Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca (NRF- 2015M3A9E7029172) della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero della Scienza, iCT e Pianificazione Futura.

1. Strategia di progettazione dei primer
<ol><li>Progettare i primi geni di interesse nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT].</li>
	<li>Selezionare almeno uno di questi tre siti come uno dei due enzimi di restrizione univoci necessari per la clonazione direzionale a causa della presenza di un codon di stop in-frame che divide il sito di multicloning come illustrato nella Figura 111.</li>
	<li>Incorporare l...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Utilizzando il metodo qui presentato, le interazioni tra qualsiasi GPCR e .-arrestin1 1/2 possono essere monitorate in sistemi viventi in tempo reale utilizzando questo saggio di complemento strutturale GPCR-arresto-arresto. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare il reclutamento differenziale di z-arrestin tra le due isoformi z-arrestin dal GLP-1r (Un prototipo di GPCR di classe B), abbiamo anche osservato una dissociazione del complesso recettore-z-arrestin pochi minuti dopo aver raggiunto il massimo segn...

I GPD rappresentano l'obiettivo di quasi il 35% dei farmaci attuali sul mercato1,2 e una chiara comprensione della loro farmacologia è cruciale nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici3. Uno degli aspetti chiave nella scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo sviluppo di agonisti di parte è la caratterizzazione di nuovi ligandi verso le interazioni recettore-arresto4 e le interazioni di arresto-arresto con altre proteine citosoliche come come clathrin5.
È stato documentato che la segnalazione dipendente da z-arrestin svolge un ruolo chiave nei disturbi neurologici come il disturbo bipolare, la depressione maggiore e la schizofrenia6 e anche gravi effetti collaterali in alcuni farmaci come la morfina7.
I metodi attuali utilizzati per monitorare queste interazioni di solito non rappresentano livelli endogeni effettivi delle proteine in studio, in alcuni casi mostrano segnale debole, fotosbiancamento e a seconda del GPCR potrebbe essere tecnicamente difficile da impostare8. Questa nuova analisi di complemento strutturale utilizza vettori promotori di bassa espressione per simulare livelli fisiologici endogeni e fornisce un'elevata sensibilità rispetto ai metodi attuali9. Utilizzando questo approccio, è stato possibile caratterizzare facilmente le interazioni di Galanin receptor-z-arrestin11/2 e anche di z-arrestin2-clathrin10. Questa metodologia può essere ampiamente utilizzata per qualsiasi GPCR di particolare interesse in cui gli arresti z svolgono una funzione fisiologica chiave o la loro segnalazione è rilevante in alcune malattie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Le interazioni tra i recettori accoppiati alle proteine G (GLR) e gli arresti z sono processi vitali con implicazioni fisiologiche di grande importanza. Attualmente, la caratterizzazione di nuovi farmaci verso le loro interazioni con gli arresti z e altre proteine citosoliche è estremamente preziosa nel campo della scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo studio dell'agonismo di parte della GPCR. Qui, mostriamo l'applicazione di un nuovo saggio di complemento strutturale per monitorare con precisione le interazioni recettore-arresto in sistemi viventi in tempo reale. Questo metodo è semplice, preciso e può essere facilmente esteso a qualsiasi GPCR di interesse e ha anche il vantaggio di superare interazioni non specifiche a causa della presenza di un promotore di bassa espressione presente in ogni sistema vettoriale. Questa analisi di complemento strutturale fornisce caratteristiche chiave che consentono un monitoraggio accurato e preciso delle interazioni recettore-z-arrestin, rendendolo adatto nello studio dell'agonismo distorto di qualsiasi sistema GPCR e del GPCR c-terminus 'phosphorylation diversi codici 'scritti da diverse chinasi GPCR (GRK) e modifiche post-traduzionali di arrestini che stabilizzano o destabilizzano il complesso recettore-arresto.

Utilizzando la procedura qui presentata, sono state monitorate le interazioni tra un prototipo di GPCR e due isoformi di arresto z. Glucagon come il recettore peptide (GLP-1r) sono stati realizzati utilizzando primer contenenti siti di restrizione enzimatica NheI ed EcoRI e clonati nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mentre, nel caso degli arresti zin, due vettori aggiuntivi sono stati, due vettori aggiuntivi sono stati ha usato pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilizzando siti di restrizio...

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Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Questo protocollo ha un alto impatto nel campo della scoperta e dello sviluppo di farmaci, specialmente nello sviluppo di nuovi farmaci di prima classe con effetti collaterali minimi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata a qualsiasi sistema GPCR e utilizzata per ottenere informazioni accurate sulla farmacologia dei recettori nei sistemi viventi in tempo reale. Le implicazioni di questa tecnica sono strettamente correlate alle nuove terapie, in particolare laddove le beta-arrestins sono rilevanti.Questi includono recettori oppioidi nel dolore e recettori della dopamina nella schizofrenia. Questo metodo può essere utile in molte aree di ricerca scientifica medica dalla neurologia alla malattia cardiopolmonare. La dimostrazione PCR del nostro metodo è importante, perché consente una presentazione dettagliata dei passaggi critici del protocollo, che non sarebbe possibile con la pubblicazione convenzionale.Inizia progettando primer per introdurre geni di interesse per i vettori pBiT. A causa del codone di arresto inframe che divide il sito di clonazione multipla, selezionare almeno uno dei tre siti come uno dei due enzimi di restrizione unici necessari per la clonazione direzionale. Fare riferimento al manoscritto per le sequenze nucleotidiche per codificare i residui del linker e incorporarli nei primer.Per pBiT1.1-C e pBiT2.1-C assicurarsi che il primer in avanti contenga un codone ATG e una potente sequenza di consenso di Kozak. Per pBiT1.1-N e pBiT2.1-N assicurarsi che il primer inverso contenga un codone di arresto. Utilizzare i primer progettati per amplificare il DNA inserto del gene di interesse.Combina i reagenti PCR secondo le indicazioni manoscritte, assicurandoti di utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni. Programmare il termociclo e avviare la reazione. Dopo aver completato la PCR, digerire il prodotto in una reazione di digestione di 50 microliter.In un tubo da 1,5 millilitri, combinare 12 microlitri di acqua distillata, cinque microlitri dell'appropriato tampone di digestione di restrizione 10X e 30 microlitri del prodotto PCR. Quindi aggiungere 1,5 microlitri di ogni enzima di restrizione. Vortice la miscela di reazione.E incubare durante la notte a 37,5 gradi Celsius. Preparare una seconda reazione per digerire il plasmide ricevente. In un tubo da 1,5 millilitri, unire 23 microlitri di acqua, cinque microlitri dell'appropriato tampone di digestione di restrizione 10X, 15 microlitri del plasmide ricevente e 1,5 microlitri di ciascun enzima di restrizione.Mescolare brevemente il tubo. E incubare durante la notte a 37,5 gradi Celsius. Il giorno successivo alla clonazione e alla trasformazione, scegli da tre a 10 singole colonie batteriche e trasferiscili in un millilitro di mezzo LB con ampicillina.Incubare le cellule per sei ore. E poi trasferire 200 microlitri di sospensione batterica a cinque millilitri di mezzo LB fresco con ampicillina. Incubare la coltura a 37,5 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min durante la notte.Il giorno successivo, isolare il plasmide con un kit di purificazione del DNA mini-preparazione. Scherma il plasmide purificato per una legatura di successo con PCR. Un giorno prima della trasfezione, seminare le cellule su una piastra di poli-L-lisina rivestita di 96 pozzetti utilizzando il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 unità per millilitro di penicillina G e 100 microlitri per millilitro di streptomicina.Aggiungere solo celle ai 60 pozzi interni per ridurre al minimo il potenziale di gradienti termici attraverso la piastra e gli effetti del bordo dall'evaporazione. Aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sterile ai 36 pozzi esterni e 150 microlitri negli spazi tra i pozzi. Quindi incubare la piastra durante la notte a 37,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il giorno dopo, eseguire la trasfezione utilizzando un totale di 100 nanogrammi di DNA. Impostare quattro diverse combinazioni di plasmidi in base alle direzioni del manoscritto. Utilizzando 20 microlitri del supporto essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES e 0,3 microlitri di reagente di trasfezione lipidica per pozzo.Aggiungere 20 microlitri di reagente di trasfezione lipidica e miscela di DNA ad ogni pozzo e mescolare la piastra in cerchi per 10 secondi. Incubare la piastra a 37,5 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per sei ore. Aggiornare il supporto.E incubare per altre 24 ore. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo e aggiungere 100 microlitri del mezzo essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES ad ogni pozzo. Lasciare stabilizzare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti.Nel frattempo, preparare il substrato di furimazina combinando un volume del substrato 100X con 19 volumi di tampone di diluizione LCS, creando uno stock 5X da mescolare con il mezzo di coltura cellulare. Quando le celle sono pronte, aggiungere 25 microlitri del calcio a ciascun pozzo e mescolare delicatamente la piastra per 10 secondi. Quindi misurare la luminescenza per 10 minuti a temperatura ambiente per la stabilizzazione del segnale.Per gli esperimenti con l'aggiunta di ligandi, preparare la soluzione di ligando 13,5X nel supporto essenziale minimo dell'Aquila modificato tamponato con HEPES e aggiungere 10 microlitri per pozzo utilizzando una pipetta multicanale. Quindi mescolare la piastra a mano o con uno shaker orbitale. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare le interazioni tra un GPCR prototipo e due isoforme beta-arrestin.Sono state schermate quattro diverse combinazioni di plasmidi e quella con il segnale luminescente più alto è stata selezionata per ulteriori esperimenti. I valori EC50 per ogni isoforma beta-arrestina sono stati determinati utilizzando curve dose-risposta, ottenute dalla risposta massima di ciascuna concentrazione da studi cinetici. È fondamentale prestare particolare attenzione durante la progettazione dei primer PCR.Lo sviluppo dei giusti costrutti è essenziale per il successo di questi saggi. Seguendo questa metodologia, sarai in grado di monitorare le interazioni recettore-beta-arrestina, nonché le interazioni del recettore con altre proteine citosoliche. Questa metodologia aiuterà a rispondere a domande fondamentali nel campo della farmacologia GPCR studiando come le interazioni GPCR-beta-arrestin possono essere modulate da modifiche nella struttura del ligando.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

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Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

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