Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van het onderzoeksprogramma (NRF-2015M3A9E7029172) van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen, ICT en toekomstige planning.

1. ontwerp strategie voor primer
<ol><li>Ontwerp primers om genen van belang te introduceren in pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vectoren.</li>
	<li>Selecteer ten minste één van deze drie locaties als een van de twee unieke beperkings enzymen die nodig zijn voor richtings klonen vanwege de aanwezigheid van een in-frame stop codon die de multicloning-site verdeelt zoals weergegeven in Figuur 111.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen interacties tussen GPCR en β-arrestin1/2 worden bewaakt in real time levende systemen met deze GPCR-β-vanger in structurele complementatie test. In dit verband waren we in staat om de differentiële β-vanger in de rekrutering tussen de twee β--vanger-isovormen te observeren door de GLP-1R (een prototypische klasse B GPCR), we observeerden ook een dissociatie van de receptor-β-vanger in complex enkele minuten na het bereiken van de maximale lichtgevende signaal.</p...

Gpcrs vertegenwoordigen het doel van bijna 35% van de huidige drugs in de markt1,2 en een duidelijk begrip van hun farmacologie is cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen3. Een van de belangrijkste aspecten bij de ontdekking van GPCR-geneesmiddelen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling van partijdige agonisten, is de karakterisering van roman liganden naar receptor-β-dein interacties4 -en β-dein interacties met andere cytosolische eiwitten, zoals Als clathrin5.
Er is gedocumenteerd dat de afhankelijke signalering van β-vanger een belangrijke rol speelt bij neurologische aandoeningen zoals bipolaire stoornis, ernstige depressie en schizofrenie6 en ook ernstige bijwerkingen in sommige medicijnen zoals morfine7.
De huidige methoden die worden gebruikt om deze interacties te bewaken, vertegenwoordigen meestal niet de werkelijke endogene niveaus van de eiwitten in studie, in sommige gevallen vertonen ze een zwak signaal, fotobleaching en afhankelijk van de GPCR kan het technisch lastig zijn om8in te stellen. Deze roman Structural complementatie test maakt gebruik van lage expressie Promoter vectoren om endogene fysiologische niveaus na te bootsen en biedt een hoge gevoeligheid in vergelijking met de huidige methoden9. Met behulp van deze aanpak, was het mogelijk om te karakteriseren Galanin receptor-β-arrestin1/2 en ook β-arrestin2-clathrin interacties10. Deze methodologie kan op grote schaal worden gebruikt voor elke GPCR van bijzonder belang waar β-vanger een belangrijke fysiologische functie speelt of de signalering relevant is bij sommige ziekten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Interacties tussen G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en β-vanger zijn vitale processen met fysiologische implicaties van groot belang. Momenteel is de karakterisering van nieuwe geneesmiddelen naar hun interacties met β-vanger en andere cytosolische eiwitten zeer waardevol op het gebied van GPCR-geneesmiddelen ontdekking, met name tijdens de studie van GPCR-bevooroordeeld agonisme. Hier tonen we de toepassing van een nieuwe structurele complementatie test om nauwkeurig de receptor-β-vanger in interacties in real time levende systemen te bewaken. Deze methode is eenvoudig, nauwkeurig en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar elke GPCR van belang en ook heeft het voordeel dat het overkomt onspecifieke interacties als gevolg van de aanwezigheid van een lage expressie promotor aanwezig zijn in elk vector systeem. Deze structurele complementatie test biedt belangrijke kenmerken die een nauwkeurige en nauwkeurige controle van receptor-β-vanger interacties mogelijk maken, waardoor het geschikt is in de studie van bevooroordeeld agonisme van elk GPCR-systeem en GPCR c-Terminus ' fosforylering codes ' geschreven door verschillende GPCR-kinases (GRKs) en post-translationele modificaties van afvallen die het receptor-β-afradercomplex stabiliseren of destabiliseren.

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werden de interacties tussen een prototypische GPCR en twee β-vanger-isovormen gemonitord. Glucagon zoals Peptide Receptor (GLP-1R) constructies werden gemaakt met behulp van primers met NheI en EcoRI enzym restrictie sites en gekloond in de vectoren pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] terwijl in het geval van β-vanger, twee extra vectoren werden gebruikte pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] en pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] met behulp van enzym beperkings sites BgIII en EcoRI in het...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Dit protocol heeft een hoge impact op het gebied van drugsontdekking en -ontwikkeling, vooral bij de ontwikkeling van nieuwe, eersteklas geneesmiddelen met minimale bijwerkingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast op elk GPCR-systeem, en gebruikt om nauwkeurige informatie over receptor farmacologie te verkrijgen in real-time levende systemen. De implicaties van deze techniek houden nauw verband met nieuwe therapieën, met name wanneer bèta-arrestines relevant zijn.Deze omvatten opiod receptoren in pijn en dopamine receptoren bij schizofrenie. Deze methode kan nuttig zijn in veel medische wetenschappelijke onderzoeksgebieden, van neurologie tot cardiopulmonale ziekte. PCR demonstratie van onze methode is belangrijk, omdat het zorgt voor een gedetailleerde presentatie van de kritische stappen in het protocol, die niet mogelijk zou zijn met conventionele publicatie.Begin met het ontwerpen van primers om genen van belang te introduceren in de pBiT vectoren. Als gevolg van de inframe stop codon die de multi-klonen site verdeelt, selecteert u ten minste een van de drie sites als een van de twee unieke beperking enzymen die nodig zijn voor directionele klonen. Raadpleeg het manuscript voor nucleotidesequenties om de linkerresten te coderen en in de primers op te nemen.Voor de pBiT1.1-C en pBiT2.1-C zorg ervoor dat de voorwaartse primer een ATG codon en een krachtige Kozak consensus sequentie bevat. Voor de pBiT1.1-N en pBiT2.1-N moet u ervoor zorgen dat de omgekeerde primer een stopcodon bevat. Gebruik de ontworpen primers om het invoeg-DNA van het gen van belang te versterken.Combineer de PCR-reagentia volgens de handschriftaanwijzingen, zorg ervoor dat u een high-fidelity DNA polymerase gebruikt om mutaties te minimaliseren. Programmeer de thermocycler en start de reactie. Na het voltooien van PCR, verteren het product in een 50-microliter spijsvertering reactie.Combineer in een buis van 1,5 milliliter 12 microliter gedestilleerd water, vijf microliter van de juiste 10x beperkingsverteringsbuffer en 30 microliter van het PCR-product. Voeg vervolgens 1,5 microliter van elk beperkingsenzym toe. Vortex het reactiemengsel.En broeden 's nachts op 37,5 graden Celsius. Bereid een tweede reactie voor om de ontvanger plasmide te verteren. In een buis van 1,5 milliliter, combineren 23 microliter water, vijf microliters van de juiste 10X beperking spijsvertering buffer, 15 microliter van de ontvanger plasmid, en 1,5 microliter van elke beperking enzym.Meng de buis kort. En broeden 's nachts op 37,5 graden Celsius. Op de dag na het klonen en de transformatie, kies drie tot 10 individuele bacteriële kolonies en breng ze over naar een milliliter LB-medium met ampicilline.De cellen zes uur uitbroeden. En breng vervolgens 200 microliter bacteriële suspensie over naar vijf milliliter vers LB-medium met ampicilline. Incubeer de cultuur op 37,5 graden Celsius met schudden op 200 rpm 's nachts.Op de volgende dag, isoleren van de plasmid met een mini-prep DNA-zuivering kit. Scherm de gezuiverde plasmide voor een succesvolle ligatie met PCR. Een dag voor de transfectie, zaad van de cellen op een poly-L-lysine gecoate 96-put plaat met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium aangevuld met 10% foetale runder serum, 100 eenheden per milliliter penicilline G, en 100 microliter per milliliter streptomycine.Voeg alleen cellen toe aan de 60 binnenste putten om het potentieel voor thermische gradiënten over de plaat en randeffecten van verdamping te minimaliseren. Voeg 200 microliter steriel gedestilleerd water toe aan de 36 buitenputten en 150 microliter in de ruimtes tussen de putten. Dan incubeer de plaat 's nachts op 37,5 graden Celsius en 5% kooldioxide.Op de volgende dag, uitvoeren van transfectie met behulp van een totaal van 100 nanogram DNA. Stel vier verschillende plasmidecombinaties op volgens manuscriptrichtingen. Met behulp van 20 microliters van gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES, en 0,3 microliter van lipidische transfectie reagens per goed.Voeg 20 microliters lipidische transfectie reagens en DNA-mengsel aan elke put, en meng de plaat in cirkels gedurende 10 seconden. Broed de plaat zes uur lang in op 37,5 graden Celsius en 5%kooldioxide. Vernieuw het medium.En nog 24 uur uitbroeden. Na de incubatie, aspirate het medium en voeg 100 microliters van gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES aan elke put. Laat de plaat 10 minuten stabiliseren bij kamertemperatuur.Bereid ondertussen het furimazine substraat voor door één volume van het 100X substraat te combineren met 19 volumes LCS verdunningsbuffer, waardoor een 5X-voorraad ontstaat om te mengen met het celkweekmedium. Wanneer de cellen klaar zijn, voeg 25 microliter van de voorraad aan elke put, en meng voorzichtig de plaat gedurende 10 seconden. Meet vervolgens de luminescentie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor signaalstabilisatie.Voor experimenten met ligand toevoeging, bereid de 13.5X ligand oplossing in gemodificeerde Eagle's minimale essentiële media gebufferd met HEPES, en voeg 10 microliters per goed met behulp van een multichannel pipet. Meng vervolgens de plaat met de hand of met een orbitale shaker. Dit protocol is met succes gebruikt om interacties tussen een prototypische GPCR en twee bèta-arrestine isovormen te bestuderen.Vier verschillende plasmidecombinaties werden gescreend, en één met het hoogste luminescente signaal werd geselecteerd voor verdere experimenten. De EC50-waarden voor elke bèta-arrestine-isovorm werden bepaald aan de hand van dosisresponscurven, die werden verkregen uit de maximale respons van elke concentratie uit kinetische studies. Het is van cruciaal belang om speciale aandacht te besteden bij het ontwerpen van de PCR primers.De ontwikkeling van de juiste constructies is essentieel voor het succes van deze testen. Volgens deze methodologie u receptor-bèta-arresten in interacties monitoren, evenals receptorinteracties met andere cytosolische eiwitten. Deze methodologie zal helpen om fundamentele vragen op het gebied van GPCR farmacologie te beantwoorden door te bestuderen hoe GPCR-bèta-arrestine interacties kunnen worden gemoduleerd door wijzigingen in de ligand structuur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regeneratie van gekleed gouden Microelectrodes uitgerust voor een Real-Time cel Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time opvolgen van de DNA Strand Exchange reactie gemedieerd door Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...