسة كيفية يمكن تعديل تفاعلات GPCR-beta-arrestin عن طريق تعديلات في بنية الرباط.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

تمكين التعويض في الوقت الحقيقي في الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات لتحديد التغيرات في تضاريس البروتين

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...