Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר (NRF-2015M3A9E7029172) של הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד המדע, התקשוב, ותכנון עתידי.

1. פריימר אסטרטגיית עיצוב
<ol><li>עיצוב התחל להציג גנים של עניין לתוך pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים.</li>
	<li>בחר לפחות אחד משלושת האתרים האלה כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשכפול כיוונים בשל נוכחותם של מסגרת עצירה במסגרת שמפרידה את האתר הרב כמוצג <strong cla...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

באמצעות השיטה המוצגת כאן, אינטראקציות בין כל GPCR ו β-arrestin1/2 יכול להיות מנוטרים בזמן אמת מערכות החיים באמצעות זה GPCR-β-בפיגור מבניים שיטת השלמת. בהקשר זה, היינו מסוגלים לצפות הβ הדיפרנציאלי מפיגור הגיוס בין שני β-מפיגור של שניים על ידי GLP-1r (מחלקה פרוטו אופיינית B GPCR), ראינו גם דיסוציאציה של הקומ?...

GPCRs מייצגים את היעד של כמעט 35% התרופות הנוכחיות בשוק1,2 והבנה ברורה של פרמקולוגיה שלהם הוא חיוני בפיתוח תרופות טיפוליות הרומן3. אחד ההיבטים המרכזיים בגילוי הסמים GPCR, במיוחד במהלך התפתחות של אגוניסטים מוטה הוא האפיון של ליגונים הרומן לקראת קולטן-β-מפיגור של אינטראקציות4 ו-β-מפיגור עם חלבונים אחרים ציטוסולונים כגון כקלרין5
זה תועד כי β-מפיגור איתות משחק תפקיד מפתח בהפרעות נוירולוגיות כגון הפרעה דו-קוטבית, דיכאון חמור, ו סכיזופרניה6 וגם תופעות לוואי חמורות בתרופות מסוימות כגון מורפיום7.
השיטות הנוכחיות המשמשות לניטור האינטראקציות הללו בדרך כלל לא מייצגים רמות אנדוגניים בפועל של החלבונים במחקר, במקרים מסוימים הם מראים אות חלשה, photobleaching לבנת ובהתאם GPCR זה יכול להיות מאתגרת טכנית להגדיר8. זה מבנה הרומן מבנית משתמש וקטורים ביטוי נמוך מקדם כדי לחקות רמות פיזיולוגיות אנדודוגני ומספק רגישות גבוהה לעומת שיטות נוכחיות9. באמצעות גישה זו, ניתן היה לאפיין בקלות את הקולטן Galanin-β-arrestin1/2 וגם β-arrestin2-clathrin רין אינטראקציות10. מתודולוגיה זו יכולה לשמש רבות לכל GPCR של עניין מסוים שבו β-הפיגור לשחק פונקציה פיזיולוגית מפתח או האיתות שלהם רלוונטי מחלות מסוימות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

אינטראקציות בין חלבון G מצמידים קולטנים (GPCRs) ו-β-הפיגור הם תהליכים חיוניים עם השלכות פיזיולוגיות של חשיבות רבה. כיום, האפיון של תרופות הרומן כלפי האינטראקציות שלהם עם β-מפיגור וחלבונים אחרים ציטוסולוריג הוא בעל ערך רב בתחום של גילוי תרופות GPCR במיוחד במהלך המחקר של GPCR מוטה האגניזם. כאן, אנו מראים את היישום של הרומן מבנה מבנית הספר כדי לפקח במדויק על β-מפיגור של אינטראקציות במערכות החיים בזמן אמת. שיטה זו היא פשוטה, מדויקת יכול להיות מורחב בקלות לכל GPCR של עניין וגם יש לו את היתרון כי הוא מתגבר על אינטראקציות לא ספציפיות עקב נוכחות של מקדם ביטוי נמוך נוכח בכל מערכת וקטורים. זה מבנה קומפלמנטציה מספקת תכונות מפתח המאפשרות ניטור מדויק ומדויק של קולטן-הβ-מפיגור האינטראקציות, מה שהופך אותו מתאים במחקר של אגוניזם מוטה של כל מערכת GPCR, כמו גם הסוף GPCR c-הטרמינוס ' זירחון קודים שנכתבו על ידי GPCR שונים (GRKs) ו פוסט-טרנסלtional שינויים של הפיגור הייצוב או יציבות הקולטן-β-מורכב.

באמצעות ההליך המוצג כאן, אינטראקציות בין הפרוטוקול GPCR ושני β בפיגור היו מנוטרים. Glucagon כמו קולטן פפטיד (GLP-1r) בנייה נעשו באמצעות התחל המכיל NheI ו EcoRI אתרי הגבלת אנזימים משוכפל לתוך וקטורים pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] תוך במקרה של β-הפיגור, שני וקטורים נוספים היו השתמשו ב-pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT]...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

פרוטוקול זה יש השפעה גבוהה בתחום גילוי ופיתוח סמים, במיוחד בפיתוח של תרופות חדשניות, ראשון מסוגו עם תופעות לוואי מינימליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על כל מערכת GPCR, ושמש כדי לקבל מידע מדויק על פרמקולוגיה קולטן במערכות חיים בזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו קשורות קשר הדוק לטיפולים חדשים במיוחד כאשר בטא-עצורים רלוונטיים.אלה כוללים קולטני אופיוד בכאב, קולטני דופמין בסכיזופרניה. שיטה זו יכולה להיות שימושית בתחומים רבים של מחקר מדעי רפואי מנוירולוגיה למחלות לב וכלי דם. הדגמת PCR של השיטה שלנו חשובה, כי זה מאפשר הצגה מפורטת של השלבים הקריטיים בפרוטוקול, אשר לא יהיה אפשרי עם פרסום קונבנציונלי.התחל בתכנון פריימרים כדי להציג גנים מעניינים לווקטורים pBiT. בשל קודון עצירת המסגרת המחלק את האתר מרובה השיבוטים, בחר לפחות באחד משלושת האתרים כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשיבוט כיווני. עיין בכתב היד עבור רצפי נוקלאוטידים כדי לקודד את שאריות המקשר ולשלב אותם לתוך פריימרים.עבור pBiT1.1-C ו pBiT2.1-C לוודא כי פריימר קדימה מכיל קודון ATG ורצף קונצנזוס קוזאק חזק. עבור pBiT1.1-N ו pBiT2.1-N ודא כי פריימר הפוך מכיל קודון עצירה. השתמש פריימרים מעוצבים כדי להגביר את DNA הכנס של הגן של עניין.שלב את רייגנטים PCR על פי הוראות כתב יד, הקפד להשתמש פולימראז DNA נאמנות גבוהה כדי למזער מוטציות. תכנת את התרמוצ'ילר ותתחיל את התגובה. לאחר השלמת PCR, לעכל את המוצר בתגובת עיכול 50 מיקרוליטר.בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 12 microliters של מים מזוקקים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, ו 30 microliters של מוצר PCR. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של כל אנזים הגבלה. וורטקס תערובת התגובה.ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. הכינו תגובה שנייה לעיכול הפלסמיד של המטופל. בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 23 microliters של מים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, 15 microliters של פלסמיד הנמען, ו 1.5 microliters של כל אנזים הגבלה.מערבבים בקצרה את הצינור. ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. ביום שלאחר השיבוט והטרנספורמציה, בחרו שלוש עד עשר מושבות חיידקים בודדות והעבירו אותן למיליליטר אחד של מדיום LB עם אמפיצילין.דגירה התאים במשך שש שעות. ואז להעביר 200 microliters של השעיה חיידקית לחמישה מיליליטר של מדיום LB טרי עם אמפיצילין. הדגירה את התרבות ב 37.5 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד לילה.ביום שלמחרת, לבודד את הפלסמיד עם ערכת טיהור DNA מיני הכנה. מסך פלסמיד מטוהרים עבור קשירה מוצלחת עם PCR. יום אחד לפני ההטמקה, זרע את התאים על צלחת פולי-L-ליסין מצופה 96 בארות באמצעות מדיום הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר של פניצילין G, ו 100 microliters למיליליטר של סטרפטומיצין.הוסף תאים רק ל-60 בארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל למילויים הדרגתיים תרמיים לאורך הלוח ואפקטי קצה מאידוי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים ל-36 בארות החיצוניות, ו-150 מיקרוליטרים לחללים שבין בארות. ואז להת הדגירה את הצלחת לילה ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ביום שלמחר, לבצע transfection באמצעות סך של 100 DNA ננוגרם. הגדר ארבעה שילובי פלסמיד שונים על פי הוראות כתב היד. באמצעות 20 microliters של מדיה חיונית מינימלית של הנשר שונה במאגר עם HEPES, ו 0.3 microliters של רגנט transfection השומנים לכל באר.מוסיפים 20 מיקרוליטרים של רגנט טרנספרפיד ליפידי ותערובת DNA לכל באר, ומערבבים את הצלחת במעגלים במשך 10 שניות. דגירה הצלחת ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. רענן את המדיום.ותתגרה עוד 24 שעות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיום והוסיפו 100 מיקרוליטרים של המדיה החיונית המינימלית של הנשר שעברה אגירה עם HEPES לכל באר. אפשר לצלחת להתייצב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.בינתיים, להכין את המצע furimazine על ידי שילוב נפח אחד של מצע 100X עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS, יצירת מלאי 5X לערבב עם מדיום תרבות התא. כאשר התאים מוכנים, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של המניה לכל באר, ומערבבים בעדינות את הצלחת במשך 10 שניות. לאחר מכן למדוד את אור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לייצוב אות.לניסויים עם תוספת ליגנד, הכינו את פתרון הליגנד פי 13.5 במדיה החיונית המינימלית של Eagle עם HEPES, והוסיפו 10 מיקרוליטרים לעין באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ואז לערבב את הצלחת ביד או עם שייקר מסלולית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקר אינטראקציות בין GPCR prototypical ושני isoforms בטא-arrestin.ארבעה צירופי פלסמיד שונים הוקרנו, וזה עם האות הגבוה ביותר שנבחר לניסויים נוספים. ערכי EC50 עבור כל איזופורם בטא-arrestin נקבעו באמצעות עקומות תגובה מינון, אשר התקבלו מן התגובה המרבית של כל ריכוז מחקרים קינטיים. זה קריטי להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת עיצוב פריימרים PCR.פיתוח המבנים הנכונים חיוני להצלחתם של מתנאים אלה. בעקבות מתודולוגיה זו, תוכל לפקח על אינטראקציות קולטן-בטא-arrestin, כמו גם אינטראקציות קולטן עם חלבונים ציטוסוליים אחרים. מתודולוגיה זו תסייע לענות על שאלות בסיסיות בתחום הפרמקולוגיה GPCR על ידי לימוד כיצד אינטראקציות GPCR-בטא-arrestin ניתן לווסת על ידי שינויים במבנה ligand.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...