Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
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이 사업은 과학기술정보통신부가 후원하는 국립연구재단(NRF)의 연구프로그램(NRF-2015M3A9E7029172)의 보조금으로 지원되었다.

1. 프라이머 디자인 전략
<ol><li>pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인합니다.</li>
	<li>도 111에도시된 바와 같이 멀티클로닝 부위를 분할하는 인프레임 스톱 코돈의 존재로 인해 방향 성 클로닝에 필요한 두 가지 독특한 제한 효소 중 하나로서 이들 3개 부위 중 적어도 하?...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

여기에 제시된 방법을 사용하여, 임의의 GPCR 및 β-arrestin1/2 사이의 상호작용은 이 GPCR-β-arrestin 구조적 보완 분석법을 사용하여 실시간 생활 시스템에서 모니터링될 수 있다. 이와 관련하여, 우리는 GLP-1r (프로토 타입 클래스 B GPCR)에 의해 두 개의 β-arrestin 이소폼 사이의 차동 β-arrestin 모집을 관찰 할 수 있었고, 우리는 또한 수용체 β-arrestin 복합체의 해리를 최대에 도달한 후 몇 분 후에 관찰했습?...

GPCR은 현재 시중에서 약품의 약35%를 대상으로 하고 있으며, 이들의 약리학에 대한 명확한 이해는 새로운 치료제 의 개발에 매우 중요하다 3. GPCR 약 발견에 있는 중요한 양상의 한개는, 특히 편향된 작용제의 발달 도중 수용체 β-arrestin 상호 작용4 및 β-arrestin 상호 작용과 같은 그밖 cytosolic 단백질을 향한 새로운 리간드의 특성입니다 클래트린5.
β-arrestin 의존성 신호는 양극성 장애, 주요 우울증 및 정신 분열증 6과 같은 신경 장애에 중요한 역할을 하며 모르핀7과 같은 일부 약물에서도 심각한 부작용을 가지고 있다는 것이 문서화되었다.
이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 사용되는 현재의 방법은 일반적으로 연구에서 단백질의 실제 내인성 수준을 나타내지 않으며, 어떤 경우에는 약한 신호, 광표백및 GPCR에 따라 8을 설정하는 것이 기술적으로 어려울 수 있습니다. 이러한 새로운 구조적 보완 분석법은 내인성 생리학적 수준을 모방하기 위해 낮은 발현 프로모터벡터를 사용하고 현재 방법 9에 비해 높은 감도를 제공한다. 이러한 접근법을 사용하여, 갈라닌 수용체-β-arrestin1/2 및 또한 β-arrestin2-클라트린 상호작용10을쉽게 특성화할 수 있었다. 이 방법론은 β-arrestins가 중요한 생리기능을 재생하거나 그들의 신호가 몇몇 질병에서 관련있는 특정 관심사의 어떤 GPCR든지에 널리 이용될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

G 단백질 결합 된 수용 체 사이 상호 작용 (GPCRs) 그리고 β-arrestins는 매우 중요 한 생리적 의미와 중요 한 과정. 현재, β-arrestins 및 그밖 cytosolic 단백질과의 상호 작용을 향해 새로운 약의 특성은 GPCR 편향된 agonism의 연구 도중 특히 GPCR 약 발견의 필드에서 극단적으로 귀중합니다. 여기서, 우리는 실시간 살아있는 시스템에서 수용체-β-레체아핀 상호작용을 정확하게 모니터링하기 위한 새로운 구조적 보완 분석법의 적용을 보여준다. 이 방법은 간단하고 정확하며 관심 있는 임의의 GPCR까지 용이하게 확장될 수 있으며 또한 각 벡터 시스템에 존재하는 낮은 발현 프로모터의 존재로 인해 비특이적 상호작용을 극복할 수 있다는 장점이 있다. 이 구조적 보완 분석법은 수용체-β-arrestin 상호 작용의 정확하고 정확한 모니터링을 허용하는 주요 기능을 제공하여 GPCR 시스템의 편향된 작용뿐만 아니라 GPCR c-종단 '인산화의 연구에 적합합니다. 다른 GPCR 키나아제 (GRKs)와 수용체 β-arrestin 복합체를 안정화하거나 불안정하게 하는 체포의 번역 후 수정에 의해 작성된 코드.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 프로토타입 GPCR과 2개의 β-arrestin 이소폼 사이의 상호작용을 모니터링했다. 글루카곤 유사 펩티드 수용체(GLP-1r) 컨스트럭트는 NheI 및 EcoRI 효소 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 만들어졌으며, β-레아핀의 경우 2개의 벡터를 추가로 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 및 pBiT2.1-C [TK/SmBiT]로 복제하였다. β-arrestin2 및 NheI 및 XhoI의 경우 β-arrestin1의 경우 효소 제한 부위 BgIII 및 Ec...

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Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

이 프로토콜은 약물 발견 및 개발 분야에서 특히 최소한의 부작용을 가진 새로운 일류 약물의 개발에 큰 영향을 미칩니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 GPCR 시스템에 적용될 수 있고, 실시간 생활 시스템에서 수용체 약리학에 대한 정확한 정보를 얻는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 베타 체포가 관련이 있는 새로운 치료와 밀접한 관련이 있습니다.이들은 정신 분열증에 있는 고통 및 도파민 수용체에 있는 opiod 수용체를 포함합니다. 이 방법은 신경학에서 심장 폐 질환에 이르기까지 많은 의학 과학 연구 분야에서 유용 할 수 있습니다. 기존의 출판에서는 불가능할 프로토콜의 중요한 단계를 상세히 제시할 수 있기 때문에 우리의 방법의 PCR 데모가 중요합니다.pBiT 벡터에 관심 있는 유전자를 소개하는 프라이머를 디자인하여 시작합니다. 다중 복제 부위를 나누는 인프레임 스톱 코돈으로 인해 방향 복제에 필요한 두 가지 고유 제한 효소 중 하나로 3개 부위 중 적어도 하나를 선택합니다. 뉴클레오티드 서열에 대한 원고를 참조하여 링커 잔류물을 인코딩하고 프라이머에 통합하십시오.pBiT1.1-C 및 pBiT2.1-C의 경우 앞으로 프라이머에 ATG 코돈과 강력한 코작 컨센서스 시퀀스가 포함되어 있는지 확인합니다. pBiT1.1-N 및 pBiT2.1-N의 경우 역프라이머에 스톱 코돈이 포함되어 있는지 확인합니다. 관심 있는 유전자의 삽입 DNA를 증폭하기 위하여 디자인된 프라이머를 이용하십시오.원고 방향에 따라 PCR 시약을 결합하여 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 돌연변이를 최소화하십시오. 열순환을 프로그래밍하고 반응을 시작합니다. PCR을 완료한 후 50 마이크로리터 소화 반응으로 제품을 소화합니다.1.5 밀리리터 튜브에서 증류수 12마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼5개, PCR 제품의 마이크로리터 30개 등을 결합합니다. 그런 다음 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 반응 혼합물을 소용돌이.그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 받는 사람을 소화하기 위해 두 번째 반응을 준비합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서, 물 23 마이크로리터, 적절한 10X 제한 소화 버퍼의 5 마이크로리터, 수신자 플라스미드의 15 마이크로리터, 각 제한 효소의 1.5 마이크로리터를 결합합니다.튜브를 짧게 섞습니다. 그리고 하룻밤 사이에 37.5도에서 배양하십시오. 복제 및 변형 다음 날에, 3 ~10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 암피실린과 LB 매체의 1 밀리리터로 전송.6 시간 동안 세포를 배양. 그리고 암피실린을 가진 신선한 LB 매체의 5밀리리터로 세균 현탁액의 200 마이크로리터를 전송합니다. 하룻밤 사이에 200 rpm에서 흔들리면서 37.5도에서 문화를 배양하십시오.다음 날, 플라스미드를 미니 준비 DNA 정화 키트로 분리합니다. PCR로 성공적인 결찰을 위해 정제 된 플라스미드를 선별하십시오. 트랜스펙트 하루 전에, Dulbecco의 수정 된 독수리의 매체를 사용하여 폴리 L-리신 코팅 96 웰 플레이트에 세포를 씨앗 10% 태아 소 혈청, 100 페니실린 G의 밀리리터 당 단위, 그리고 100 streptomycin의 밀리리터 당 마이크로 리터.60개의 내부 우물에만 셀을 추가하여 플레이트 전체의 열 그라데이션 및 증발로 인한 에지 효과의 가능성을 최소화합니다. 멸균 증류수 200마이크로리터를 36개의 외부 우물에 추가하고 150마이크로리터를 우물 사이의 공간에 넣습니다. 그런 다음 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.다음 날, 총 100 나노그램 DNA를 사용하여 형질 전환을 수행합니다. 원고 방향에 따라 네 가지 플라스미드 조합을 설정합니다. HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 매체 20마이크로리터와 잘 어울리한 1회당 0.3 마이크로리터를 사용한다.각 웰에 20 마이크로리터의 립지딕 트랜스펙션 시약및 DNA 혼합물을 넣고 10초 동안 원을 그리며 접시를 섞습니다. 플레이트를 섭씨 37.5도, 이산화탄소 5%에서 6시간 동안 배양합니다. 매체를 새로 고칩니다.그리고 또 다른 24 시간 동안 배양. 인큐베이션 후, 매체를 흡인하고 각 우물에 HEPES로 버퍼링 수정 된 독수리의 최소 필수 미디어의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트가 실온에서 10분 동안 안정화되도록 합니다.한편, 100X 기판의 1부피를 LCS 희석 버퍼 19권과 결합하여, 세포 배양 배지와 혼합하는 5배 스톡을 생성하여 퓨리마진 기판을 준비한다. 세포가 준비되면 각 우물에 25 마이크로리터를 추가하고 10 초 동안 접시를 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 신호 안정화를 위해 실온에서 10 분 동안 발광을 측정합니다.리간드 추가 실험을 위해 HEPES로 버퍼링된 수정된 Eagle의 최소 필수 미디어에 13.5X 리간드 솔루션을 준비하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 손으로 또는 궤도 셰이커와 접시를 혼합합니다. 이 프로토콜은 프로토타입 GPCR과 두 개의 베타 체포 동소형태 간의 상호 작용을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다.4개의 다른 플라스미드 조합을 선별하고, 발광 신호가 가장 높은 것을 가진 조합은 추가 실험을 위해 선택되었다. 각 베타-아테인 이소폼에 대한 EC50 값은 운동 연구에서 각 농도의 최대 반응으로부터 얻은 용량 반응 곡선을 사용하여 결정되었다. PCR 프라이머를 디자인할 때 특별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다.올바른 구조의 개발은 이러한 에세이의 성공에 필수적입니다. 이 방법론에 따라, 당신은 수용체 베타 - 체포 상호 작용을 모니터링 할 수있을 것입니다, 뿐만 아니라 다른 세포성 단백질과 수용체 상호 작용. 이 방법론은 GPCR 베타-아테인 상호 작용이 리간드 구조의 수정에 의해 변조 될 수있는 방법을 연구하여 GPCR 약리학 분야의 근본적인 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Smartphone을 이용한 DNA 단편 분리 실시간 추적

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

실시간 세포 분석기 장착 기준점과 골드 Microelectrodes의 재생

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

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