Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Forschungsprogramms (NRF- 2015M3A9E7029172) der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung finanziert wird.

1. Primer Design-Strategie
<ol><li>Designprimer zur Einführung von Genen von Interesse in pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.</li>
	<li>Wählen Sie mindestens einen dieser drei Standorte als eines der beiden einzigartigen Restriktionsenzyme aus, die für das richtungsweisende Klonen aufgrund des Vorhandenseins eines In-Frame-Stop-Codons benötigt werden, das die Multiklonierungsstelle teilt, wie in Abbildung 1<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Mit der hier vorgestellten Methode können Die Wechselwirkungen zwischen jedem GPCR und dem '-arrestin1'2 in Echtzeit-Lebendenmitsystemen mit diesem GPCR---Arrestin-Strukturkomplementierungstest überwacht werden. In diesem Zusammenhang konnten wir die unterschiedliche Rekrutierung von -Arrestin-Rekrutierungen zwischen den beiden -arrestin-Isoformen durch die GLP-1r (A prototypische Klasse B GPCR) beobachten, wir beobachteten auch eine Dissoziation des Rezeptor---Arrestin-Komplexes wenige Minuten nach Erreichen des Lumin...

GPCRs stellen das Ziel von fast 35% der aktuellen Medikamente auf dem Markt1,2 dar, und ein klares Verständnis ihrer Pharmakologie ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Medikamente3. Einer der Schlüsselaspekte bei der Entdeckung von GPCR-Medikamenten, insbesondere bei der Entwicklung von voreingenommenen Agonisten, ist die Charakterisierung neuartiger Liganden hin zu Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen4 und wie clathrin5.
Es wurde dokumentiert, dass die abhängige Signalisierung von '-arrestin eine Schlüsselrolle bei neurologischen Störungen wie bipolarer Störung, schwerer Depression und Schizophrenie6 sowie schweren Nebenwirkungen in einigen Medikamenten wie Morphin7spielt.
Aktuelle Methoden zur Überwachung dieser Wechselwirkungen stellen in der Regel keine tatsächlichen endogenen Werte der Proteine in der Studie dar, in einigen Fällen zeigen sie schwaches Signal, Photobleichung und je nach GPCR könnte es technisch schwierig sein,8einzurichten. Dieser neuartige strukturelle Komplementierungstest verwendet Vektoren mit niedrigem Ausdruckspromotor, um endogene physiologische Werte nachzuahmen und bietet eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu aktuellen Methoden9. Mit diesem Ansatz war es möglich, Galanin-Rezeptor---Arrestin1/2 und auch die Wechselwirkungenvon10 -, arrestin2-clathrin, leicht zu charakterisieren. Diese Methode kann weit verbreitet für jede GPCR von besonderem Interesse verwendet werden, wo die '-Arrestine eine wichtige physiologische Funktion spielen oder ihre Signalisierung bei einigen Krankheiten relevant ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Wechselwirkungen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und A-Arrestinen sind lebenswichtige Prozesse mit physiologischen Implikationen von großer Bedeutung. Derzeit ist die Charakterisierung neuartiger Medikamente in Bezug auf ihre Wechselwirkungen mit '-Arrestinen und anderen zytosolischen Proteinen im Bereich der GPCR-Medikamentenentdeckung besonders während der Untersuchung des GPCR-voreingenommenen Agonismus äußerst wertvoll. Hier zeigen wir die Anwendung eines neuartigen strukturellen Komplementierungs-Assays zur genauen Überwachung von Rezeptor----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen. Diese Methode ist einfach, genau und kann leicht auf jede GPCR von Interesse erweitert werden und hat auch den Vorteil, dass sie unspezifische Wechselwirkungen aufgrund des Vorhandenseins eines Low-Expression-Promotors in jedem Vektorsystem überwindet. Dieser strukturelle Komplementierungstest bietet Schlüsselmerkmale, die eine genaue und präzise Überwachung der Rezeptor---Arrestin-Wechselwirkungen ermöglichen, wodurch er für die Untersuchung des voreingenommenen Agonismus eines BELIEBIGEN GPCR-Systems sowie der GPCR-c-terminus-Phosphorylierung geeignet ist. Codes' geschrieben von verschiedenen GPCR-Kinasen (GRKs) und post-translationale Modifikationen von Arrestinen, die den Rezeptor---Arrestin-Komplex stabilisieren oder destabilisieren.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Wechselwirkungen zwischen einem prototypischen GPCR und zwei '-Arrestin-Isoformen überwacht. Glucagon-ähnliche Peptidrezeptorkonstrukte (GLP-1r) wurden mit Primern hergestellt, die NheI- und EcoRI-Enzymrestriktionsstellen enthalten, und in die Vektoren pBiT1.1-C [TK/LgBiT] und pBiT2.1-C [TK/SmBiT] geklont, während bei pBiT1.1-N [TK/LgBiT] und pBiT2.1-N [TK/SmBiT] unter Verwendung der Enzymrestriktionsstellen BgIII und EcoRI im Fall von '-arrestin2 und NheI und XhoI im Falle ...

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Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Dieses Protokoll hat eine hohe Wirkung auf dem Gebiet der Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln, insbesondere bei der Entwicklung neuartiger, erstklassiger Medikamente mit minimalen Nebenwirkungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es auf jedes GPCR-System angewendet werden kann, und verwendet werden, um genaue Informationen über Rezeptor-Pharmakologie in Echtzeit-Lebensysteme zu erhalten. Die Auswirkungen dieser Technik stehen in engem Zusammenhang mit neuen Therapien, insbesondere dort, wo Beta-Arrestine relevant sind.Dazu gehören Opiod-Rezeptoren bei Schmerzen und Dopamin-Rezeptoren bei Schizophrenie. Diese Methode kann in vielen medizinisch-wissenschaftlichen Forschungsbereichen von der Neurologie bis zur Herz-Lungen-Erkrankung nützlich sein. Die PCR-Demonstration unserer Methode ist wichtig, da sie eine detaillierte Darstellung der kritischen Schritte im Protokoll ermöglicht, was mit einer herkömmlichen Veröffentlichung nicht möglich wäre.Beginnen Sie mit dem Entwerfen von Primern, um Gene einzuführen, die für die pBiT-Vektoren von Interesse sind. Aufgrund des Inframe-Stop-Codons, das die Multi-Klon-Stelle teilt, wählen Sie mindestens einen der drei Standorte als eines der beiden einzigartigen Restriktionsenzyme aus, die für das richtungsweisende Klonen benötigt werden. Beziehen Sie sich auf das Manuskript für Nukleotidsequenzen, um die Linkerrückstände zu kodieren und in die Primer zu integrieren.Stellen Sie für pBiT1.1-C und pBiT2.1-C sicher, dass die Vorwärtsgrundierung ein ATG-Codon und eine potente Kozak-Konsenssequenz enthält. Stellen Sie für pBiT1.1-N und pBiT2.1-N sicher, dass die Reverse Primer ein Stop-Codon enthält. Verwenden Sie die entworfenen Primer, um die Insert-DNA des gens von Interesse zu verstärken.Kombinieren Sie die PCR-Reagenzien nach Manuskriptanweisungen, um eine hochtreue DNA-Polymerase zu verwenden, um Mutationen zu minimieren. Programmieren Sie den Thermocycler und starten Sie die Reaktion. Nach Abschluss der PCR verdauen Sie das Produkt in einer 50-Mikroliter-Verdauungsreaktion.Kombinieren Sie in einer 1,5-Milliliter-Röhre 12 Mikroliter destilliertes Wasser, fünf Mikroliter des entsprechenden 10-Fach-Restriktionsverdauungspuffers und 30 Mikroliter des PCR-Produkts. Dann fügen Sie 1,5 Mikroliter jedes Restriktionsenzyms hinzu. Wirbel nisch das Reaktionsgemisch.Und über Nacht bei 37,5 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie eine zweite Reaktion vor, um das Empfängerplasmid zu verdauen. Kombinieren Sie in einer 1,5-Milliliter-Röhre 23 Mikroliter Wasser, fünf Mikroliter des entsprechenden 10-Fach-Restriktionsverdauungspuffers, 15 Mikroliter des Empfängerplasmids und 1,5 Mikroliter jedes Restriktionsenzyms.Mischen Sie die Röhre kurz. Und über Nacht bei 37,5 Grad Celsius inkubieren. Am Tag nach dem Klonen und der Transformation drei bis zehn einzelne Bakterienkolonien pflücken und auf einen Milliliter LB-Medium mit Ampicillin übertragen.Inkubieren Sie die Zellen für sechs Stunden. Und dann 200 Mikroliter bakterielle Suspension auf fünf Milliliter frisches LB-Medium mit Ampicillin übertragen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37,5 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 Umdrehungen von Morgen über Nacht.Am nächsten Tag isolieren Sie das Plasmid mit einem Mini-Prep-DNA-Reinigungskit. Überprüfen Sie das gereinigte Plasmid für eine erfolgreiche Ligation mit PCR. Einen Tag vor der Transfektion säen Sie die Zellen auf einer Poly-L-Lysin-beschichteten 96-Well-Platte mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin G und 100 Mikroliter pro Milliliter Streptomycin.Fügen Sie den 60 Innenbrunnen nur Zellen hinzu, um das Potenzial für thermische Gradienten über die Platte und Kanteneffekte durch Verdunstung zu minimieren. Fügen Sie 200 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in die 36 Außenbrunnen und 150 Mikroliter in die Räume zwischen den Brunnen. Dann inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Führen Sie am nächsten Tag die Transfektion mit insgesamt 100 Nanogramm DNA durch. Richten Sie vier verschiedene Plasmidkombinationen nach Manuskriptanweisungen ein. Mit 20 Mikroliter modifizierten Eagle minimalen essentiellen Medien mit HEPES gepuffert, und 0,3 Mikroliter Lipidtransfektion Reagenz pro Brunnen.Fügen Sie 20 Mikroliter Lipidtransfektionreagenz und DNA-Mischung zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie die Platte in Kreisen für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die Platte bei 37,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Aktualisieren Sie das Medium.Und noch 24 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation das Medium ansaugen und 100 Mikroliter modifizierter Eagle-Mindestmedien, die mit HEPES gepuffert sind, zu jedem Brunnen hinzufügen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 10 Minuten stabilisieren.In der Zwischenzeit bereiten Sie das Furimazin-Substrat vor, indem Sie ein Volumen des 100-Fach-Substrats mit 19 Bänden LCS-Verdünnungspuffer kombinieren, wodurch ein 5-facher Bestand entsteht, der mit dem Zellkulturmedium vermischt werden soll. Wenn die Zellen bereit sind, fügen Sie 25 Mikroliter des Bestands zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie die Platte vorsichtig für 10 Sekunden. Messen Sie dann die Lumineszenz für 10 Minuten bei Raumtemperatur für die Signalstabilisierung.Für Experimente mit Ligand-Zugabe bereiten Sie die 13,5-fache Ligandenlösung in modifizierten Eagle-Mindestmedien vor, die mit HEPES gepuffert wurden, und fügen Sie 10 Mikroliter pro Brunnen mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Dann mischen Sie die Platte von Hand oder mit einem Orbital-Shaker. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Wechselwirkungen zwischen einem prototypischen GPCR und zwei Beta-Arrestin-Isoformen zu untersuchen.Vier verschiedene Plasmidkombinationen wurden gescreent, und diejenige mit dem höchsten Leuchtsignal wurde für weitere Experimente ausgewählt. Die EC50-Werte für jedes Beta-Arrestin-Isoform wurden anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven ermittelt, die aus der maximalen Reaktion jeder Konzentration aus kinetischen Studien ermittelt wurden. Beim Entwerfen der PCR-Primer ist es wichtig, besonders aufzupassen.Die Entwicklung der richtigen Konstrukte ist entscheidend für den Erfolg dieser Assays. Nach dieser Methode, Sie werden in der Lage sein, Rezeptor-Beta-Arrestin-Wechselwirkungen zu überwachen, sowie Rezeptor-Wechselwirkungen mit anderen zytosolischen Proteinen. Diese Methode wird helfen, grundlegende Fragen im Bereich der GPCR-Pharmakologie zu beantworten, indem untersucht wird, wie GPCR-Beta-Arrestin-Wechselwirkungen durch Modifikationen in der Ligandenstruktur moduliert werden können.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Echtzeit-Tracking der DNA-Fragment-Trennung durch Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Echtzeit-Beobachtung der DNA-Strang Exchange Reaktion vermittelt durch Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanoparticles System für Membran-Protein-Protein-Interaktionsanalyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...