Name: monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Bu çalışma, bilim, BIT ve gelecekteki Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) araştırma programı (NRF-2015M3A9E7029172) tarafından hibe tarafından destekleniyordu.

1. Primer tasarım stratejisi
<ol><li>Pbit 1.1-c [TK/lgbit], pbit 2.1-c [TK/smbit], pbit 1.1-n [TK/lgbit] ve pbit 2.1-n [TK/smbit] vektörler içine ilgi genler tanıtmak için tasarım astarlar.</li>
	<li>Şekil 111' de gösterildiği gibi multicloning siteyi böler bir çerçeve içi stop kodon varlığı nedeniyle yönlü klonlama için gereken iki benzersiz kısıtlama enzimleri biri olarak bu üç siteden en az birini seçin.</li>
	<li>Tablo 2<...

<ol>
	<li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPCRs+as+targets+for+approved+drugs:+How+many+targets+and+how+many+drugs?.">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?.</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schi&#246;th, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pharmacology+of+GPCRs.">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li><li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors.">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li><li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking.">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li><li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+&#946;-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice.">Effects of &#946;-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li><li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects.">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li><li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+signalling:+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors.">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li><li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+signatures+in+&#946;-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor.">Conformational signatures in &#946;-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li><li>Promega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).</li><li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).</li><li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ligation Calculator. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cosmo Genetech. , (2019).</li><li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+incretins:+GLP-1+and+GIP.">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li><li>ProMega. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).</li><li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences.">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li></ol>

Burada sunulan yöntemi kullanarak, herhangi bir GPCR ve β-arrestin1/2 arasındaki etkileşimler bu GPCR-β-tutucu yapısal tamamlayıcı tahlil kullanarak gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde izlenebilir. Bu bağlamda, GLP-1R (prototip Sınıf B GPCR) tarafından iki β-tutucu isoform arasında diferansiyel β-tutucu işe alma izlenmesini başardık, biz de maksimum ulaştıktan sonra birkaç dakika reseptör-β-tutucu kompleksi bir ayrışma gözlenen Işıksaçan sinyal.
Yapısal tamamlay...

GPCRs piyasada mevcut ilaçların yaklaşık% 35 hedef temsil1,2 ve onların farmakolojisinin net bir anlayış yeni terapötik ilaçların gelişimi için çok önemlidir3. Özellikle önyargılı agonistlerin gelişimi sırasında GPCR uyuşturucu keşfinin önemli yönlerinden biri, yeni ligizlerin reseptör-β-tutucu etkileşimleri4 ve β-tutucu diğer sitosolik proteinlerle etkileşimlerine doğru karakterize edilmedir. Clathrin5olarak.
Β-tutucu bağımlı sinyalizasyon, bipolar bozukluk, büyük depresyon ve şizofreni6 gibi nörolojik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını ve morfin7gibi bazı ilaçlarda da ciddi yan etkileri olduğunu belgelenmiş.
Bu etkileşimleri izlemek için kullanılan geçerli yöntemler genellikle çalışma proteinlerinin gerçek endojen düzeylerini temsil etmez, bazı durumlarda zayıf sinyal, photobleaching ve GPCR bağlı olarak teknik olarak8kurmak zor olabilir gösterir. Bu roman yapısal uluslara tahlil endojen fizyolojik seviyeleri taklit etmek için düşük ifade Organizatör vektörler kullanır ve mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet sağlar9. Bu yaklaşımı kullanarak, kolayca galanin reseptör-β-arrestin1/2 ve β-arrestin2-Clathrin etkileşimleri karakterize etmek mümkün oldu10. Bu metodoloji, β-tutucunun önemli bir fizyolojik fonksiyon çalabileceği veya sinyallerinin bazı hastalıklarda ilgili olduğu belirli bir ilgi alanı için yaygın olarak kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotics penicillin streptomycin</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LS202-02</td>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial Incubator</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IB-05G</td>
			<td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM 001-05</td>
			<td>DMEM Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture transfection medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>Optimem 1X cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU5720</td>
			<td>Direct Heat CO2 Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital water bath</td>
			<td>Lab Tech</td>
			<td>LWB-122D</td>
			<td>Digital water bath lab tech</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase proof reading</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1011</td>
			<td>PfU DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA purification kit</td>
			<td>Cosmogenetech</td>
			<td>CMP0112</td>
			<td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Taq Polymerase</td>
			<td>Enzynomics</td>
			<td>P750</td>
			<td>nTaq DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144L</td>
			<td>BglII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B72045</td>
			<td>CutSmart 10X Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3101L</td>
			<td>EcoRI-HF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R01315</td>
			<td>NheI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme restriction XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146L</td>
			<td>XhoI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco Canada</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA MiniKit</td>
			<td>Real Biotech Corporation</td>
			<td>KH23108</td>
			<td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>ELPIS Biotech</td>
			<td>EBT-1025</td>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53SF</td>
			<td>CKX53 Microscope Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipid transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Biotek/Fisher Scientific</td>
			<td>12504386</td>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2014</td>
			<td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoluciferase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2012</td>
			<td>Nano-Glo Live Cell assay system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6336000015</td>
			<td>Master cycler Nexus SX1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Trysin EDTA 10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Cell culture 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3917</td>
			<td>Assay Plate 96 well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring gpcr-&#946;-arrestin1/2 interactions in real time living systems to accelerate drug discovery

G-protein bağlantılı reseptörler (GPCRs) ve β-tutucu arasındaki etkileşimler, büyük öneme sahip fizyolojik etkileri olan hayati süreçlerden ibaret. Şu anda, yeni ilaçların β-tutucu ve diğer sitosolik proteinleri ile etkileşimlerine yönelik karakterizasyonu, özellikle GPCR önyargılı agonizmin incelenmesi sırasında GPCR uyuşturucu keşfi alanında son derece değerlidir. Burada, biz gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör-β-tutucu etkileşimleri doğru izlemek için bir roman yapısal uluslara tahlil uygulama gösterir. Bu yöntem, basit, doğru ve kolayca herhangi bir GPCR faiz uzatılabilir ve aynı zamanda her vektör sisteminde mevcut bir düşük ifade Organizatör varlığı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimlerin üstesinden avantajı vardır. Bu yapısal uluslara tahlil reseptör-β-tutucu etkileşimlerin doğru ve hassas bir şekilde izlenmesi izin temel özellikleri sağlar, herhangi bir GPCR sistemi yanı sıra GPCR c-Terminus ' fosforilasyon önyargılı agonizm çalışmada uygun hale farklı GPCR-kinazlar (GRKs) ve reseptör-β-tutucu kompleksini stabilize eden veya istikrarsızlaştıracak olan tutucu sonrası translasyonel değişikliklerle yazılmış kodlar.

Burada sunulan prosedürü kullanarak, prototip GPCR ile iki β-tutucu isoform arasındaki etkileşimler izleniyor. Peptid reseptör (GLP-1R) gibi glukagon yapıları NheI ve EcoRI enzim kısıtlama siteleri içeren astar kullanılarak yapılmıştır ve vektörler pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] içine klonlanmış β-tutucu durumunda, iki ek vektörler β-arrestin1 durumunda β-arrestin2 ve NheI ve XhoI durumunda pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ve pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] kullanarak enzim kısıtlama siteleri Bgiıı...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring GPCR-ÃŽÂ²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery at JoVE.com

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi 'nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Bu protokol, ilaç keşfi ve gelişimi alanında, özellikle de en az yan etkiye sahip yeni, birinci sınıf ilaçların geliştirilmesinde yüksek bir etkiye sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı herhangi bir GPCR sistemine uygulanabilir ve gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör farmakolojisi hakkında doğru bilgi elde etmek için kullanılır. Bu tekniğin sonuçları, özellikle beta-arrestinlerin ilgili olduğu yeni tedaviler ile yakından ilişkilidir.Bunlar arasında şizofrenide ağrı ve dopamin reseptörlerinde opiod reseptörleri sayılabilir. Bu yöntem nörolojiden kardiyopulmoner hastalığa kadar birçok tıbbi bilimsel araştırma alanında yararlı olabilir. Yöntemimizin PCR gösterimi önemlidir, çünkü geleneksel yayınla mümkün olmayan protokoldeki kritik adımların ayrıntılı bir şekilde sunulmasını sağlar.PBiT vektörlerine ilgi genleri tanıtmak için astartasararak başlayın. Çoklu klonlama alanını bölen inframe stop kodonu nedeniyle, yönlü klonlama için gerekli olan iki benzersiz kısıtlama enziminden biri olarak üç bölgeden en az birini seçin. Bağlayıcı kalıntılarını kodlamak ve astarlara dahil etmek için nükleotid dizileri için el yazmasına bakın.pBiT1.1-C ve pBiT2.1-C için ileri astar bir ATG kodonu ve güçlü bir Kozak konsensüs dizisi içerdiğinden emin olun. pBiT1.1-N ve pBiT2.1-N için ters astarın bir dur kodonu içerdiğinden emin olun. İlgi geninin kesici DNA'sını yükseltmek için tasarlanmış astarları kullanın.PCR reaktiflerini el yazması yönlere göre birleştirerek mutasyonları en aza indirmek için yüksek kaliteli DNA polimeraz kullandığınızdan emin olun. Termocycler'ı programla ve reaksiyonu başlat. PCR tamamladıktan sonra, 50 mikrolitrelik sindirim reaksiyonu ürün sindirmek.1,5 mililitrelik bir tüpte, 12 mikrolitre distile su, uygun 10X kısıtlamalı sindirim tamponunun beş mikrolitresi ve 30 mikrolitre PCR ürününü birleştirir. Sonra her bir restriksiyon enzim1.5 mikrolitre ekleyin. Girdap reaksiyon karışımı.Ve bir gecede 37.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. Alıcı plazmidsi sindirmek için ikinci bir reaksiyon hazırlayın. 1,5 mililitrelik bir tüpte, 23 mikrolitre su, uygun 10X kısıtlama lı sindirim tamponunun beş mikrolitresi, alıcı plazmidin 15 mikrolitresi ve her bir restriksiyon enziminin 1,5 mikrolitresini birleştirir.Kısaca tüpü karıştırın. Ve bir gecede 37.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. Klonlama ve dönüşümü takip eden gün, üç ila 10 ayrı bakteri kolonileri seçin ve ampisilin ile LB orta bir mililitre aktarın.Hücreleri altı saat kuluçkaya yatırın. Ve sonra 200 mikrolitre bakteriyel süspansiyonu beş mililitre taze LB ortamına ampisilin ile aktarın. Bir gecede 200 rpm sallayarak 37,5 santigrat derece kültür kuluçka.Ertesi gün, bir mini hazırlık DNA arıtma kiti ile plazmid izole. PCR ile başarılı ligasyon için saflaştırılmış plazmidi tarar. Transfeksiyondan bir gün önce, dulbecco'nun modifiye Kartal'ın orta sını kullanarak poli-L-lizin kaplı 96 kuyulu bir plaka üzerindeki hücreleri %10 fetal sığır serumu, mililitrede 100 adet penisilin G ve mililitre streptomisin başına 100 mikrolitre ile destekleyin.Buharlaşmanın plaka ve kenar etkileri boyunca termal degradelerin potansiyelini en aza indirmek için 60 iç kuyuya sadece hücreler ekleyin. 36 dış kuyuya 200 mikrolitre steril distile su ve kuyular arasındaki boşluklara 150 mikrolitre ekleyin. Sonra tabağı bir gecede 37.5 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, toplam 100 nanogram DNA kullanarak transfeksiyon gerçekleştirin. El yazması talimatlara göre dört farklı plazmid kombinasyonu ayarlayın. Modifiye Eagle minimum temel medya 20 mikrolitre kullanarak HEPES ile tamponlu, ve iyi başına lipidik transfeksiyon reaktif 0.3 mikrolitre.Her kuyuya 20 mikrolitre lipidik transfeksiyon reaktifi ve DNA karışımı ekleyin ve tabağı 10 saniye boyunca daireler halinde karıştırın. Plakayı 37.5 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle altı saat boyunca kuluçkaya yatırın. Ortamı yenileyin.Ve 24 saat daha kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, orta aspire ve her kuyuya HEPES ile tamponlanmış modifiye Eagle minimum temel medya 100 mikrolitre ekleyin. Plakanın oda sıcaklığında 10 dakika stabilize olmasını bekleyin.Bu arada, hücre kültürü ortamı ile karıştırmak için bir 5X stok oluşturarak, LCS seyreltme tampon 19 hacimli 100X substrat bir hacim birleştirerek furimazine substrat hazırlamak. Hücreler hazır olduğunda, her kuyuya 25 mikrolitre stok ekleyin ve plakayı 10 saniye boyunca hafifçe karıştırın. Daha sonra sinyal stabilizasyonu için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıldayan lığı ölçün.Ligand ilavesi ile yapılan deneyler için, 13.5X ligand çözeltisini, HEPES ile tamponlanmış modifiye Eagle'ın minimum temel ortamına hazırlayın ve çok kanallı pipet kullanarak her kuyubaşına 10 mikrolitre ekleyin. Sonra elle veya bir orbital shaker ile plaka karıştırın. Bu protokol, prototipitipik GPCR ile iki beta-arrestin izoform arasındaki etkileşimleri incelemek için başarıyla kullanılmıştır.Dört farklı plazmid kombinasyonu tarandı ve daha sonraki deneyler için en yüksek Parlak sinyale sahip olan seçilmiştir. Her beta-arrestin izoform için EC50 değerleri, kinetik çalışmalardan her konsantrasyonun maksimum yanıtı ndan elde edilen doz-yanıt eğrileri kullanılarak belirlendi. PCR astarlarını tasarlarken özel dikkat etmek önemlidir.Doğru yapılar geliştirilmesi bu tahlillerin başarısı için esastır. Bu metodolojiyi takiben, reseptör-beta-arrestin etkileşimlerini ve diğer sitosolik proteinlerile reseptör etkileşimlerini izleyebilirsiniz. Bu metodoloji, GPCR-beta-arrestin etkileşimlerinin ligand yapısındaki değişikliklerle nasıl modüle edilebildiğini inceleyerek GPCR farmakoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Rejenerasyon için gerçek zamanlı hücre Analyzer donatılmış dizilmiş altın Microelectrodes

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...