Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

यह काम विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी, और भविष्य की योजना द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) के अनुसंधान कार्यक्रम (एनआरएफ 2015M3A9E7172) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

1. प्राइमर डिजाइन रणनीति
<ol><li>डिजाइन प्राइमर pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] और pBiT2.1-N [TK/SmBiT] वेक्टर में पेश करने के लिए।</li>
	<li>इन तीन साइटों में से कम से कम एक के रूप में इन तीन साइटों में से एक का चयन करें दिशात्मक क्लो?...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

यहाँ प्रस्तुत विधि का उपयोग करना, किसी भी GPCR और जेड-arrestin1]2 के बीच बातचीत वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में नजर रखी जा सकती है इस GPCR-जेड-arrestin संरचनात्मक पूरक परख का उपयोग कर. इस संबंध में, हम GLP-1r (एक protypical कक्षा ?...

जीपीसीआर बाजार में वर्तमान औषधों के लगभग35% के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करती है,2 और उनकी औषध विज्ञान की स्पष्ट समझ उपन्यास चिकित्सीय औषधों3के विकास में महत्वपूर्ण है . GPCR दवा की खोज में प्रमुख पहलुओं में से एक, विशेष रूप से पक्षपाती agonists के विकास के दौरान रिसेप्टर की ओर उपन्यास ligands की विशेषता है-- arrestin बातचीत4 और अन्य cytosolic प्रोटीन के साथ - arrestin बातचीत इस तरह के रूप में clathrin5|
यह प्रलेखित किया गया है कि द्विध्रुवी विकार, प्रमुख अवसाद, और स्किज़ोफ्रेनिया6 जैसे न्यूरोलॉजिकल विकारों में जेड-arrestin निर्भर संकेतन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और कुछ दवाओं जैसे मॉर्फिन7में गंभीर साइड इफेक्ट्स भी हैं।
इन बातचीत पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया वर्तमान तरीकों आमतौर पर अध्ययन में प्रोटीन की वास्तविक अंतर्जात स्तर का प्रतिनिधित्व नहीं करते, कुछ मामलों में वे कमजोर संकेत दिखाने के लिए, photobleaching और GPCR के आधार पर यह तकनीकी रूप से स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकताहै 8. यह उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख अंतर्जात शारीरिक स्तरों की नकल करने के लिए कम अभिव्यक्ति प्रवर्तक सदिशों का उपयोग करता है और वर्तमान विधियों9की तुलना में उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है . इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह आसानी से Galanin रिसेप्टर की विशेषता के लिए संभव था-जेड-arrestin1]2 और यह भी [-arrestin2-clathrin बातचीत10. इस पद्धति को व्यापक रूप से विशेष हित के किसी भी GPCR के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां - arrestins एक प्रमुख शारीरिक समारोह खेलते हैं या उनके संकेत कुछ रोगों में प्रासंगिक है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) और जेड-arrestins के बीच बातचीत महान महत्व के शारीरिक प्रभाव के साथ महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं रहे हैं. वर्तमान में, विशेष रूप से GPCR पक्षपाती agonism के अध्ययन के दौरान GPCR दवा की खोज के क्षेत्र में उनके साथ बातचीत की दिशा में उपन्यास दवाओं की विशेषता - arrestins और अन्य साइटोसोलिक प्रोटीन अत्यंत मूल्यवान है. यहाँ, हम एक उपन्यास संरचनात्मक पूरक परख के आवेदन को सही ढंग से वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी के लिए दिखा. इस विधि सरल, सटीक है और आसानी से ब्याज की किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और यह भी लाभ है कि यह एक कम अभिव्यक्ति प्रत्येक वेक्टर प्रणाली में मौजूद प्रमोटर की उपस्थिति के कारण विशिष्ट बातचीत पर काबू पा लिया है. यह संरचनात्मक पूरक परख प्रमुख विशेषताएं प्रदान करता है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin बातचीत की सटीक और सटीक निगरानी की अनुमति देते हैं, जिससे यह किसी भी जीपीसीआर प्रणाली के पक्षपाती एगोनिज्म के अध्ययन के साथ-साथ जीपीसीआर सी-टर्मिनस 'फॉस्फोरिलेशन' की अनुमति देता है। विभिन्न जीपीसीआर-किनेस (GRKs) और arrestins के बाद अनुवाद संशोधनों द्वारा लिखा गया है जो रिसेप्टर-जेड-arrestin परिसर को स्थिर या अस्थिर करते हैं।

यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, एक protypical GPCR और दो के बीच बातचीत - arrestin isoforms नजर रखी गई. पेप्टाइड रिसेप्टर (जीएलपी-1r) की तरह ग्लूकागन निर्माण NheI और EcoRI एंजाइम प्रतिबंध साइटों युक्त प्राइमर का उपयोग कर बनाया...

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Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-जेड-arrestin बातचीत GPCR दवा की खोज में एक उभरते क्षेत्र हैं. सटीक, सटीक और आसान तरीके स्थापित करने के लिए जीवन प्रणाली में इस तरह के बातचीत की निगरानी के लिए आवश्यक हैं. हम वास्तविक समय जीवित कोशिकाओं में GPCR-जेड-arrestin बातचीत की निगरानी करने के लिए एक संरचनात्मक पूरक परख दिखाने के लिए, और यह किसी भी GPCR करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

निगरानी GPCR-जेड-arrestin1/2 ड्रग डिस्कवरी में तेजी लाने के लिए वास्तविक समय रहने वाले सिस्टम में बातचीत

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

इस प्रोटोकॉल का दवा खोज और विकास के क्षेत्र में उच्च प्रभाव पड़ता है, विशेष रूप से उपन्यास के विकास में, न्यूनतम दुष्प्रभावों के साथ प्रथम श्रेणी की दवाएं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे किसी भी जीपीसीआर प्रणाली पर लागू किया जा सकता है, और वास्तविक समय में रहने वाले सिस्टम में रिसेप्टर फार्माकोलॉजी के बारे में सटीक जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस तकनीक के निहितार्थ बारीकी से नए उपचारों से संबंधित हैं, विशेष रूप से जहां बीटा-गिरफ्तारी प्रासंगिक हैं।इनमें दर्द में ओपिओड रिसेप्टर्स और सिजोफ्रेनिया में डोपामाइन रिसेप्टर्स शामिल हैं। यह विधि न्यूरोलॉजी से लेकर कार्डियोपल्मोनरी रोग तक कई चिकित्सा वैज्ञानिक अनुसंधान क्षेत्रों में उपयोगी हो सकती है। हमारी विधि का पीसीआर प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों की विस्तृत प्रस्तुति के लिए अनुमति देता है, जो पारंपरिक प्रकाशन के साथ संभव नहीं होगा।pBiT वैक्टर के लिए ब्याज के जीन शुरू करने के लिए प्राइमर डिजाइन करके शुरू करो । मल्टी-क्लोनिंग साइट को विभाजित करने वाले इनफ्रम स्टॉप कोडन के कारण, दिशात्मक क्लोनिंग के लिए आवश्यक दो अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइमों में से एक के रूप में तीन साइटों में से कम से एक का चयन करें। लिंकर अवशेषों को एन्कोड करने और उन्हें प्राइमर में शामिल करने के लिए न्यूक्लियोटाइड दृश्यों के लिए पांडुलिपि को देखें।pBiT1.1-C और pBiT2.1-C के लिए सुनिश्चित करें कि फॉरवर्ड प्राइमर में एक एटीजी कोडन और एक शक्तिशाली कोज़क आम सहमति अनुक्रम शामिल है। pBiT1.1-N और pBiT2.1-N के लिए सुनिश्चित करें कि रिवर्स प्राइमर एक बंद codon शामिल हैं । ब्याज के जीन के सम्मिलित डीएनए को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करें।पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीसीआर रिएजेंट्स को मिलाएं, जिससे म्यूटेशन को कम करने के लिए हाई-फिडेलिटी डीएनए पॉलीमरेज का इस्तेमाल करना सुनिश्चित करें । थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम करें और प्रतिक्रिया शुरू करें। पीसीआर को पूरा करने के बाद, उत्पाद को 50-माइक्रोलिटर पाचन प्रतिक्रिया में पचाें।एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, आसुत पानी के 12 माइक्रोलीटर, उपयुक्त 10X प्रतिबंध पाचन बफर के पांच माइक्रोलीटर, और पीसीआर उत्पाद के 30 माइक्रोलीटर गठबंधन। फिर प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर प्रतिक्रिया मिश्रण।और रात भर ३७.५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड को पचाने के लिए दूसरी प्रतिक्रिया तैयार करें। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में, 23 माइक्रोलीटर पानी, उपयुक्त 10X प्रतिबंध पाचन बफर के पांच माइक्रोलीटर, प्राप्तकर्ता प्लाज्मिड के 15 माइक्रोलीटर और प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 माइक्रोलीटर को मिलाएं।संक्षेप में ट्यूब मिलाएं। और रात भर ३७.५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । क्लोनिंग और परिवर्तन के बाद दिन, तीन से 10 व्यक्तिगत बैक्टीरियल कॉलोनियों को चुनें और उन्हें एम्पिसिलिन के साथ एलबी माध्यम के एक मिलीलीटर में स्थानांतरित करें।कोशिकाओं को छह घंटे तक इनक्यूबेट करें। और फिर एम्पीसिलिन के साथ ताजा पौंड माध्यम के पांच मिलीलीटर के लिए बैक्टीरियल निलंबन के २०० माइक्रोलीटर स्थानांतरित । रात 200 आरपीएम पर मिलाते हुए संस्कृति को 37.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया।अगले दिन, प्लाज्मिड को मिनी-प्रेप डीएनए शुद्धिकरण किट के साथ अलग करें। पीसीआर के साथ सफल लिगामेंट के लिए शुद्ध प्लाज्मिड को स्क्रीन करें। ट्रांसफेक्शन से एक दिन पहले, पॉली-एल-लिसिन लेपित 96-वेल प्लेट पर कोशिकाओं को बीज दें, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक डल्बेको के संशोधित ईगल के माध्यम का उपयोग करके, पेनिसिलिन जी के मिलीलीटर प्रति 100 इकाइयां, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के मिलीलीटर प्रति 100 माइक्रोलीटर।केवल 60 आंतरिक कुओं में कोशिकाओं को जोड़ने के लिए थाली भर में थर्मल ढाल के लिए क्षमता को कम करने और वाष्पीकरण से बढ़त प्रभाव । ३६ बाहर के कुओं में बाँझ आसुत पानी के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें, और कुओं के बीच रिक्त स्थान में १५० माइक्रोलीटर । फिर थाली रात भर ३७.५ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट ।अगले दिन कुल 100 नैनोग्राम डीएनए का इस्तेमाल कर ट्रांसफेक्शन करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार चार अलग-अलग प्लाज्मिड संयोजन स्थापित करें। संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 20 माइक्रोलीटर का उपयोग हेपेस के साथ बफर, और लिपिडिक ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 0.3 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से।प्रत्येक कुएं में लिपिडिक ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और डीएनए मिश्रण के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 10 सेकंड के लिए हलकों में प्लेट मिलाएं। छह घंटे के लिए ३७.५ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर थाली इनक्यूबेट । माध्यम को ताज़ा करें।और एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को एस्पारेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से एचईपी के साथ बफर संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्लेट को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर करने की अनुमति दें।इस बीच, एलसीएस कमजोर पड़ने बफर के 19 संस्करणों के साथ 100X सब्सट्रेट की एक मात्रा के संयोजन से furimazine सब्सट्रेट तैयार करें, सेल कल्चर मीडियम के साथ मिलाने के लिए 5X स्टॉक बनाते हैं । जब कोशिकाएं तैयार हों, तो प्रत्येक कुएं में स्टॉक के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें, और धीरे-धीरे प्लेट को 10 सेकंड के लिए मिलाएं। फिर सिग्नल स्थिरीकरण के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ल्यूमिनेसेंस को मापें।लिगांड अतिरिक्त के साथ प्रयोगों के लिए, एचईपी के साथ बफर किए गए संशोधित ईगल के न्यूनतम आवश्यक मीडिया में 13.5X लिगांड समाधान तैयार करें, और मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद थाली को हाथ से या कक्षीय शेकर के साथ मिलाएं। इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग एक प्रोटोटाइप जीपीसीआर और दो बीटा-गिरफ्तारी आइसोफॉर्म के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया गया है।चार अलग-अलग प्लाज्मिड संयोजनों की जांच की गई, और उच्चतम ल्यूमिनेसेंट सिग्नल वाले एक को आगे के प्रयोगों के लिए चुना गया था। प्रत्येक बीटा-गिरफ्तारी आइसोफॉर्म के लिए EC50 मानों को खुराक-प्रतिक्रिया घटता का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जो गतिज अध्ययनों से प्रत्येक एकाग्रता की अधिकतम प्रतिक्रिया से प्राप्त किए गए थे। पीसीआर प्राइमर डिजाइन करते समय विशेष ध्यान देना महत्वपूर्ण है।इन परखों की सफलता के लिए सही संरचनाओं का विकास जरूरी है। इस पद्धति के बाद, आप रिसेप्टर-बीटा-गिरफ्तारी इंटरैक्शन, साथ ही अन्य साइटोसोलिक प्रोटीन के साथ रिसेप्टर इंटरैक्शन की निगरानी करने में सक्षम होंगे। यह कार्यप्रणाली जीपीसीआर फार्माकोलॉजी के क्षेत्र में मौलिक प्रश्नों का उत्तर देने में मदद करेगी ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि लिगांड संरचना में संशोधनों द्वारा जीपीसीआर-बीटा-गिरफ्तारी को कैसे संग्राहक किया जा सकता है ।

Research

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Biochemistry

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डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया की वास्तविक समय अवलोकन Rad51 द्वारा मध्यस्थता

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

झिल्ली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए देशी सेल झिल्ली नैनोकण प्रणाली

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

वास्तविक समय में बरकरार, कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन के लिए न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को मापना

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...