Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av stipend fra forskningsprogrammet (NRF-2015M3A9E7029172) av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtidig planlegging.

1. primer design strategi
<ol><li>Design primere å innføre gener av interesse i pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] vektorer.</li>
	<li>Velg minst ett av disse tre nettstedene som en av de to unike begrensning enzymer som trengs for retningsbestemt kloning på grunn av tilstedeværelsen av en in-Frame stopp Codon som deler multicloning området som vist i figur 111.</li>
	<li>Innlemme nukleotid sekvensen inn...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Ved hjelp av metoden som presenteres her, interaksjoner mellom noen GPCR og β-arrestin1/2 kan overvåkes i sanntid levende systemer ved hjelp av denne GPCR-β-arrestin strukturelle komplementering analysen. I denne forbindelse var vi i stand til å observere differensial β-arrestin rekruttering mellom de to β-arrestin isoformene av GLP-1R (A prototypiske klasse B GPCR), vi observerte også en dissosiasjon av reseptoren-β-arrestin kompleks noen få minutter etter å ha nådd det maksimale selvlysende signal.
<p cl...

GPCRs representerer målet på nesten 35% av dagens narkotika i markedet1,2 og en klar forståelse av deres farmakologi er avgjørende i utviklingen av romanen terapeutiske legemidler3. En av de viktigste aspektene i GPCR narkotika funnet, spesielt under utviklingen av partisk agonister er karakterisering av romanen ligander mot reseptor-β-arrestin interaksjoner4 og β-arrestin interaksjoner med andre cytosolic proteiner slik som clathrin5.
Det har blitt dokumentert at β-arrestin avhengige signalering spiller en nøkkelrolle i nevrologiske lidelser som bipolar lidelse, store depresjonen, og schizofreni6 og også alvorlige bivirkninger i noen medisiner som morfin7.
Gjeldende metoder som brukes til å overvåke disse interaksjoner vanligvis ikke representerer faktiske endogene nivåer av proteiner i studien, i noen tilfeller viser de svake signal, photobleaching og avhengig av GPCR det kan være teknisk utfordrende å sette opp8. Denne romanen strukturelle komplementering analysen bruker lavt uttrykk promoter vektorer for å etterligne endogene fysiologiske nivåer og gir høy følsomhet i forhold til dagens metoder9. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var det mulig å enkelt karakterisere Galanin reseptor-β-arrestin1/2 og også β-arrestin2-clathrin interaksjoner10. Denne metodikken kan bli mye brukt til noen GPCR av spesiell interesse der β-arrestins spille en viktig fysiologisk funksjon eller deres signalering er relevant i enkelte sykdommer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Interaksjoner mellom G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) og β-arrestins er vitale prosesser med fysiologiske implikasjoner av stor betydning. Foreløpig karakterisering av romanen medikamenter mot deres interaksjon med β-arrestins og andre cytosolic proteiner er svært verdifull innen GPCR narkotika funnet spesielt under studiet av GPCR partisk agonism. Her viser vi anvendelsen av en roman strukturelle komplementering analysen for å nøyaktig overvåke reseptor-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende systemer. Denne metoden er enkel, nøyaktig og kan lett utvides til noen GPCR av interesse og også den har den fordelen at det overvinner løs interaksjoner på grunn av tilstedeværelsen av et lavt uttrykk arrangøren stede i hver vektor system. Denne strukturelle komplementering analysen gir viktige funksjoner som tillater en nøyaktig og presis overvåking av reseptor-β-arrestin interaksjoner, noe som gjør det egnet i studiet av partisk agonism av ethvert GPCR system samt GPCR c-Terminus ' fosforylering koder ' skrevet av forskjellige GPCR-kinaser (GRKs) og post-translational modifikasjoner av arrestins som stabiliserer eller destabilisere reseptoren-β-arrestin kompleks.

Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, ble interaksjoner mellom en prototypiske GPCR og to β-arrestin isoformene overvåket. Glukagon som peptid reseptor (GLP-1R) konstruksjoner ble gjort ved hjelp av primere som inneholder NheI og EcoRI enzym restriksjon nettsteder og klonet i vektorer pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] mens i tilfelle av β-arrestins, to ekstra vektorer ble brukt pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] og pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] ved hjelp av enzym restriksjon nettsteder BgIII og EcoRI i tilfelle av β-a...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-arrestin interaksjoner er et voksende felt i GPCR narkotika funnet. Nøyaktige, presise og enkle å sette opp metoder er nødvendig for å overvåke slike interaksjoner i levende systemer. Vi viser en strukturell komplementering analysen for å overvåke GPCR-β-arrestin interaksjoner i sanntid levende celler, og det kan utvides til enhver GPCR.

Overvåking GPCR-β-arrestin1/2 interaksjoner i Real time levende systemer for å akselerere Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Denne protokollen har stor innvirkning innen narkotikaoppdagelse og utvikling, spesielt i utviklingen av nye, førsteklasses legemidler med minimale bivirkninger. Den største fordelen med denne teknikken er at den kan brukes på ethvert GPCR-system, og brukes til å få nøyaktig informasjon om reseptor farmakologi i sanntid levende systemer. Implikasjonene av denne teknikken er nært knyttet til nye behandlinger, spesielt der beta-arrestiner er relevante.Disse inkluderer opiodreseptorer i smerte og dopaminreseptorer i schizofreni. Denne metoden kan være nyttig i mange medisinske vitenskapelige forskningsområder fra nevrologi til kardiopulmonal sykdom. PCR-demonstrasjon av vår metode er viktig, fordi det gir mulighet for en detaljert presentasjon av de kritiske trinnene i protokollen, som ikke ville være mulig med konvensjonell publisering.Begynn med å designe primere for å introdusere gener av interesse for pBiT vektorer. På grunn av inframe stop codon som deler multikloning området, velg minst ett av de tre stedene som en av de to unike begrensning enzymer som trengs for retningskloning. Se manuskriptet for nukleotidsekvenser for å kode linkerrester og innlemme dem i primerne.For pBiT1.1-C og pBiT2.1-C sørg for at fremover primer inneholder en ATG codon og en potent Kozak konsensus sekvens. For pBiT1.1-N og pBiT2.1-N må du kontrollere at den omvendte primeren inneholder en stoppkodon. Bruk de designede primerne til å forsterke innsettings-DNA-et til interessekonfliktens gen.Kombiner PCR-reagensene i henhold til manuskriptretninger, og sørg for å bruke en high-fidelity DNA polymerase for å minimere mutasjoner. Programmer termocycleren og start reaksjonen. Etter å ha fullført PCR, fordøye produktet i en 50-mikroliter fordøyelsesreaksjon.I et 1,5-milliliter rør kombinerer du 12 mikroliter destillert vann, fem mikroliter av riktig 10X begrensningsfordøyelsesbuffer og 30 mikroliter av PCR-produktet. Tilsett deretter 1,5 mikroliter av hvert begrensningsenzym. Vortex reaksjonsblandingen.Og inkuber over natten på 37,5 grader Celsius. Forbered en ny reaksjon for å fordøye mottakeren plasmid. I et 1,5-milliliter rør kombinerer du 23 mikroliter vann, fem mikroliter av riktig 10X begrensningsfordøyelsesbuffer, 15 mikroliter av mottakerens plasmid og 1,5 mikroliter av hvert restriksjonsenzym.Bland røret kort. Og inkuber over natten på 37,5 grader Celsius. Dagen etter kloning og transformasjon, plukke tre til 10 individuelle bakterielle kolonier og overføre dem til en milliliter LB medium med ampicillin.Inkuber cellene i seks timer. Og deretter overføre 200 mikroliter bakteriell suspensjon til fem milliliter frisk LB medium med ampicillin. Inkuber kulturen på 37,5 grader Celsius med risting på 200 rpm over natten.På neste dag isolere plasmid med en mini-prep DNA rensing kit. Screen renset plasmid for vellykket ligation med PCR. En dag før transfection, frø cellene på en poly-L-lysin belagt 96-brønns plate ved hjelp av Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplert med 10% fosterbovin serum, 100 enheter per milliliter penicillin G, og 100 mikroliter per milliliter streptomycin.Legg bare celler til de 60 indre brønnene for å minimere potensialet for termiske gradienter over platen og kanteffekter fra fordampning. Tilsett 200 mikroliter sterilt destillert vann til de 36 utvendige brønnene, og 150 mikroliter i mellomrommene mellom brønnene. Deretter inkubere platen over natten ved 37,5 grader Celsius og 5% karbondioksid.På neste dag, utføre transfection ved hjelp av totalt 100 nanograms DNA. Sett opp fire forskjellige plasmidkombinasjoner i henhold til manuskriptretninger. Ved hjelp av 20 mikroliter modifisert Eagle minimum essensielle medier bufret med HEPES, og 0,3 mikroliter av lipidiske transfection reagens per brønn.Tilsett 20 mikroliter lipidisk transfiseringsreagens og DNA-blanding til hver brønn, og bland platen i sirkler i 10 sekunder. Inkuber platen ved 37,5 grader Celsius og 5% karbondioksid i seks timer. Oppdater mediet.Og inkuber i ytterligere 24 timer. Etter inkubasjonen, aspirere mediet og legge til 100 mikroliter av modifisert Eagle minimum essensielle medier bufret med HEPES til hver brønn. La platen stabilisere seg ved romtemperatur i 10 minutter.I mellomtiden forbereder du furimazinsubstratet ved å kombinere ett volum av 100X-substratet med 19 volumer LCS-fortynningsbuffer, og skaper en 5X-lager for å blande seg med cellekulturmediet. Når cellene er klare, legg til 25 mikroliter av aksjen til hver brønn, og bland platen forsiktig i 10 sekunder. Mål deretter lysstyrken i 10 minutter ved romtemperatur for signalstabilisering.For eksperimenter med ligand tillegg, forberede 13.5X ligand løsning i modifisert Eagle minimum essensielle medier bufret med HEPES, og legge til 10 mikroliter per brønn ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland deretter platen for hånd eller med en orbital shaker. Denne protokollen har blitt brukt til å studere interaksjoner mellom en prototypisk GPCR og to beta-arrestin isoformer.Fire forskjellige plasmidkombinasjoner ble vist, og den med det høyeste selvlysende signalet ble valgt for videre eksperimenter. EC50-verdiene for hver beta-arresti isoform ble bestemt ved hjelp av doseresponskurver, som ble oppnådd fra maksimal respons fra hver konsentrasjon fra kinetiske studier. Det er viktig å være spesielt oppmerksom når du utformer PCR-primere.Utviklingen av de riktige konstruksjonene er avgjørende for suksessen til disse analysene. Etter denne metodikken vil du kunne overvåke reseptor-beta-arrestin interaksjoner, samt reseptor interaksjoner med andre cytosoliske proteiner. Denne metodikken vil bidra til å svare på grunnleggende spørsmål innen GPCR-farmakologi ved å studere hvordan GPCR-beta-arrestin interaksjoner kan moduleres ved endringer i ligand strukturen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing av DNA-fragmenter i sanntid etter Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Sanntid observasjon av DNA Strand Exchange reaksjonen formidlet av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling av nukleotidbinding til intakte, funksjonelle membranproteiner i sanntid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...