Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) fra det nationale forskningsinstitut i Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidig planlægning.

1. strategi for primer-design
<ol><li>Design primere til at introducere gener af interesse i pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer.</li>
	<li>Vælg mindst en af disse tre steder som en af de to unikke restriktionsenzymer, der er nødvendige for retningsbestemt kloning på grund af tilstedeværelsen af et in-frame stop codon, der opdeler det multicloning site som vist i figur 111.</li>
	<li>Inkorporer nu...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, kan interaktioner mellem GPCR og β-arrestin1/2 overvåges i realtids levende systemer ved hjælp af denne GPCR-β-arrestin strukturel komplementerings analyse. I denne henseende var vi i stand til at observere differentialet β-arrestin rekruttering mellem de to β-arrestin isoformer af GLP-1r (en prototypiske klasse B GPCR), vi også observeret en dissociation af receptor-β-arrestin kompleks et par minutter efter at have nået den maksimale lysende signal.
<p class="...

Gpcrs repræsenterer målet på næsten 35% af de nuværende stoffer på markedet1,2 og en klar forståelse af deres farmakologi er afgørende i udviklingen af nye terapeutiske stoffer3. Et af de vigtigste aspekter i GPCR Drug Discovery, især under udviklingen af partiske agonister er karakteriseringen af nye ligander mod receptor-β-arrestin interaktioner4 og β-arrestin interaktioner med andre cytosolisk proteiner såsom som clathrin5.
Det er blevet dokumenteret, at β-arrestin afhængig signalering spiller en central rolle i neurologiske lidelser såsom bipolar lidelse, svær depression, og skizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i nogle medikamenter såsom morfin7.
Nuværende metoder, der anvendes til at overvåge disse interaktioner normalt ikke repræsenterer faktiske endogene niveauer af proteiner i studiet, i nogle tilfælde viser de svage signal, foto blegning og afhængigt af GPCR det kan være teknisk udfordrende at oprette8. Denne nye strukturelle komplementation analyse bruger lav ekspression promotorer vektorer for at efterligne endogene fysiologiske niveauer og giver høj følsomhed i forhold til de nuværende metoder9. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, det var muligt at nemt karakterisere Galanin receptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaktioner10. Denne metode kan anvendes bredt til enhver GPCR af særlig interesse, hvor β-arrestins spiller en vigtig fysiologisk funktion, eller deres signalering er relevant i nogle sygdomme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Interaktioner mellem G-protein koblede receptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale processer med fysiologiske konsekvenser af stor betydning. I øjeblikket, karakterisering af nye lægemidler mod deres interaktion med β-arrestins og andre cytosolisk proteiner er yderst værdifuld inden for GPCR Drug Discovery især under studiet af GPCR partisk agonisme. Her viser vi anvendelsen af en ny strukturel komplementation assay til præcist at overvåge receptor-β-arrestin interaktioner i realtid levende systemer. Denne metode er enkel, præcis og kan nemt udvides til enhver GPCR af interesse, og det har også den fordel, at det overvinder uspecifikke interaktioner på grund af tilstedeværelsen af en lav ekspressions promotor til stede i hvert vektorsystem. Denne strukturelle komplementerings analyse giver nøglefunktioner, der muliggør en nøjagtig og præcis monitorering af receptor-β-arrestin-interaktioner, hvilket gør den velegnet i studiet af partisk agonisme af ethvert GPCR-system samt GPCR c-Terminus ' fosforylering koder ' skrevet af forskellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translationelle modifikationer af arrestins, der stabiliserer eller destabiliserer receptor-β-arrestin-komplekset.

Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, blev interaktioner mellem en prototypiske GPCR og to β-arrestin isoformer overvåget. Glucagon som peptidreceptor (GLP-1r) konstruktioner blev fremstillet ved hjælp af primere indeholdende NheI og EcoRI enzym restriktionssteder og klonet i vektorer pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], mens der i tilfælde af β-arrestins blev to yderligere vektorer brugte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] ved brug af enzym begrænsnings lokaliteter BgIII og EcoR...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-arrestin interaktioner er et spirende felt i GPCR Drug Discovery. Nøjagtige, præcise og nemme at opsætte metoder er nødvendige for at overvåge sådanne interaktioner i levende systemer. Vi viser en strukturel komplementation assay til at overvåge GPCR-β-arrestin interaktioner i realtid levende celler, og det kan udvides til enhver GPCR.

Overvågning af GPCR-β-arrestin1/2 interaktioner i realtid levende systemer til at fremskynde Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Denne protokol har en stor indvirkning på området for opdagelse og udvikling af lægemidler, især i udviklingen af nye, førsteklasses lægemidler med minimale bivirkninger. Den største fordel ved denne teknik er, at det kan anvendes på ethvert GPCR-system, og bruges til at opnå nøjagtige oplysninger om receptor farmakologi i real-time levende systemer. Konsekvenserne af denne teknik er tæt forbundet med nye behandlingsformer, især hvor beta-arrestiner er relevante.Disse omfatter opiod receptorer i smerte og dopamin receptorer i skizofreni. Denne metode kan være nyttig i mange medicinske videnskabelige forskningsområder fra neurologi til kardiopulmonal sygdom. PCR demonstration af vores metode er vigtig, fordi det giver mulighed for en detaljeret præsentation af de kritiske trin i protokollen, hvilket ikke ville være muligt med konventionel offentliggørelse.Begynd med at designe primere for at introducere gener af interesse for pBiT-vektorerne. På grund af inframe stop codon, der deler multi-kloning site, skal du vælge mindst en af de tre steder som en af de to unikke begrænsning enzymer er nødvendige for retningsbestemt kloning. Se manuskriptet for nukleotidsekvenser for at kode linkerresterne og inkorporere dem i primere.For pBiT1.1-C og pBiT2.1-C skal du sørge for, at den fremadrettede primer indeholder en ATG-codon og en potent Kozak konsensussekvens. For pBiT1.1-N og pBiT2.1-N skal du sørge for, at den omvendte primer indeholder en stop codon. Brug de designede primere til at forstærke indsæt DNA af genet af interesse.Kombiner PCR reagenser i henhold til manuskript retninger, og sørg for at bruge en high-fidelity DNA polymerase at minimere mutationer. Programmer termocyren, og start reaktionen. Efter at have afsluttet PCR skal produktet fordøjes i en fordøjelsesreaktion på 50 mikroliter.I et 1,5 milliliterrør skal du kombinere 12 mikroliter destilleret vand, fem mikroliter af den relevante 10X-begrænsningsbuffer og 30 mikroliter af PCR-produktet. Derefter tilsættes 1,5 mikroliter af hver begrænsning enzym. Vortex reaktionen blandingen.Og inkubere natten over på 37,5 grader Celsius. Forbered en anden reaktion til at fordøje modtageren plasmid. I et 1,5 milliliterrør, kombinere 23 mikroliter vand, fem mikroliter af den relevante 10X begrænsning fordøjelse buffer, 15 mikroliter af modtageren plasmid, og 1,5 mikroliter af hver begrænsning enzym.Bland kort røret. Og inkubere natten over på 37,5 grader Celsius. Dagen efter kloning og transformation, vælge tre til 10 individuelle bakterielle kolonier og overføre dem til en milliliter LB medium med ampicillin.Inkuber cellerne i seks timer. Og derefter overføre 200 mikroliter af bakteriel suspension til fem milliliter frisk LB medium med ampicillin. Inkuber kulturen ved 37,5 grader Celsius med rystelser ved 200 omdrejninger natten over.Den næste dag isoleres plasmid med et mini-prep DNA-rensesæt. Screen den rensede plasmid for vellykket ligation med PCR. En dag før transfektion, frø cellerne på en poly-L-lysin belagt 96-brønd plade ved hjælp af Dulbecco's modificerede Eagle's medium suppleret med 10% føtal kvæg serum, 100 enheder pr. milliliter penicillin G, og 100 mikroliter pr. milliliter streptomycin.Tilføj kun celler til de 60 indvendige brønde for at minimere risikoen for termiske stigninger på tværs af pladen og kanteffekter fra fordampning. Tilsæt 200 mikroliter sterilt destilleret vand til de 36 udvendige brønde og 150 mikroliter i rummene mellem brøndene. Derefter inkubere pladen natten over ved 37,5 grader Celsius og 5% kuldioxid.På den næste dag udføres transinfektion ved hjælp af i alt 100 nanogram DNA. Opsæt fire forskellige plasmidkombinationer i henhold til manuskriptretninger. Brug af 20 mikroliter modificeret Eagle's minimum væsentlige medier buffered med HEPES, og 0,3 mikroliter lipidic transfection reagens per brønd.Tilsæt 20 mikroliter lipidic transfektion reagens og DNA-blanding til hver brønd, og bland pladen i cirkler i 10 sekunder. Inkuber pladen ved 37,5 grader Celsius og 5% kuldioxid i seks timer. Opdater mediet.Og inkubere i yderligere 24 timer. Efter inkubationen, aspirere mediet og tilføje 100 mikroliter af modificerede Eagle's minimum væsentlige medier buffered med HEPES til hver brønd. Lad pladen stabilisere sig ved stuetemperatur i 10 minutter.I mellemtiden forberede furimazine substrat ved at kombinere en volumen af 100X substrat med 19 mængder af LCS fortynding buffer, hvilket skaber en 5X bestand til at blande med cellekultur medium. Når cellerne er klar, tilsættes 25 mikroliter af bestanden til hver brønd, og bland forsigtigt pladen i 10 sekunder. Mål derefter luminescensen i 10 minutter ved stuetemperatur for signalstabilisering.Til eksperimenter med ligandtilsætning skal du forberede 13,5 X ligand-løsningen i modificeret Eagle's minimum væsentlige mediebuffer med HEPES og tilføje 10 mikroliter pr. brønd ved hjælp af en multikanalpipette. Bland derefter pladen i hånden eller med en orbital shaker. Denne protokol er med succes blevet brugt til at studere interaktioner mellem en prototypisk GPCR og to beta-arrestin isoformer.Fire forskellige plasmid kombinationer blev screenet, og den ene med den højeste selvlysende signal blev udvalgt til yderligere eksperimenter. EC50-værdierne for hver beta-arrestinisoform blev bestemt ved hjælp af dosisresponskurver, som blev opnået ved den maksimale respons af hver koncentration fra kinetiske undersøgelser. Det er vigtigt at være særlig opmærksom, når du designer PCR-primere.Udviklingen af de rigtige konstruktioner er afgørende for disse analysers succes. Efter denne metode, vil du være i stand til at overvåge receptor-beta-arrestin interaktioner, samt receptor interaktioner med andre cykliske proteiner. Denne metode vil bidrage til at besvare grundlæggende spørgsmål inden for GPCR farmakologi ved at undersøge, hvordan GPCR-beta-arrestin interaktioner kan moduleres ved ændringer i ligand struktur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Forberedelse og<em&gt; In vivo</em&gt; Anvendelse af en aktivitetsbaseret Probe til<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid-amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering af klædt guld Microelectrodes udstyret til en Real-Time celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time overvågning af DNA streng Exchange reaktion medieret af Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Aktivering af real-time kompensation i hurtige fotokemiske oxidationer af proteiner til bestemmelse af Protein Topografi Ændringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...