Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.

1. Estrategia de diseño de primer
<ol><li>Imprimaciones de diseño para introducir genes de interés en pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectores.</li>
	<li>Seleccione al menos uno de estos tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional debido a la presencia de un codón de parada en trama que divide el sitio de multicloning como se muestra en la Figura 111.<...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR--arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor---arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscent...

Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.
Se ha documentado que la señalización dependiente de la arrestina desempeña un papel clave en los trastornos neurológicos como el trastorno bipolar, la depresión mayor y la esquizofrenia6 y también los efectos secundarios graves en algunos medicamentos como la morfina7.
Los métodos actuales utilizados para monitorear estas interacciones generalmente no representan los niveles endógenos reales de las proteínas en estudio, en algunos casos muestran señal débil, fotoblanqueo y dependiendo del GPCR podría ser técnicamente difícil configurar8. Este novedoso ensayo de complementación estructural utiliza vectores promotores de baja expresiónpara imitar los niveles fisiológicos endógenos y proporciona una alta sensibilidad en comparación con los métodos actuales 9. Usando este enfoque, fue posible caracterizar fácilmente las interacciones de Galanin receptor---arrestin1/2 y también de la arlatina10. Esta metodología puede ser ampliamente utilizada para cualquier GPCR de particular interés donde las arrestinas juegan una función fisiológica clave o su señalización es relevante en algunas enfermedades.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores--arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la "fosforilación" de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos' escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.

Mediante el procedimiento que se presenta aquí, se supervisaron las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas de arrestina. Las construcciones de glucagón como el receptor de péptidos (GLP-1r) se hicieron utilizando imprimaciones que contenían sitios de restricción de enzimas NheI y EcoRI y se clonaron en los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBi...

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Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.

Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Este protocolo tiene un alto impacto en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos, especialmente en el desarrollo de nuevos fármacos de primera clase con efectos secundarios mínimos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier sistema GPCR, y se utiliza para obtener información precisa sobre la farmacología de los receptores en sistemas de vida en tiempo real. Las implicaciones de esta técnica están estrechamente relacionadas con nuevas terapias, especialmente cuando las beta-arrestinas son relevantes.Estos incluyen receptores opioados en el dolor y receptores de dopamina en la esquizofrenia. Este método puede ser útil en muchas áreas de investigación científica médica desde la neurología hasta la enfermedad cardiopulmonar. La demostración PCR de nuestro método es importante, ya que permite una presentación detallada de los pasos críticos en el protocolo, que no serían posibles con la publicación convencional.Comience diseñando imprimaciones para introducir genes de interés para los vectores pBiT. Debido al codón de parada en estructura que divide el sitio de clonación múltiple, seleccione al menos uno de los tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional. Consulte el manuscrito para ver las secuencias de nucleótidos para codificar los residuos del vinculador e incorporarlos a las imprimaciones.Para el pBiT1.1-C y pBiT2.1-C asegúrese de que la imprimación delantera contiene un codón ATG y una potente secuencia de consenso Kozak. Para el pBiT1.1-N y pBiT2.1-N asegúrese de que la imprimación inversa contiene un codón de parada. Utilice las imprimaciones diseñadas para amplificar el ADN de inserción del gen de interés.Combine los reactivos PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, asegurándose de utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad para minimizar las mutaciones. Programe el termociclador e inicie la reacción. Después de completar la PCR, digiere el producto en una reacción de digestión de 50 microlitros.En un tubo de 1,5 mililitros, combine 12 microlitros de agua destilada, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado y 30 microlitros del producto PCR. A continuación, agregue 1,5 microlitros de cada enzima de restricción. Vórtice la mezcla de reacción.Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Preparar una segunda reacción para digerir el plásmido receptor. En un tubo de 1,5 mililitros, combine 23 microlitros de agua, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado, 15 microlitros del plásmido receptor y 1,5 microlitros de cada enzima de restricción.Mezcle brevemente el tubo. Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Al día siguiente de la clonación y transformación, elija de tres a 10 colonias bacterianas individuales y transfieralas a un mililitro de medio LB con ampicilina.Incubar las células durante seis horas. Y luego transferir 200 microlitros de suspensión bacteriana a cinco mililitros de nuevo LB medio con ampicilina. Incubar el cultivo a 37,5 grados centígrados con temblores a 200 rpm durante la noche.Al día siguiente, aísle el plásmido con un kit de purificación de ADN de mini-prep. A prueba el plásmido purificado para una ligadura exitosa con PCR. Un día antes de la transfección, sembrar las células en una placa de 96 pocillos recubierta de poli-L-lisina usando el medio modificado de eagle de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina G y 100 microlitros por mililitro de estreptomicina.Sólo agregue células a los 60 pozos interiores para minimizar el potencial de gradientes térmicos a través de la placa y los efectos de borde de la evaporación. Añadir 200 microlitros de agua destilada estéril a los 36 pozos exteriores, y 150 microlitros en los espacios entre los pozos. Luego incubar la placa durante la noche a 37,5 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, realice la transfección utilizando un total de 100 nanogramos de ADN. Configure cuatro combinaciones diferentes de plásmido según las instrucciones del manuscrito. Usando 20 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES, y 0,3 microlitros de reactivo de transfección lipídica por pozo.Añadir 20 microlitros de reactivo de transfección lipídica y mezcla de ADN a cada pocólite, y mezclar la placa en círculos durante 10 segundos. Incubar la placa a 37,5 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Actualice el medio.Y incubar otras 24 horas. Después de la incubación, aspirar el medio y añadir 100 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES a cada pocóteo. Deje que la placa se estabilice a temperatura ambiente durante 10 minutos.Mientras tanto, preparar el sustrato de furimazina combinando un volumen del sustrato 100X con 19 volúmenes de tampón de dilución LCS, creando un stock 5X para mezclar con el medio de cultivo celular. Cuando las células estén listas, agregue 25 microlitros del caldo a cada pozo y mezcle suavemente la placa durante 10 segundos. A continuación, mida la luminiscencia durante 10 minutos a temperatura ambiente para la estabilización de la señal.Para experimentos con la adición de ligandos, prepare la solución de ligando 13.5X en medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES, y agregue 10 microlitros por pozo usando una pipeta multicanal. A continuación, mezcle la placa a mano o con un agitador orbital. Este protocolo se ha utilizado con éxito para estudiar las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas beta-arrestin.Se proyectaron cuatro combinaciones diferentes de plásmido, y la que tenía la señal luminiscente más alta fue seleccionada para otros experimentos. Los valores EC50 para cada isoforma beta-arrestin se determinaron utilizando curvas de dosis-respuesta, que se obtuvieron de la respuesta máxima de cada concentración de estudios cinéticos. Es fundamental prestar especial atención al diseñar las imprimaciones PCR.El desarrollo de las construcciones adecuadas es esencial para el éxito de estos ensayos. Siguiendo esta metodología, usted será capaz de monitorear las interacciones receptor-beta-arrestin, así como las interacciones de los receptores con otras proteínas citosólicas. Esta metodología ayudará a responder preguntas fundamentales en el campo de la farmacología GPCR mediante el estudio de cómo las interacciones GPCR-beta-arrestin pueden ser moduladas por modificaciones en la estructura del ligando.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparación y<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de una sonda basada en la actividad de<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Ácido amidasa

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Investigación

Bioquímica

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